1、实验 7 考马斯亮蓝考 G-250 染色法测定蛋白质含量一、目的 1、学习一种蛋白质染色测定的方法 2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法 二、原理 蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝 G-250 在酸性溶液中为棕红色，其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成蓝色的蛋白质染料复合物，在 595nm 处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料符合物在59
2、5nm 处的吸光度与蛋白质杭亮成正比，因此可用于蛋白质含量测定。反应 25 分钟即呈最大光吸收，至少稳定 1 小时。在 0.011.0 mg 蛋白质/ml 范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的 Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液 pH 值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。 三、材料、试剂与器具 （一）试剂 1、染色液：取考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50ml 95%乙醇中，加 100ml 85%磷酸，加水稀释至
3、1 升。棕色瓶保存，该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。 2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml 牛血清白蛋白。 3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在 1030mg/ml （二）器具 1、试管及试管架 2、移液管（1ml,5ml） 3、可见光分光光度计 四、操作步骤 （一）标准曲线的制作1、取 7 支试管，按下表加入试剂 试管编号 0 1 2 3 4 5 6蛋白标准溶液 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1蒸馏水 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝 5 5 5 5 5 5 52、将试管摇匀，放置 20 分钟。 3、用分光光度计比色测定吸光值
4、 A595nm。 4、以 A595nm 为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 （二）样品的测定1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液 0.2ml，蒸馏水 0.8ml 考马斯亮蓝试剂 5ml. 2、将试管摇匀，放置 20 分钟。 3、比色测定吸光值 A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。 五、注意事项 1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定 2、测定工作应在蛋白质染料混合后 2min 开始，力争 1hr 内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉
5、淀而影响测定结果。 六、实验报告 绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。 七、思考题 1、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么？ 2、考马斯亮蓝法有什么优缺点Bradford 法的优点是（1）灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达 1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质- 染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。（2）测定快速、简便、只需要加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5min左右，颜色在 5min 至 20min 之间稳定性也很好。（3）干扰物质相对其它方法少。缺点是（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，
6、因此 Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。（2）仍有些物质干扰此法测定：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和 0.1mol/L 的 NaOH。（3）标准曲线也有轻微的非线性。 操作注意事项：不可使用石英比色皿（染色不易洗掉） ，可用塑料或者玻璃比色皿，使用后立即用少量 95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。721 分光光度计的操作使用 在接通电源前，应对仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固，接地线通地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源。 将灵敏度派或调至“1”档（放六倍率最小）。调波长调节器至所需
7、波长。 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置于“T”，调节透光度“100”旋钮，使数字显示“100.0”左右，预热 20 分钟。 打开吸收池暗室盖（光门自动关闭），调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0” ，盖上吸收池盖，将参比溶液置于光路，使光电管受光，调节透光度“100”旋钮，使数字显示为“100.0”。 如果显示不到“100”，则可适当增加电流放大器灵敏度档数，但应尽可能使用低档数，这样仪器将有更高的稳定性。当改变灵敏度后必须按重新校正“0”和“100”。 按连续几次调整 “00.0”和“100”后，将选择开关置于 A，调节吸光度调零旋钮，使数字显示“.000”。然后将待测溶液推入光路，显
8、示值即为待测样品的吸光度值 A。 浓度 C 的测量。选择开关由 “A”旋至“C”，将标准溶液推入光路，调节浓度旋钮。使得数字显示值为已知标准溶液浓度数值。将待测样品溶液推入光路，即可读出待测样品的浓度值。 如果大幅度改变测试波长时，在调整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“00.0”和“100”即可工作。五、注意事项比色皿使用注意事项： 拿取比色皿时，手指不能接触其透光面； 装溶液时，先用该溶液润洗比色皿内壁 23 次；测定系列溶液时，通常按由稀到浓的顺序测定； 被测溶液以装至比色皿的 3/4 高度为宜； 装好溶液后，先用滤纸轻轻吸去比色皿外部的液体，再用擦镜纸小心擦拭透光面，直到洁净透明； 一般参比溶液的比色皿放在第一格，待测溶液放在后面三格。
