1、第十一章 电泳技术,第十一章 电泳技术第一节 概 述,电泳的定义:电泳就是在电场作用下各种胶体颗粒的迁移.具有不同电荷密度的生物大分子将以不同的速度迁移,从而得以分离.目前广泛使用凝胶支持介质进行电泳.,电泳法可分为自由电泳(无支持体)及区带电泳(有支持体)两大类。前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳(常压及高压)、薄层电泳(薄膜及薄板)、凝胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶)等。 自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵等。而区带电泳可用各种类型的物质作支持体，其应用比较
2、广泛。本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述。,常规电泳分离技术,电泳分离的基本原理,1.1 电泳基本原理： 带电粒子的迁移-小分子，生物大分子，蛋白质，核酸，病毒颗粒，细胞器等。不同等电点的AA在电解质中所带的电荷不一样。pHpI时，蛋白质分子释放出H+，而使蛋白壳带负电，向正极方向移动。当pHpI，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。,溶液的离子强度 电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围，形成一个与运动质点符合相反的离子氛(ion
3、ic atmosphere)，离子氛不仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动。然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关。可用离子强度I表示。式中S表示溶液中离子种类，Ci和Zi分别表示每种离子的摩尔浓度与化合价。最常用I值在0.02-0.2之间。,电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗(electro-osmosis)。其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。如以滤纸作支持物时，纸上纤维
4、素吸附OH-带负电荷，与纸接触的水溶液因产生H3O+，带正电荷移向负极，若质点原来在电场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响。,电渗现象 电渗方向与样品方向一致，加快样品移动。反之相反。 颗粒泳动的表面速度与由颗粒泳动速度+电渗携带颗粒的移动速度。（V1+V2) 5 对支持物的选择：支持物均匀，吸附力小，否则,电电场不均匀，影响区带的分离。实验结果及扫描图谱均无法重复。 纸电泳所用的滤纸不均匀或吸附力过大，蛋白质在电泳过程中一部分会被滤纸所吸附，适合分离区带蛋白质含量相对量降低。6 温度
5、对电泳影响: 热对电泳影响较大；温度升高，介质粘度下降，分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移率增加，分离度降低。控制电压或电流，加强冷却装置。 7 筛孔： 筛孔大的颗粒，溶质颗粒泳动度增大，反之，则泳动速度慢。 Q=I2RT,第十一章 电泳技术第一节 概 述,经常使用的电泳:1.天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)2.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)3.等电聚焦（IEF）4.双向电泳5.免疫电泳(IE)6.蛋白质电泳7.毛细管电泳(CE),电泳技术的分类,1.按分离原理分类： 区带电泳：独立区带 移界电泳：自由界面电泳-分离效果差 等速电泳：当电泳达到平衡时，各区带随分离清晰的
6、界面，并以等速原理移动。 等电聚焦电泳-两性电解质载体形成pH梯度，按等电点分离。特点：聚成很窄的区带且分辨率很高。,2.按有无固体支持物分类：（）自由电泳：显微电泳（细胞电泳）：细菌的电泳行为，移界电泳，柱电泳（密度梯度），自由流动幕电泳，等速电泳。（）支持电泳：无阻滞支持电泳：滤纸电泳，醋酸纤维薄膜电泳，纤维素粉，淀粉，玻璃粉，聚丙烯酰胺粉末。高密度的凝胶：淀粉凝胶，聚丙烯酰胺，琼脂糖电泳或琼脂糖凝胶3. 醋酸纤维素薄膜电泳对蛋白质吸附样品极少，无拖尾现象。,第十一章 电泳技术第一节 概 述,凝胶电泳是一种杰出的分析手段.通过电泳能获得样品组分信息,能帮助估计样品的分子量和等电点及其分布.
7、蛋白质分子量的测定主要采用SDSPAGE,等电点的测定可使用等电聚焦.双向电泳是目前最有效的分析复杂蛋白质混合物的方法之一.,第十一章 电泳技术第一节 概 述,电泳优点:操作简单,设备便宜,分辨率高,易于多个样品分析,灵敏度高,易于特异检测,能给出结合图谱.,第十一章 电泳技术第一节 概 述,一.基本原理(一) 蛋白质的电荷来源电泳分离的基础是建立在蛋白质是带电颗粒.蛋白质的电荷来自于氨基酸的离子化侧链基团,包括酸性残基、碱性残基、 氨酸残基以及荷电的非蛋白质组分如脂类或碳水化合物.不同蛋白质分子由于氨基酸组成不同,所带电荷的电性和电量也不同,由此可进行蛋白质的分离和分析.,第十一章 电泳技术
8、第一节 概 述,(二) 电泳的迁移率在一定pH条件下,蛋白质分子会解离而带电,不同的带电颗粒在同一电场的运动速度不同,可用迁移率来表示:迁移率即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度(m).m=Q/6r迁移率与球形分子的半径、介质黏度 、颗粒所带电荷有关.一般来说,所带静电荷越多,颗粒越小,越接近球形,则在电场中迁移速度越快,反之越慢.,第十一章 电泳技术第一节 概 述,(三) 电渗电渗就是流动相对于固体支持介质的移动.电渗流的强度取决于凝胶的电荷密度、电压和缓冲液浓度.为消除电渗现象可选择无电渗的电泳介质.但免疫电泳,保持控制的电渗流是有益的.,第十一章 电泳技术第一节 概 述,(四) 影响电泳
9、效果的因素影响电泳速度及分辨率的内在因素是蛋白质分子本身的性质,主要是其在特定pH条件下的电性和电量,以及蛋白质分子的形状与大小.影响电泳速度的外在因素有电场强度,溶液的pH值和离子强度,电泳介质的性能以及电泳的温度等.影响电泳分辨率的主要是电泳介质,电压及冷却系统以及缓冲系统.,第十一章 电泳技术第一节 概 述,(五) 区带压缩技术由于扩散 ,分离后的蛋白质区带随时间延长将不可避免地变宽,导致分辨率降低.常用的方法有降低样品离子强度、使用堆积胶(又称浓缩胶)以及使用孔径梯度凝胶等.,第十一章 电泳技术第一节 概 述,二.凝胶介质最早的电泳是在自由溶液中进行的,但使用抗流动的支持介质能防止电泳
10、过程中的对流和扩散,使被分离组分得到最大分辨率的分离.电泳的支持介质主要分为两类:无阻滞支持物和高密度凝胶.前者包括滤纸、醋酸纤维薄膜、纤维素、硅胶等.后者包括:淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶.,第十一章 电泳技术第一节 概 述,(一)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在增速剂和催化剂的作用下聚合而成的三维网状结构的凝胶.聚丙烯酰胺凝胶可通过化学聚合和光化学聚合反应而形成凝胶.聚丙烯酰胺凝胶可作为常规PAGE、SDS- PAGE 、等电聚焦 、双向电泳及蛋白质印迹等的电泳介质.,第十一章 电泳技术第一节 概 述,(二)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶是由半乳
11、糖和3,6-脱水半乳糖交替组成的成胶多糖.琼脂糖凝胶分离效果不如聚丙烯酰胺凝胶,唯一一个使用琼脂糖具有优势的高分辨率电泳技术是等电聚焦.琼脂糖凝胶主要用于DNA分离、免疫电泳 、亲和电泳 、等电聚焦及蛋白质印迹等.,第十一章 电泳技术第一节 概 述,三.检测方法当电泳结束后,被分离的蛋白质区带仍然保持在胶内,这时可以通过染色而显示出分离图谱,从而检测样品的分离情况.常用的全蛋白质染色方法是考马斯亮蓝法和银染法（灵敏度比前者高100倍）.考马斯亮蓝法R-250使用最多,适用于蛋白质和肽进行染色.,第十一章 电泳技术第一节 概 述,四.电泳仪器常规使用的电泳仪器是凝胶电泳仪.凝胶电泳系统一般由电泳
12、槽、电源和冷却装置组成,还有一些配套装置,如灌胶模具、染色用具 、电泳转移仪、凝胶干燥器 、凝胶扫描仪等.其中电泳槽是电泳系统的核心部分.凝胶电泳按电泳仪形状分为管状电泳(又叫圆盘电泳)和平板电泳,平板电泳又分为垂直平板电泳和水平平板电泳.,第二节聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE),2.1 PAGE与淀粉类凝胶电泳的异同点1. PAG是人工合成多聚肽，调节单体浓度和交联剂的比例就能得到孔径不同，范围广泛的凝胶物质，而且重复性好。. 机械强度好，弹性较大，有利于电泳后进行各种处理（类似橡皮）。3. PAG是连接的多聚体，側链除不活泼的酰氨基外，并无其他离子基团，故无电渗作用。 4。设备简单，所需要的
13、样品量少（1-100微克），分辩率较高。 5. 用途广-蛋白质，多肽和核酸等生物大分子。3.2 PAGE的基本原理：单体， 双体（甲撑双丙烯酰胺） PAGE的合成： 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的测定：凝胶筛孔的孔径，透明度，和弹性是随着凝胶浓度增加而降低，而机械强,2.2 凝胶制备 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在330之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋
14、白质的分子量进行分离的电泳中，如1020的凝胶常用于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。,）,聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是： 交联度（C）可按下式计算： a:b100时，5%凝胶 呈糊状且断裂。,上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。选择T和C的经验公式是： C = 6.50.3T 此式可用于计算T为520时的凝胶组成。C值并不
15、很严格，在大多数情况下，可变化的范围约为 1，当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当T保持恒定，C为4时，有效孔径最小，C大于或小于4时,，有效孔径均变大，C大于5时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C是2.6和3。配成30的丙烯酰胺水溶液在4下能保存1个月，在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接触皮肤，但它们聚合后则无毒。,注意事项,丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允许的最大暴露量不超过0.5g/kg，皮肤接触可致中毒，症状为红斑、脱皮、眩晕、动作机能失调、四肢无力等。
16、丙烯酰胺是神经毒剂，可以透过皮肤不要接触皮肤，戴手套、口罩操作,注意事项,没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近一定要催化充分，使之完全聚合集中处理，实验中全部的胶由专门受过训练的人收集到一起，在一个特殊标明的容器中保存，并进一步催化使之反应完全，最后送交学校危险品仓库，统一处理。,注意事项,聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心操作，因为其中可能留下少量没有聚合的单体。保护实验仪器，不得损坏。,2.3 凝胶聚合 丙烯酰胺的聚合： 化学聚合：过硫酸胺(AP)-催化剂-活化的丙烯酰胺彼此的连接形成多聚肽长链。 四甲基乙二胺（TEMED）（NH4）2S2O8 光聚合： 核黄素的作用：光聚合是一个光激化
17、的催化过程。在紫外光及氧作用下，核黄素生成含有自由基的产物。 优点：用量少（ 1mg/ml), 对分析样品无任何不良影响；聚合时间可任意调节控制，改变光照时间和强度，可使聚合作用延迟或加快。,2.4 化学与光聚合优缺点比较: *化学聚合法特点：凝胶孔径小，重复性较好，透明度好。 AP是强氧化剂，易使蛋白质变性。 *TEMED (四甲基乙二胺）：TEMED可加速凝胶聚合，但在pH蛋白质分子甘氨酸离子.,甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可以被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随
18、离子）。 当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH = 8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质SDS复合物，甘氨酸和Cl的界面很快超过蛋白质SDS复合物。这时蛋白质SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，
19、所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中（如通常使用的考马斯亮蓝）染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要11.5小时，电泳在2530mA下通常需要3小时，染色23小时，过夜脱色。通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳。,浓缩效应：浓缩程度与本身浓度无关，取决于因子： 电荷效应：分子量相同，但电荷不同。蛋白质所带的电荷不同，泳动率也不同。 分子筛效应：蛋白质分子量和构型。3.6 操作： 1. 不连续垂直柱状凝胶电泳 装置：,电泳槽,水平平
20、板垂直平板,预电泳： 目的除去残留的过硫酸铵，丙烯酸以及吸收紫外光的杂质，避免凝胶产生紫外吸收，造成无法进行蛋白质量检测。,分离胶的制备：浓缩胶的制备： 指示剂：溴酚蓝：负极在上，正极在下。 甲基绿或次甲基蓝：负极下，正极在上。离子浓度不能太高，否则电导太大，无法产生电压梯度，从而降低浓缩效应。 蔗糖浓度不能大于20%，否则产生对凝胶渗透作用。染色及定性和定量关系： 氨基黑， 考马斯亮蓝 定性：迁移率， 定量：谱带扫描取胶：,应用实例,酸性条件下不连续聚丙烯酰胺电泳技术作为分析手段，对玉米代谢蛋白进行提取、电泳、染色，可得到玉米代谢蛋白的电泳谱带，对蛋白谱带的分析，可鉴定出玉米品种优劣。,差异
21、蛋白质带,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,一.基本原理天然PAGE对蛋白质的分离一方面基于蛋白质的电荷密度,既在恒定缓冲系统中不同蛋白质间同性净电荷的差异,另一方面基于分子筛效应,既于蛋白质的分子大小和形状有关.因此用天然PAGE不仅能分离含各种蛋白质分子的混合物,还可以研究其特性,如电荷、分子量 、等电点乃至构象,并可用蛋白质纯度的鉴定.,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,二.天然PAGE的类型按被分离蛋白质的电性,天然PAGE可分为阳性电泳和阴性电泳.阳性电泳:pH 8.0-9.5,向阳极迁移.阴性电泳:pH 4.0左右,向阴极迁移.按电泳系统的连续性,
22、PAGE可分为连续系统与不连续系统.连续电泳:只有分离胶. pH值恒定,样品缓冲体系、凝胶缓冲体系 、电极缓冲体系相同,只是离子强度不同.不连续电泳:蛋白质先经过浓缩胶浓缩,再经分离胶分离,其中分离胶可以是均一胶,也可以是梯度胶.,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,三.影响分离效果的因素蛋白质在一块凝胶中的电泳迁移率取决于其电驱动力和摩擦阻力之间的平衡.电动力取决于电压和蛋白质带电量,而阻力取决于凝胶浓度和蛋白质大小.(一) 缓冲系统电泳缓冲系统包括缓冲液的pH值和离子组成及浓度.电泳缓冲系统选择的原则是保证样品的溶解度、稳定性 、生物活性以及电泳的速度和分辨率.,第十一章 电
23、泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,(二) 凝胶浓度对于天然PAGE,凝胶的分子筛效应(凝胶孔径)与电泳分辨率、电泳速度密切相关,而凝胶的孔径大小决定于凝胶浓度,因此凝胶浓度的选择很重要.(三) 助溶剂当蛋白质很难溶解时,往往需要使用助溶剂.普通的球状蛋白质在标准缓冲液中具有良好的溶解性,不需要助溶剂.而疏水性膜蛋白和一些丝状蛋白质很难溶于普通缓冲液中,必须使用强洗涤剂如SDS和还原剂(巯基乙醇、二硫苏糖醇等)以打开二硫键.,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,四.蛋白质分子量的测定用天然PAGE测定蛋白质的分子量时需要排除电荷的影响,因此需要测量蛋白质分子在不同浓度凝胶中的相
24、对迁移率从而得到蛋白质的分子量.具体做法是先用不同浓度的凝胶同时测定未知和以知分子量的相对迁移率;然后对不同蛋白质分子,以其相对迁移率的对数对凝胶浓度作图,得出一条直线,直线的斜率为阻滞系数,它与蛋白质分子量成正比;最后用以知分子量的蛋白质的阻滞系数对它们的分子量作图,得到一条直线,在此直线上根据未知蛋白质的阻滞系数可查得它的分子量.,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,五.天然PAGE的实验方法任何一种凝胶电泳都要经历三个主要步骤:制胶、电泳和检测.(一) 制胶1.制胶装置及操作模式PAGE实验现在主要采用垂直平板电泳以及水平平板电泳,特别是垂直平板电泳应用更普遍.垂直平板电泳
25、先灌注分离胶,在灌注浓缩胶,而水平平板电泳则无顺序要求.连续电泳只有分离胶,灌注比较简单.而不连续电泳需依次灌注分离胶和浓缩胶.,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,2.配制储液在制胶和电泳前,应首先配制各类储液,包括凝胶储液、电泳缓冲液储液和样品缓冲液储液.3.制备分离胶,天然PAGE分离胶配方,前三样先混合好后,在依次慢速搅拌加入10%AP及TEMED,并立即混合好.溶液中应避免产生气泡,否者凝胶聚合不好.,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,4.制备浓缩胶待分离胶聚合后，先除去分离胶上的水层，然后根据浓缩胶的浓度和用量配制浓缩胶溶液。将浓缩胶溶液迅速、稳定地注
26、入分离胶之上，直至顶部。,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,(二) 加样1.样品预处理样品一般溶解在特殊的样品缓冲液中,样品溶液应达到适当的离子强度.若离子强度过高,可以进行脱盐处理;若离子强度过低,可以直接加入1/4体积5x样品缓冲液进行混合.如果样品很难溶,可用助溶剂.,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,2.蛋白质标样的准备将合适分子量范围的5-7种标准蛋白质混合溶解在样品缓冲液中,制备成蛋白质标样.3.加样对于垂直平板电泳,用微量注射器吸取定量样品溶液,小心地伸入加样孔底部稳定加样,空孔中应加入样品缓冲液,以防止边缘效应.对于水平电泳,可在胶面上直接加样,
27、或在加样孔中加样对于圆盘电泳,样品直接加在浓缩胶胶面上.,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,(三) 电泳加好样后,接好电极,打开电源,将电压稳定在200进行电泳.待溴酚蓝前沿到达电泳槽底部时,关闭电源,取出凝胶,准备染色.(四) 检测天然PAGE不破坏蛋白质的生物活性,可采用的检测方法很多,如考马斯亮蓝染色法、银染色法和荧光染料法.考马斯亮主要有R-250和G-250两种. R-250常用于蛋白质染色,先固定,再染色,最后脱色; G-250多用于小肽染色,先同时固定和染色,在脱色.,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,(五) 电泳结果的保存凝胶经染色后,应马上拍照
28、或扫描,以记录电泳结果.(六) 电泳后蛋白质条带的回收用任何一种检测方法定位后,从胶上切下对应的带,然后将其简单地浸泡在缓冲液中,就可以容易地将纯化的蛋白质带回收下来.,第十一章 电泳技术第二节 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳,六.天然PAGE的应用范围PAGE主要用于分析样品组分并检测蛋白质纯化进程,还可测定蛋白质分子量.还可以用于分离并回收各种活性蛋白质,如酶、抗原、抗体、激素等,并可用于辅助研究天然蛋白质的构象.,第十一章 电泳技术第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,一.SDS- PAGE的分离原理SDS- PAGE的基础就在于十二烷基硫酸钠和蛋白质肽链之间非常强烈的相互作用导致SDS- 蛋白质
29、复合物以一个整体迁移.SDS- PAGE成功关键之一是蛋白质与SDS的结合过程,影响它们结合的因素主要有三个:一是溶液中SDS单体的浓度,二是样品缓冲液的离子强度,三是二硫键是否完全被还原.,基本原理 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。SDSPAGE 是在要跑电泳的样品中加入含有SDS和-巯基乙醇的样品处理液，SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二
30、硫键，破坏蛋白质的四级结构。,电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮35 min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。 这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。,变性,？,制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常使用的15的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围
31、是104105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要使用低浓度如10或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用的较高浓度凝胶（孔径较小）可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓,无法分离,分离胶浓度太高,无法分离,分离胶浓度太低,缩胶（约1 cm），并在浓缩上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径（丙烯酰胺浓度通常为35），各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常pH值较低
32、（通常pH = 6.8），用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。,3.2 单体与蛋白质结合比例的影响 单体和蛋白质结合成为蛋白质-SDS复合物，因而需要采取低离子强度，使单体浓度升高。单体浓度0.5 mmol/L以上，蛋白质就能结合SDS，并形成复合物。 当SDS单体浓度大于1mmol/L 时，它与大多数蛋白质平均结合比皆是1.4gSDS/1g蛋白质。 巯基已醇可使蛋白质中的二硫键还原，使多肽组成分成单个亚基，SDS可使蛋白质的氢键，疏水键打开，引起蛋白质构象改变。,结构：亚基与SDS结合的蛋白质在水溶液中形成近似雪茄 型的长椭圆型棒，不同
33、蛋白质-SDS复合物短轴约1.8nm, 而不同分子量的蛋白质的长轴不同，其长度与亚基分子量成正比。 构象和电荷不必考虑。,低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400,迁移率的作用： logMW=logK-bm=K-bm 迁移率与分子量的对数呈线性关系。 条件：二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚 SDS才能定量结合到亚基上面，使分子量与迁移率成线性关系。,铁蛋白分子量24 kDa,SDS-
34、PAGE,3.3 SDS与定性和定量的关系,SDS的作用：SDS-十二烷基磺酸钠，是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构。 原因：各种蛋白质所带的净电荷不一样，分子量大小和形状不同而产生迁移率不一样。 SDS的作用：消除蛋白质电荷对迁移率的影响，则电泳迁移率主要依赖分子量与所带的净电荷和形状无关。 巯基乙醇，二硫苏糖醇-使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。,SDS-PAGE不足之处： 电荷异常，例：组蛋白F1，本身带有大量正电荷，MW35,000，其它测定方法为21,000Da. 构象异常的蛋白-SDS结合量很小。
35、 带有较大的辅基。 测定结果只是亚基及单条肽链 不连续和连续电泳SDS-PAGE在凝胶浓度方面有所区别。 不连续：浓缩效应高，连续：浓缩效应差。,SDS-PAGE或PAGE有如下特点 采用SDS-PAGE或PAGE电泳原理。 每次可处理0.1mg50mg的蛋白质总量。 在样品分离时，可对分子差异高于2%的蛋白质予以精确分离。 整个操作过程：洗脱、分离、收集是持续性进行，可提高回收率并减少污染。 一次洗脱耗时约8小时。,第十一章 电泳技术第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,二.SDS- PAGE的类型在SDS- PAGE中,由于蛋白质与SDS结合后都带负电,因此是阳极电泳.SDS- PAGE也可
36、以分为圆盘电泳、垂直平板电泳和水平平板电泳SDS- PAGE多采用不连续电泳方式,因为在SDS- PAGE中蛋白质不存在电荷密度的差异,其分离主要取决于蛋白质亚基的分子大小.,第十一章 电泳技术第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,三.影响分离效果的因素影响SDS- PAGE分离效果的主要因素是凝胶浓度和电泳缓冲系统.(一) 凝胶浓度凝胶浓度决定凝胶孔径大小,并进而影响凝胶的分子筛效应.特别是对于SDS- PAGE,由于电泳分离只取决于SDS- 蛋白质亚基束的大小,因此凝胶浓度的选择尤为重要.(二) 缓冲系统缓冲系统的选择较简单,只要利于分离并保持蛋白质的稳定以及不于SDS发生相互作用即可.常用
37、缓冲系统为Tris-甘氨酸缓冲液.,第十一章 电泳技术第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,四.蛋白质亚基分子量的测定对于SDS- PAGE，蛋白质的电泳迁移率仅取决于亚基分子量的大小，且与其对数成正比，而且在任何凝胶浓度时，相对迁移率Rf与分子量对数之间都存在线性关系,选择合适的凝胶浓度只是为了得到最佳分辨率。于是选择合适的标准蛋白和合适的凝胶浓度,经过一次电泳既可得到蛋白质亚基的分子量,因此SDS- PAGE是测定蛋白质亚基分子量的最简单可靠的方法.,第十一章 电泳技术第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,五. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法(一) 制胶1.配制储液 2.制备分离胶 3.
38、制备浓缩胶(二) 制备样品和加样(三) 电泳(四) 染色和检测(五) 电泳结果的保存,第十一章 电泳技术第三节 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,六. SDS- PAGE的应用范围SDS- PAGE主要用于分析样品组分,检测蛋白质纯化进程,并进行定性、定量,特别是可测定蛋白质的亚基分子量.,第十一章 电泳技术第四节 等电聚焦,等电聚焦(IEF)的定义:等电聚焦是蛋白质在一个连续的、稳定的线性pH梯度上进行的电泳,此pH梯度建立在阳极和阴极之间,阴极的pH值高于阳极. 蛋白质作为两性电解质,在pH值低于其等电点pI时带正电,在pH 值高于pI时带负电,因此不管蛋白质处于此梯度中的什么位置,它都会向其p
39、I迁移.等电聚焦关键是在凝胶中形成连续的、稳定的线性pH梯度.,第十一章 电泳技术第四节 等电聚焦,一.原理(一) 等电聚焦的聚焦效应在pH梯度中,当某一蛋白质处于其非等电点位置时,由于它带有净电荷,势必向异性电极迁移,即其等电点方向迁移,一旦抵达其等电点位置,因净电荷为0而停止迁移;即使蛋白质因扩散而进入临近非等电点处.因此蛋白质只能在其等电点位置被聚焦成一条窄带.,第十一章 电泳技术第四节 等电聚焦,(二) 等电聚焦的分辨率降低扩散系数能提高等电聚焦的分辨率,而降低扩散系数的唯一途径就是增加介质的黏度,但增加黏度不是改善分辨率的高办法.总的来说,等电聚焦的分辨率主要决定于pH梯度和电场.
40、pH梯度范围越窄,则分辨率越高,但聚焦时间会延长,且只能应用于pI范围较窄的蛋白质.,第十一章 电泳技术第四节 等电聚焦,二.载体两性电解质和pH梯度的形成(一) 载体两性电解质的形成载体两性电解质和pH梯度的形成:在电极反应中,H+在阳极形成,OH-在阴极形成,从而导致在阳极和阴极分别形成低和高pH值区域,而pI值低于体系平均pH值的两性离子会在靠近阳极处浓缩成一陡峭的梯度,如果它在其pI处具有良好的缓冲性能,就会在pI周围产生一pH平顶,大量这种物质若具有平均分布的pI,则其平顶互相交盖而产生一连续的pH梯度.,第十一章 电泳技术第四节 等电聚焦,(二) pH梯度的形成当引入电场时,带不同
41、电荷的载体两性电解质分子将向其异性电极方向迁移,直至到达其净电荷为0的位置,一定时间后,所有不同pI的载体两性电解质分子都迁移到其对应的pH位置,于是形成从阳极至阴极pH值递增的pH梯度.,第十一章 电泳技术第四节 等电聚焦,三.载体两性电解质等电聚焦方法等电聚焦主要用于分析,很少用于制备.分析型等电聚焦一般采用高电压和低离子强度,以提高分辨率.维持高电压必须具有良好的凝胶冷却系统,以防止凝胶过热而烧胶,因此一般采用水平薄胶.它具有高分辨率和良好的重复性能,且可同时扫描并对比多个样品.,第十一章 电泳技术第四节 等电聚焦,(一) 制胶目前商业上有已制备好的多种pH范围的 聚丙烯酰胺等电聚焦凝胶供应,包括湿胶和干胶.干胶可用于任何所需pH范围的载体两性电解质溶液溶胀.(二) 上样等电聚焦样品的离子强度应尽可能低,最好溶解在双蒸馏水中,以避免盐离子对pH梯度的破坏及烧胶.等电聚焦样品无需浓缩.其上样量取决于灵敏度和实验目的.,第十一章 电泳技术第四节 等电聚焦,(三) 等电聚焦上样后将凝胶两侧分别与阳极、阴极电极溶液相连.阳极、阴极电极溶液的作用是为了避免样品或载体两性电解质在阳极氧化或在阴极还原.电极液通常由不挥发的酸或碱配置而成.阳极、阴极电极溶液的pH值应比阳极、阴极端的pH值分别略低和略高.,
