1、“YH16-HAP-As2O3”复合纳米探针的表面修饰、制备及其在结肠癌细胞防转移过程中的应用郭明德 11208114 杨文清 11208120摘要：结肠癌作为全世界第三大恶性肿瘤，随着人们生活条件的越加完善，其在人群中的病发率也越来越高，相对于传统的治疗手段，随着技术的一天天进步，新型的纳米探针靶向治疗更加的显现出它的优越性。YH-16 具有防止结肠癌细胞转移的功能，HAP 具有抑制结肠癌细胞生长的功能，而 As2O3具有促进结肠癌细胞的凋亡的功能，本文通过对三种分子进行表面修饰，从而制备出 HAP-YH-16 纳米分子，As 2O3-OA, As2O3-PAA,和最后的 Ca10(PO4)
2、6(OH)910-n0 -（n）COOPAA 复合纳米材料，最终以 HAP 为载体，以血管内皮细胞为位点，使复合探针进入机体后靶向作用于结肠癌细胞，发挥作用。关键词：结肠癌、YH-16、HAP、As 2O3、As 2O3-OA、As 2O3-PAA、Ca 10(PO4)6(OH)910-n0 -（n）COOPAA 复合纳米材料、血管内皮细胞一、前沿：结肠癌作为大肠癌的一种，是全世界第三大常见的恶性肿瘤 ，全世界男性结肠癌发病率最高者是夏威夷的日本人(37.15/10 万)，女性最高者是新西兰人(30.46/10 万)；发展中国家的发病例数在世界范围内尚不足 1/3，以印度及非洲的发病率最低，与
3、发达国家相比其发病率相差 10 倍。在欧洲，2002 年就有超过 37 万人发生该病，占全部癌症的 12%，死亡人数大约为 20 万人。在中国，结肠癌发病率目前虽然还位列第五号肿瘤，但增长的速度却非常快，尤其是在一些大城市。这与生活水平提高、饮食结构发生改变密切相关。与上世纪 90 年代与 70 年代比，上海市男性结肠癌增加 104%，女性增加 99%，平均每年增加 4%左右，其它大城市也基本如此。从全世界范围看，中国是结肠癌发病率比较低的地区，目前在中国是第五常见的恶性肿瘤，但结肠癌发病率呈上升趋势，在大城市增幅更快。以上海市为例，1993 年至 1994 年与 1972 年至 1974 年
4、比较，男性结肠癌增加 104%，女性结肠癌增加 99%，每年增长 4%左右；在北京地区，1982 年至 1997 年 15 年间，结肠癌男性标化发病率分别上升 53.30%、23.8%，女性分别上升16.9%、15.3%。1999 年，中国男女结肠癌发病率分别为 16.2/10 万及 14.5/10万。总之，上世纪 90 年代与 70 年代相比，结肠癌的发病率在城市上升31.95%，在农村上升 8.51%。在中国，大肠癌死亡率变化较大。在我国试点地区的调查显示，男性大肠癌死亡率居全部恶性肿瘤第五位(上海市为第四位);北京市女性为第二位，上海市女性为第三位，天津市与武汉市的女性为第四位，哈尔滨市
5、的女性为第五位。农村试点地区的大肠癌死亡率大多居于第五位。二、发病机理：结肠癌是发生于结肠部位的常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第 3 位。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处。从流行病学的观点看，结肠癌的发病和环境、生活习惯、尤其是饮食方式有关。引发其病变的诱因大约可分为以下三种：（1） 饱和脂肪酸的饮食可增加结肠中胆汁酸与中性固醇的浓度，并改变大肠菌群的组成。胆汁酸经细菌作用可生成 3-甲基胆蒽等致癌物质，固醇环也可经细菌作用被芳香化而形成致癌物质。食物纤维包括纤维素、果胶、半纤维素、木质素等，吸收水分，增加粪便量，稀释肠内残留物浓度，能够缩短粪便通过大肠的时间而减少致癌物质与肠粘膜接
6、触的时间，膳食纤维不足是结肠癌的发病因素之一。（2） 由慢性大肠炎症引发而来，如溃疡性结肠炎的肠癌发生率高于一般人群，炎症的增生性病变的发展过程中，常可形成息肉，进一步发展为肠癌;克隆氏病时，有结肠、直肠受累者可引起癌变。以慢性血吸虫病患者为例：肠壁血吸虫卵沉积与毒素刺激 大肠粘膜慢性溃疡 炎性息肉 引起癌变（3） 遗传因素，近几年来，有报告结肠癌阳性家族者，其发病率是一般人群的四倍，说明遗传因素可能参与结肠癌的发病。有资料表明，世界结肠癌高发人群为白人，其次为黑人，亚洲人及美国印第安人发病率最低，故有人提出出结肠癌的发病率高低与人类的种族有关。三、现在的各种治疗方案及优缺点：治疗方案 优缺点
7、手术切除 对接受者的身体伤害大，手术后癌症复发和转移率高，且对于某些特殊的肿瘤局部侵润广泛，或与周围组织、脏器固定，则不能进行手术切除。放疗 对接受者的正常细胞伤害大，且对于严重消瘦、贫血患者，经治疗不能缓解的严重心、肾功能不全者，严重感染或脓毒血症者，白细胞数低于 3109/L，血小板低于 80109/L，血红蛋白低于 80g/L 患者，则不能进行放疗。化疗 对接受者正常细胞伤害很大，对人身体毒性很大，可以说是饮鸩止渴的一种方法。中医治疗 分为中成药、辩证施治，食疗等方法，然而其治疗周期长，在有效的时间内治疗效果不明显。 生物治疗 通过分子靶向治疗，在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点（
8、该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段），来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞四、针对治疗过程中的难点，本纳米探针的设计思路：到目前为止，对于结肠癌的治疗手段可谓千差万别，可无论是手术切除，放疗，化疗等等，归根结底在于杀死癌细胞方面，然而目前的方法只局限对癌细胞的杀死层次，而不能防止结肠癌细胞的转移。故而转移成为了结肠癌治疗过程中的一大难点。结肠癌细胞的转移可分为：器官转移、淋巴转移、血行转移、侵润与种植。立足于防止结肠癌细胞的转移和杀死两方面，本次研究从生物治疗的角度，通过将三种纳
9、米颗粒，YH-16、HAP、As 2O3通过表面修饰进行偶联，并利用 HAP的良好的生物相容性将其作为载体，使得“防止结肠癌细胞转移”、“抑制结肠癌细胞的生长”“促进结肠癌细胞的凋亡”三个作用联合起来，效果或者不是 1+1=2 这么简单，最后以血管内皮细胞为位点，从而进入机体后靶向作用于结肠癌细胞，发挥作用。五、三种纳米分子的选择：(1)YH-16 的选择：肿瘤生长经历两个阶段：血管前期和血管期。在肿瘤血管前期，肿瘤细胞主要依赖弥散作用获取营养，当肿瘤生长至1-2mm 3、细胞数达到10 7左右时，其继续生长就必须要由新生血管来提供足够的氧气及营养物质。肿瘤新生血管不但为肿瘤生长提供氧气和营养
10、、带走代谢产物，而且还通过旁分泌作用分泌促肿瘤生长因子，从而促使肿瘤生长加快。肿瘤细胞分泌的VEGF、碱性成纤维细胞生长因子等促血管生长因子亦可促进肿瘤血管内皮细胞增殖。同时，肿瘤细胞还可通过新生血管向周围组织浸润和远处转移，在继发部位形成转移灶，而转移灶的继续生长和转移仍然需要新生血管，且新生血管对转移灶的形成比原发灶更为重要。因此可通过干扰或阻断肿瘤新生血管形成而达到治疗和控制肿瘤细胞转移的目的。YH-16是一种胶原,C端20ku的连接蛋白,一种可在大肠杆菌体内高效表达的重组人血管内皮抑制素,主要靶点为血管内皮细胞。研究结果示，YH-16对CT26细胞的IC 50是ED25细胞的3.38倍
11、，表明YH-16主要针对的是血管内皮细胞,而不是癌细胞,其对脾脏肿瘤抑制作用不强的原因可能也在于此.针对肿瘤血管内皮细胞的治疗具有广阔的前景,其优势为:内皮细胞属正常细胞,不象肿瘤细胞那样容易变异,所以不易耐药；所有肿瘤细胞的血管内皮细胞均相同或相似，抗血管治疗可针对所有实体瘤；血管内皮细胞暴露于血流中，药物易于达到靶细胞；选择性作用于血管内皮细胞，全身毒性小。YH-16并未降低肝转移瘤VEGF的表达,MVD却明显降低.其作用机理可能是YH-16主要通过抑制血管内皮细胞来抑制肿瘤生长，从而使MVD降低。有研究显示，内皮抑素和血管内皮细胞结合后可促进血管内皮细胞的凋亡，内皮抑素还可作为配体与粘附
12、分子中的整合素家族成员相结合，从而抑制整合素介导的血管内皮细胞迁移。（2）HAP的选择：刘志苏、唐胜利、艾中立、胡军（中华实验外科杂志2006年3月第23卷第3期）等通过用羟基磷灰石纳米粒子以不同终浓度作用于结肠癌细胞SW-480，用噻唑蓝比色法观察其对两株细胞的生长抑制，荧光显微镜、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术等方法从细胞凋亡的角度探讨其作用机制。研究发现羟基磷灰石纳米粒子对SW-480细胞的半数有效抑制浓度值为3666 mgL。50100 mgL的纳米粒子处理48 h后，癌细胞即可表现出细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂以及凋亡小体形成等凋亡特征性形态改变，作用48 h后，琼脂糖凝胶
13、电泳观察到DNA“梯带”。流式细胞仪定量分析显示结肠癌细胞经0、50、100、200 mgL作用48 h后的细胞凋亡率为357、2145、3710、4945。结论羟基磷灰石纳米粒子对人肝癌BEL-7402和结肠癌SW-480细胞有明显的生长抑制作用，诱导癌细胞凋亡可能是其主要作用机制。另外羟基磷灰石是一种常见的生物材料，具有良好的生物相容性，对人体无毒副作用，常用于骨移植等研究，而今年来羟基磷灰石纳米作为药物载体更是被人们广为使用。（3）As 2O3的选择：魏晓莹，张建明，郑洁，张东生等（临床与实验病理学杂志三氧化二砷诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡的细胞生物学研究）通过选用不同剂量A 处理LoV
14、o细胞后，通过光镜、电镜、MTT法、AOEB荧光染色法和流式细胞术研究As2O3对LOV0细胞生长的影响。结果发现：As 2O3具有抑制LoV0细胞生长和其凋亡的作用，这种作用主要在低浓度下产生，而在高浓度时可引起细胞死亡。得出As2O3具有抑制LoVo细胞生长的作用，并诱导细胞凋亡的作用。六、三种纳米粒子的表面修饰及交联过程设计：（1）HAP与YH-16的连接：连接方法分为两种：一种是采用吸附法制备HAP-YH-16纳米粒子，但由于，但由于YH-16主要吸附在HAP表面，所以存在一定的突释效应，所以本设计方案里面不采纳。另一种方法是利用用原位合成方法一步合成了HAP一YH-16复合物，即在合
15、成HAP的同时，将YH-16包裹在HAP内部网格中，有效地降低了突释效应。本设计方案中采用第二种方法。具体步骤为：1、称取一定量的YH-16，放在NH 4H2PO4溶液中缓慢搅拌至完全溶解；2、将Ca(CH 3COO)2溶液逐滴加入到NH 4H2PO4溶液中，于37 ，pH=7.4条件下缓慢搅拌1 h，反应液于4下离心18 min(10000 rmin)，将沉淀在25干燥48 h，于4保存（2）As 2O3与HAP与YH-16复合纳米粒子的连接：其具体的方程式为：1、As 2O3+油酸As 2O3-OA（反应在高温下进行）2、As 2O3-OA+PAAAs 2O3-PAA（反应在高温下进行）3
16、、Ca 10(PO4)6(OH)2+H2OCa 10(PO4)6(OH)10(反应在极高温下进行)4、Ca 10(PO4)6(OH)10+ （n）As 2O3-PAACa 10(PO4)6(OH)910-n0 -（n）COOPAA(其中4n6)七、总结：YH-16 具有防止结肠癌细胞转移的功能，HAP 具有抑制结肠癌细胞生长的功能，而 As2O3具有促进结肠癌细胞的凋亡的功能，本研究通过纳米粒子间的表面修饰，将三者结合起来，其效果可能不是 1+1=2 这么简单，是的通一个纳米探针同时具备了抑制转移，抑制生长，促进凋亡三种功能，最后以其中组成部分之一的羟基磷灰石纳米为载体，以血管内皮细胞为靶向位
17、点，制备了新型复合纳米探针，从而能大大提高了纳米探针在治疗中的效果。本文对纳米对结肠癌治疗中如何提高纳米粒子的效果以及如何将几种不同功能纳米粒子相连接起来提供了一种很好的途径和思想。八、参考文献：1、魏晓莹，张建明，郑洁，张东生临床与实验病理学杂志 三氧化二砷诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡的细胞生物学研究 2、刘志苏、唐胜利、艾中立、胡军中华实验外科杂志2006年3月第23卷第3期3、羟基磷灰石一SOD纳米复合物的合成与性能 吴丽艳、王悦怡、杨东生、孟庆繁、滕利荣、高波，(吉林大学生命科学学院，长春130012；吉林大学珠海学院化学与药学系，珠海519041)4、殷钢、詹劲、刘铮、袁乃驹，高等学
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