1、01 前言随着工业的发展，人类活动对环境的影响越来越大，其对土壤的污染也越来越严重。目前土壤与环境质量问题已成为当今全球共同关注的重大问题。其中重金属污染因具有隐蔽性、潜伏性、长期性、易迁移和不可逆性而尤为引人注目。目前最引起人们关注的是汞、镉、铅、铬、砷、锑，合称为重金属污染中的“六毒” 1，而镉以毒性高、滞留时间长、生物迁移性强和易被植物吸收并积累而受广泛关注，但对于锑的研究进度还是有点缓慢。重金属污染的治理方法主要包括物理方法、化学方法和生物方法 2。自 Brooks 等 1977 年首先提出重金属超累积植物(hyper accumulator)以来，超累积植物具有强烈的吸收累积重金属的
2、能力，能将所吸收的重金属元素大量迁移至植物茎叶等地上部器官中，所进行的植物修复克服了传统环境污染治理技术许多方面的弱点，表现了新的可用价值 3，具有治理效果的永久性、治理过程的原位性、治理成本的低廉性、环境美学的兼容性、后期处理的简易性、修复过程的无二次污染性、提高土壤有机质和培肥地力等优点，因此，利用超累积植物进行的植物修复已经成为土壤重金属污染研究和治理的热点 4。尽管植物修复显示了良好的应用前景，但仍然存在许多局限性，如重金属超积累植物一般生物量较小、生长缓慢，极大限制了超累积植物的修复效率 5。超累积植物根际中的微生物数量巨大，活性极强，是超累积植物根际微生态系统中最活跃的组成成分在促
3、进植物生长、提高植物生物量和土壤中重金属的生物有效性方面有着重要的作用 6。本课题研究的实际意义：从锑污染的土壤上筛选分离出的耐重金属的植物根圈促生细菌（PGPR）SUD165/26，能很好的促进植物生长，在促进植物修复效果方面有着巨大的应用潜力 7。因此，日益引起致力于植物修复方面研究和治理的人员高度关注超累积植物根际中的微生物，开发微生物超累积植物联合修复技术，已成为重金属污染土壤的植物修复研究的重要方向之一。该技术的关键是寻找合适的、与超累积植物匹配的根际微生物。微生物在修复被重金属污染的土壤方面具有独特的作用。本实验通过实验筛选分离出目标菌株，分析试验结果，从而进一步的去研究其形态学与
4、生理生化特性 8-10。并且通过研究联合修复技术的使用可以在一定程度上克服使用单一的修复手段存在的缺点，提高修复效率、降低修复成本 11。1国内外研究动态：中国工农业生产规模和乡镇城市化的快速发展，造成农田和水资源受到工业三废、农用化学品及饲料添加剂中金属的污染，土壤质量和水资源环境日趋下降。据国家环保局不完全统计，中国全国每年因重金属污染的粮食达 1.2 x106 万 kg ，造成的直接经济超过 200 亿元，受不同程度重金属污染的耕地约有 2000 万 hm2 ，约占耕地总面积的 1/5 。中国水体重金属污染问题也十分突出, 江河湖库底质的污染率高达 80.1% 。太湖底泥中Cu、Pb 、
5、Cd、Sb 含量均处于轻度污染水平；黄浦江干流表层沉积物中， Cd 超背景值 2 倍、Pb 超 1 倍 ; 苏州河中，Pb 全部超标、Cd 为 75%超标、Hg 为62.5% 超标 。此外，由于矿山开采、金属冶炼废水排放、污水灌溉等人为因素的影响，导致重金属污染物在土壤和水体中累积，产出的粮食和鱼蛋肉等受重金属污染，使得农副产品的产量和质量下降，严重威胁食用者健康 12。从目前来看，微生物修复是最具发展和应用前景的生物修复技术，人们在微生物材料、降解途径以及修复技术研发等方面取得了一定的研究进展，并展示了一些成功的修复案例 13。目前在这方面研究较多的是汞、铅、镉。Nakamura 等(199
6、9)研究了在汞污染 Mina mat 海湾的沉积物中 14，在细菌的作用下，汞的挥发率提高到 62.975.1%，该研究还表明，甲基汞从土壤中的去除率也有很大提高 15。但是随着微生物修复范畴及内涵的不断拓展，特别是针对复杂的污染土壤生态系统，每种微生物修复技术不仅要克服自身原有的不足，而且还需进一步认识和解决在修复过程中出现的新现象和新问题，如新型污染物类型的发现、新微生物资源的评价、污染物的土壤修复过程与生态/健康风险、修复技术的复合机制及高效应用等方面 16-18。因此，污染土壤的微生物修复仍面临着极大的挑战，任务十分艰巨。本人见解基于以上，本课题是具有现实可行性的，加入不同浓度的 Sb
7、3+溶液，通过微生物的耐重金属性，然后分离筛选出所需的微生物菌株，既能让我们了解更多的耐重金属的微生物，同时也为我们在微生物与植物的联合修复研究当中起到了至关重要的作用，并且让我们对未来的发展前景充满期待。同时植物修复技术适用于中、低强度的大范围污染治理，对治理现场扰动小，绿色环保，社会生态综合效益良好且易为公众所接受，尤其是治理费用比传统技术低一至几个数量级，并且对重金属污染土壤的治理成效具有永久性。因此，植2物修复概念提出后很快成为环境领域的世界性、前沿热点研究课题，普遍认为植物修复技术将成为环保领域的朝阳产业。然而，由于该项技术起步时间不长，在基础理论、修复机理及技术工艺方面，还需进行大
8、量研究 19。2 材料2.1 供试植物材料与污染土壤来源从朝阳校区试验基地采集蒌蒿根际土壤和蒌蒿植株，用无菌纸袋带回实验室分离和筛选。2.2 培养基2.2.1 培养基的配制LB 培养基牛肉膏：3g，蛋白胨 10g，NaCl 5.0g，琼脂 20g，蒸馏水1000mL。葡萄糖蛋白胨液体培养基：葡萄糖 5.0g，蛋白胨 5.0g，K 2HPO4 2.0g，蒸馏水 1000mL，pH7.0。淀粉培养基：可溶性淀粉 20g，蛋白胨 10g，牛肉膏 5g，NaCl 5g，琼脂18g，蒸馏水 1000mL，pH7.4。有氮培养基：蔗糖 10g， （NH 4） 2SO4 1.0g，K 2HP04 2.0g，
9、MgS0 47H20 0.5g，NaCl 0.1g，酵母膏 0.5g，CaCO 3 0.5g，琼脂 20g，蒸馏水1000mL，pH7.2。柠檬酸盐培养基：NH 4H2PO4 1.0g，及 K2HPO4 1.0g，NaCl 5.0g，MgS0 47H20 0.2g，柠檬酸钠 2.0g，1%溴香草酚蓝乙醇溶液 10mL，蒸馏水 1000mL，琼脂 18.0g，pH6.8。明胶培养基：蛋白胨 20.0g，NaCl 5.0g，明胶 180.0g，蒸馏水l000mL，pH7.6。蛋白胨水培养基：蛋白胨 10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水 1000ml，pH7.6.醋酸铅培养基：pH7.4 的牛肉膏
10、蛋白胨琼脂 100mL，硫代硫酸钠 0.25g，灭菌后加无菌的 10%醋酸铅水溶液 1mL。32.3 试剂葡萄糖；可溶性淀粉；蔗糖；牛肉膏；NH4H2PO4； K2HPO4；NaCl ；MgS0 47H20；柠檬酸钠；溴香草酚蓝；95%乙醇；明胶；硫代硫酸钠；醋酸铅；酒精；次氯酸钠；蛋白胨；酵母提取物；氯化钠；琼脂粉；酒石酸锑钾；盐酸；氢氧化钠；蒸馏水。2.4 实验仪器LDZM 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂） 、电子天平（上海海康电子天平） 、净化工作台（苏州华宏净化技术有限公司） 、pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司） 。3 方法3.1 锑抗性菌株的分离与纯化从朝阳校区试验基地
11、采集蒌蒿根际土壤和蒌蒿植株，用无菌纸袋带回实验室。根际土壤和蒌蒿植株经简单处理，并对所采集蒌蒿的根、茎、叶用水冲洗干净，分别称取 1g 根、茎、叶，用浓度 75%的酒精和 2.5%的次氯酸钠溶液先后消毒表面，并用无菌水浸洗数次 将表面消过毒的根、茎、叶放入无菌研钵中，加入 9mL 无菌水和无菌石英砂，充分研磨。称取根际土壤 1g，加入装有 9mL 无菌水的小三角瓶中，充分振荡混匀，采用稀释平板法分离植物根、茎、叶内生细菌和根际细菌，将悬液分别稀释涂布于 LB 固体培养基中，28条件下培养，待长出菌落后挑取单菌落划线纯化，获得根际细菌 10 株（编号为 T1- T10） ，根内生细菌 10 株（
12、编号为：G 1-G10） ，茎内生细菌 8 株（编号为：J 1-J8）和叶内生细菌 6 株（编号为：Y 1-Y6） 。转至斜面，4 条件下保藏。3.2 锑抗性菌株的筛选在 LB 培养基中添加浓度为 0ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL 和200ug/mL 的 Sb3+溶液。供试菌株用无菌牙签点接于加入不同浓度 Sb3+的培养基中，30培养 2 天，观察其能否生长及生长情况。43.3 锑抗性菌株的菌种鉴定参考细菌分类学基础 21和常见细菌系统鉴定手册 22。3.3.1 菌落形态观察LB 培养基上涂布得到单菌落，观察单菌落边缘形状、大小、隆起情况、表面形态、菌落颜色、透
13、明度等。3.3.2 菌株的生理生化试验3.3.2.1 甲基红(M.R.)试验接种供试菌株于葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，置于 30恒温培养 24h 取出，沿管壁加入 M.R.试剂 3-4 滴，观察是否变色。若培养液由原来的橘黄色变为红色则为阳性反应。3.3.2.2 乙酸甲基醇(V.P.)试验接种供试菌株于装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管中置于 30恒温培养箱培养 24h。取出培养好的试管，在培养基中加入等量的 40% NaOH，再加入等量的 a-蔡酚溶液，用力振荡，再放入 37的恒温箱中保温 15-30min，如果培养液出现红色，则为阳性反应,反之为阴性反应。3.3.2.3 糖发酵试验供试菌株分别接
14、种于碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖的发酵管，28培养48h，观察生长情况。如指示剂溴甲酚蓝(黄一紫，pH 范围 5.2 至 6.8)变黄表示产酸为阳性(+)；不变或变蓝为阴性 ()。3.3.2.4 淀粉水解试验供试菌株在淀粉培养基平板上划线，28培养 48h，在平板中倒入少量Lugols 碘液观察菌落周围是否有透明圈及透明圈的大小。3.3.2.5 过氧化氢酶试验抗性菌株有氮培养液中 28培养 24h。用接种环取一小环涂抹于已滴有 5%过氧化氢的玻片上，产生气泡者为阳性，无气泡为阴性。3.3.2.6 柠檬酸盐试验柠檬酸盐培养基调 pH 6.8，加溴香草酚蓝乙醇溶液作为指示剂。配制后培养基为黄绿色，分装
15、试管，121灭菌 20min。将供试菌株接入柠檬酸盐液体培养基中培养 4 天，若细菌分解柠檬酸盐及磷酸铵产碱，则培养基 pH 升高，由5黄绿色变为深蓝色为阳性；培养基不变色为阴性。3.3.2.7 明胶液化试验供试菌株穿刺接种于明胶培养基，28培养 25 天，如明胶液化为阳性，反之为阴性。3.3.2.8 吲哚试验将菌株接种于蛋白胨水培养基中，30培养 2 天，在培养基内加 3-4 滴乙醚，摇动数次，静置 1-3min，待乙醚上升后，延管壁徐徐加入 2 滴吲哚(对二甲基氨基苯甲醛)试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。3.3.2.9 硫化氢试验供试菌株穿刺接种于醋酸铅培养基中，37培养
16、 2 天，培养基如果变黑为阳性，反之为阴性 20。3.4 锑抗性菌株的产酸性试验供试菌株接种于有氮培养基中，在 30、120 r/min，摇床振荡培养 48h 后，用 pH 计测定培养液的 pH 值。4 结果与分析4.1 锑抗性菌株的筛选结合表 1 数据，可以看出：（J 1-J8） 、 （G 1-G10） 、 （T 1- T10）和 Y1-Y6（除Y5）在锑离子浓度为 50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL 和 200ug/mL 的培养基中都没有生长，在对照组均有生长，且长势良好，图 1 的浓度顺序依次是由上到下从左至右为 200ug/mL、150ug/mL、100ug/mL、 5
17、0ug/mL 和 0ug/mL，可以看出在对照组中，Y 5 的长势是非常的好，且菌株的圆形分布也是相当的良好，在锑离子浓度为 50ug/mL 和 100ug/mL 时，Y 5 菌的长势也是非常健康的，但是有一定的减弱了，但是当锑离子浓度为 150ug/mL 时， Y5 菌已经受到了一定的抑制，到了 200ug/mL 时，Y 5 菌基本停止生长，从此可以看出锑对菌体有一定的毒害作用，在锑离子浓度大于 200ug/mL 时完全抑制菌体的生长。由此可以看出低浓度的重金属长期胁迫会使土壤中微生物产生一定的适应性和抗性，高浓度的重金属胁迫则导致微生物种类和数量的降低，因此微生物也可以作为检测6重金属污染
18、的一种指标。表 1 不同锑离子浓度下，细菌在 LB 固体培养基中的生长情况浓度 ug/mL菌 株 0 50 100 150 200Y1-Y6（除 Y5） Y5 J1-J8 G1-G10 T1- T10 注：表示有生长，表示无生长图 1 Y5菌在不同锑离子浓度下的生长状况4.2 锑抗性菌株的形态学鉴定从表 2 可以得出的 Y5 菌株形成的菌落为原形、透明、肉红色、湿润和规则的，能够很清晰的用肉眼观察出来。7表 2 Y5 菌的形态学特征项目 菌株 Y5形状 圆形透明度 透明颜色 肉红色湿润 湿润边缘 规则4.3 锑抗性菌株的生理生化特性鉴定从表 3 可以看出：Y 5 菌株除了在甲基红、淀粉水解、吲
19、哚、蔗糖和乳糖中是呈阴性反应外，其他都呈阳性反应。结合形态学特性，可初步鉴定 Y5 为芽孢杆菌属（Bacillus） 。表 3 Y5 菌的生理生化特性项目 菌株 Y5甲基红 阴淀粉水解 阴明胶液化 阳过氧化氢酶 阳硫化氢 阳V.P. 阳柠檬酸盐 阳吲哚 阴蔗糖 阴乳糖 阴葡萄糖 阳鉴定结果 芽孢杆菌属（Bacillus）4.4 锑抗性菌株的产酸性试验从表 4 可以看出，菌株 Y5 的产酸性能比较强，查资料得知微生物对重金属8的溶解主要是通过其代谢作用产生多重低分子量的有机酸，如甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等，这些酸性成分能够促使土壤中的重金属溶解 17，由此可初步推断Y5 菌可促进土壤中锑的溶解，在
20、与植物联合修复锑污染方面能够起到一定的作用。表 4 Y5 菌对有氮培养基 pH 值的影响5 结论由实验得出的结论是：细菌在不同锑离子浓度的培养基中培养，除 Y5 菌之外的其他菌种都不耐锑，并且 Y5 菌的产酸性也较好，但在实验中发现，当 Sb3+浓度为 150ug/mL 时 Y5 菌也受到了一定的抑制，当浓度超过 200ug/mL 其生长完全受到抑制，最终筛选得到了目标菌种 Y5 菌。另外通过研究其形态学和生理生化特性，可初步鉴定出 Y5 细菌为芽孢杆菌属，通过产酸性试验得出 Y5 菌具有一定的产酸性，由此可初步推断出 Y5 菌在与植物联合修复中能够起到一定的作用。参考文献：1 陈文清, 侯伶
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