1、PCR 的一般流程（以 Taq DNA 聚合酶为例）一、 试剂和仪器1、仪器：PCR 仪、移液器、离心管和枪头（121灭菌 20min，烘干） 、冰盒、板架、离心机。2.ddH2O：三蒸水 121灭菌 20min，4保存；3.Buffer：含 Mg2+，10，-20保存；4.dNTP：保存液为 25mM，使用前用 ddH2O 稀释为2.5mM 并分装，避免污染，-20保存。5.引物：引物干粉在溶解前先 12,000rpm 离心2min，再用 ddH2O 溶解至 10M，涡旋震荡使其充分溶解，-20保存；6.模板。7.Taq DNA 聚合酶：-20保存。二、 实验准备1.预订 PCR 仪，填写好
2、使用时间；2.制冰；3.将所需试剂解冻、混匀、瞬离，置于冰上，模板要放在冰上解冻。三、 步骤：1.设计实验，认真阅读相关试剂说明书。2.将离心管置于冰上，按照如下体系加入样品。加样顺序为：ddH 2OBuffer/dNTP/引物/模板。Taq DNA 聚合酶反应体系（25L）试剂 用量（L）ddH2O 18.375LBuffer （Mg 2+，10） 2.5LdNTP（2.5mM） 2L引物（正向和反向，10M）各 0.5L模板 DNA 102105copiesTaq DNA 聚合酶* 0.125L* 注意：加酶之前将酶拿出放冰上，使用完立即放回冰箱。3.在离心管盖上写好每个样品的编号，瞬离。
3、4.设置好 PCR 程序，待反应温度达到实验需要时，将样品放入 PCR 仪，尽量放在中央的孔。5.将试剂放回原处，移液器调回最大量程，整理实验台。6.反应结束后，及时停止 PCR 程序（不要停在 4太久） ，取出样品，关好 PCR 仪。四、 其它注意事项：1.正确使用移液器、离心机和 PCR 仪；2.手或移液器不要接触反应管或试剂瓶、管的内壁、盖内侧；3.不使用枪头时，盖好枪头盒盖；4.枪头只能使用一次；5.合理设计实验，使用适当的阴性对照很重要，如：使用不加 DNA 的材料进行 PCR 扩增，以证明缓冲液或其他试剂中是否存在任何可影响 PCR 的污染物；6.如果一次实验需做多管样品，尽量先配
4、制 mix，由于存在液体混合后的体积变化和挂液，计算 mix 用量要比实际管数多一些；7.反应在 PCR 仪进行期间，最好能检查一下程序是否在正常运行，及时发现异常。3.2 移液器的使用方法1.调节量程：轻轻旋转量程调节圈，注意不要超过量程。建议从高到低调节量程，必要时，可旋转量程调节圈稍超过所需数值，再向回旋转，移液可以更准确。2.装配枪头：轻轻按压，将枪头盒上的枪头装配到移液器。3.吸液：按下操作键至一档（设定体积） ，将枪头垂直浸入液体约 4mm；让操作键慢慢复位，此过程中保持枪头浸入深度，防止吸入空气；将枪头慢慢移出液面，并确保枪头外壁无残留液体。 （建议每个新枪头先经过一到三次的吸液
5、和放液来润湿，有助于提高移液准确度。吸取大体积液体时，将枪头保持浸入状态约 3 秒钟，再移液。 ）A B图 3.2.1 移液器的吸液（A）和放液（B）4.放液：将枪头倾斜地紧贴管壁，将操作键慢慢按向一档（设定体积） ，等待，直到不再有液体流出；将操作键按向二档（吹液） ，将枪头完全排空；仍然按住操作键，在管壁上擦拭枪头；在管外，慢慢让操作键复位；按下脱卸键卸掉枪头。5.其它注意事项：（1）轻拿轻放，使用后调回最大量程；（2）保持移液器洁净。（3）与水有很大物理性差异的溶液，或在移液器枪头和液体间存在很大温差的溶液，可能会导致移液不准，要注意检查移液体积。3.3 PCR 反应原理及过程3.3.1
6、 反应原理PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，是利用 DNA在体外摄氏 95高温时变性会变成单链，低温（经常是60C 左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至 DNA 聚合酶最适反应温度（72C 左右），DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链（图3.3.1）。基于聚合酶制造的 PCR 仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。3.5.2 反应过程PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成（图3.3.2）：模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 95左右一定
7、时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火（复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24 分钟，23 小时就能将待扩目的基
8、因扩增放大几百万倍。图 3.3.1 PCR 反应原理图 3.3.2 PCR 的基本步骤3.4 几种常用 PCR 方法3.4.1 标准 PCR（Standard PCR）该方法适用于扩增小于 3000bp 的 DNA 序列。建议体系：Reaction Volume 100LTaq Polymerase 2-2.5UPrimers 0.1-1.0M eachdNTP 0.2mM eachSalt 6-50mM KCl or (NH4)2SO4Mg2+ 1.5-5.0mM MgCl2 or MgSO4Buffer Tris-HCl 10-50mM, pH 7.5-9.0Template 102-10
9、5copies3.4.2 长范围 PCR（Long and Accurate PCR，LA PCR）使用混合的聚合酶（含有一种能校对的聚合酶）能够增加可扩增产物的大小（5kb 40kb） ，因为能去掉错误掺入的核苷酸，而不引起链的终止。Reaction Volume 33LPolymerase Klentaq 1 (a) plus 1/16 Pfu or 1/50 Deep Vent (by volume; 1/160 or 1/500 by units)Salt 16mM (NH4)2SO4, no KClMg2+ 3.5mM MgCl2pH 9.2Buffer 50mM TrisTempl
10、ate 2ng lambda DNACycles 20Extension Temp 68Extension Time 11-24min (longer at later cycles)3.4.3 热启动 PCR（Hot Start PCR）热启动 PCR 是提高产量和特异性的一种简单方法，但也可能会造成重复性和污染等问题。室温下加样，可能会导致引物和模板的非特异性结合。在 PCR 的最初几个循环里，通过变性可以防止这些非特异性结合产物的延伸。热启动 PCR 则通过控制一种 PCR 成分的加样时间，来提高扩增的特异性。通常，直到反应温度到达引物最适退火温度以上时，再加入这种关键成分，如引物、酶、
11、Mg 2+或 dNTP。热启动温度随推迟反应的方式而改变。推迟 PCR 反应有几种方式。最简单的一种是，在反应管达到第一个循环的 DNA 熔解温度之前，不要将 DNA 聚合酶加到反应管内。当处理少量样品时，这种方法可以得到令人满意的效果；但当处理大量样品时，则效果不佳。一种更方便的方法是，使一种组分在达到一个适当的温度之前处于无效状态。例如，把聚合酶或镁盐掺入到蜡珠内便可做到这一点，这些珠子在适当的温度熔化，能够使反应开始。另一种方法是，在开始时，用一种抗体与聚合酶形成复合物，使聚合酶灭活，在高温下抗体变性，能够使聚合酶发挥功能。如果在热启动 PCR 中使用修饰过的酶，则需要向典型的 PCR
12、反应中加一预热步骤，预热温度可以在92-100之间，时间为 2-20 分钟，有助于消除在较低温度时引物和模板结合形成的非特异产物。热启动 PCR 可以与其它 PCR 方法（如 touchdown PCR）结合使用。3.4.4 温度递降 PCR（Touchdown PCR）Touchdown PCR 最初用来简化确定最适退火温度的过程。最初使用一个高的退火温度（在此温度下，即使正确的结合可能也无法进行） ，在随后几轮，降低退火温度，当降到某一个温度点时，只有正确匹配的引物-模板能够退火，而不正确的匹配则不能够退火，因此 DNA 合成能够开始。尽管后来的循环可能会在不是最严谨的条件下进行，但早期的
13、循环已在最严谨的条件下进行，想要的目标产物将是最丰富的。通常，第一个循环的退火温度设置为高于理论 Tm 15，在接下来的循环里，每循环降低 1-2，直到低于 Tm 5左右。3.4.5 嵌套 PCR（巢式 PCR，Nested PCR）在这种 PCR 中，进行两次连续的 PCR。第一次 PCR 使用常规的模板，然后用第一次 PCR 反应的产物（通常要稀释适当倍数）作为第二次 PCR 的模板，将第二次 PCR 的引物设计成能够与第一次 PCR 目标产物的序列退火。虽然第一次 PCR 除了能产生目标产物外，可能还会产生一些非特异性的产物，但非特异性的产物几乎不可能也包含第二次 PCR所用引物的两个位
14、点。因此，只有第一次 PCR 的目标产物才可能是第二次 PCR 的合适模板。3.5 PCR 可变因素PCR 的各种因素相互影响，相互制约，很难同时提高PCR 的特异性、产量和保真度。3.5.1 引物（Primers）标准用量：0.1-1.0M。多数情况下，0.2-0.5M 就能满足需要。提高特异性：1、降低引物和 dNTP 的浓度可以显著提高特异性。高浓度会导致非特异结合、引物二聚体的形成。2、在适当范围内，降低引物/模板的比例。提高产量：提高引物/模板的比例。如果有过剩的引物，需要降低引物浓度。3.5.2 聚合酶（Polymerases）标准用量：1-5Units/L。 （不同供货商对“Un
15、it”的定义会有差别。 ）提高特异性：在适当范围内，降低聚合酶浓度。聚合酶浓度是决定 PCR 严格度的一个关键因素。高浓度的聚合酶不仅会降低特异性，还会造成不必要的浪费。提高保真度：使用高保真聚合酶。3.5.3 模板（Templates）标准用量：10 2-105个拷贝。反应中的模板量应当用目的序列的拷贝数来衡量。一般，降低 DNA 模板浓度，也应该降低聚合酶浓度（在合适范围内） 。提高特异性：1、增加模板量。2、降低引物/模板的比例。提高产量：1、增加引物/模板比例。2、扩增较小片段的模板 DNA，更易获得较高产量。3.5.4 dNTP（Deoxynucleoside Triphosphat
16、es）标准用量：20-200M。四种 dNTP 的浓度应当相同，并且要高于每种 dNTP 的估算 Km（10M-15M） 。提高特异性：降低 dNTP 浓度。需要注意的是，Mg 2+的浓度也要等摩尔比例地降低。提高产量：对于较长的模板序列，要适当增加 dNTP。提高保真度：降低 dNTP 浓度。3.5.5 镁离子（Magnesium ions）Mg2+浓度应当比总 dNTP 浓度多 0.5-3.0mM。提高特异性：降低浓度。注意如果 Mg2+浓度不正确会降低产量。提高产量：提高浓度。然而，Mg 2+浓度过高易导致非特异性结合和电泳 smear。3.5.6 预温育的温度和时间（Preincuba
17、tion Temperatures and Times）标准范围：92-96，30sec-10min。预温育能降低样品中有害蛋白酶和核酸酶的活性，还能保证基因组 DNA 中复杂模板完全变性。3.5.7 解链温度和时间（Melting Temperatures and Times）标准范围：68-75，30-120sec。通常将加热变性使 50%的双链 DNA 解链的温度称为 DNA的解链温度或熔解温度，用 Tm表示。影响解链温度的因素是样品的总质量和浓度。有一些方法可以计算解链温度，但只是估计，实验所需的最优温度还需要结合经验来尝试。时间方面则需要考虑 PCR 仪的升温降温过程，以及 PCR仪
18、是根据样品温度来计算时间，还是仅根据仪器孔的温度来计算时间。对于20bp 的引物，T m=62.3+0.41(%G-C)-500/length。3.5.8 退火（Annealing/Hybridization）标准范围：37-65（一般是比 Tm低 5） ，10-120sec。LA PCR 的退火时间可以估算为：60sec+(2.5sec/100bp)。提高特异性：1、提高退火温度（2-5）可以降低非特异匹配的几率。2、缩短退火时间，因为过长的退火时间通常不会提高产量，反而会增加错误匹配的几率。3.5.9 延伸（Extension/Polymerization）标准范围：72，60-120se
19、c。通常使用的 DNA 聚合酶的延伸速率是每秒 50 个核苷酸，因此如果 PCR 产物不超过 400bp，最好将延伸时间控制在15 秒以内。较长的 PCR 产物需要相应较长的延伸时间。LA PCR 延伸时间可以估算为：60sec+(2.5sec/100bp)。3.5.10 循环数（Cycles）标准范围：25-50 个循环。通常，每个 PCR 循环包括变性、退火和延伸三步。但根据聚合酶和 PCR 仪的不同，三步有时可以减至两步。在一定循环数内，PCR 产量与循环数成指数关系，但由于平台效应的存在，增加循环数不一定会提高产量和特异性。提高特异性：1、减少循环数，2、缩短循环长度。提高产量：对于较大片段（1kb） ，增加每步的持续时间。3.5.11 反应体积（Reaction Volumes）标准范围：20-100L（对于 0.5mL 离心管） 。5L 的体系也可以成功反应。大体系不易有效地加热或冷却，小体系虽然可以迅速变温，但产量太低。反应管的形状、管壁厚度以及在 PCR 仪中的摆放位置都会影响达到预定温度所需的时间。另外，有的 PCR 仪以仪器孔的温度为准，还有的 PCR 仪以样品温度为准。如果是后者，最好配合使用薄壁的、较小的反应管。提高产量：增加反应体系。如果使用较大体系，可以添加油盖来减少蒸发和内部的冷凝，一般 PCR 仪的热盖可以发挥这样的作用。
