1、1一、 名词解释：基因：即遗传因子，是指编码有功能蛋白质多肽链或 RNA 分子所必需的全部核酸序列（即 DNA 序列），是控制生物性状的基本遗传单位，是遗传变异的主要物质，支持着生命的基本构造和性能。 移动基因：又叫转位因子（transposable elements）,由于它可以在染色体基因组上移动，甚至可在不同染色体间跃迁，故又称跳跃基因（jumping gene）。有三种类型，插入序列，转位子和噬菌体 Mu 和 D108。断裂基因：真核细胞的结构基因，其核苷酸序列中含有与氨基酸编码无关的 DNA 间隔区段，从而被分割成不连续的若干区域。将这种编码序列不连续，有间隔区段的 DNA 片断称为
2、断裂基因。非编码间隔区段称间隔子，有转录和编码功能序列称表达子。原核细胞无内含子。 重叠基因：不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因。 假基因：在珠蛋白基因簇（gene cluster）各片断核苷酸序列分析时发现，除了有正常的功能基因之外，还有功能失活的特殊序列片断，它不能行使表达功能。该类无表达功能的畸变核苷酸基因序列片断，称为假基因。 同尾酶：有一些限制性核酸内切酶识别的碱基顺序不完全恒定，即识别顺序不同，但酶切后产生同样黏性末端的两种酶称为同尾酶，如 BamH和 Bgl 质粒：细菌存在于细胞质中的一种独立于染色体以外的遗传成分，是由环状的 DN
3、A分子组成的复制子。质粒有我复制和调控系统，可以在胞浆内自主复制，把携带的遗传信息通过自我复制的子代质粒，可随细菌分裂而进入子代菌体中。还有转移，选择性标记及不相容性等特性。柯斯（COS）质粒：是一类由人工构建的含有 DNA 的 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，插入柯斯质粒载体的外源 DNA 片段的长度可大于40kb，从而大大增加了载体的携带能力。 （粘性质粒（Cosmid ）带有 噬菌体的 Cos 位点和整个 pBR322 的 DNA 顺序。经感染进入细菌细胞以后，它就好象质粒那样在细胞中进行复制。分子量小，易环化和扩增，可包装 30-45kb 外源基因，可由 Ampr 抗性筛
4、选，常用于构建基因文库。） COS 细胞：用一个复制起始部位缺失的 SV40 突变种感染猴细胞，由于病毒 DNA 不能自主复制，便整合到宿主染色体 DNA 中，早期基因表达产生功能性的 T抗原，这样的细胞就叫 COS 细胞。 （COS 细胞瞬时表达系统是由 COS 细胞系及带有 SV40 病毒感染猴细胞后 48 小时，病毒基因组课扩增 1000 倍。基因组文库：分离真核生物中某种 DNA 成分, 通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体 DNA 片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体 DNA 片断的克隆株, 这种克隆株群体称基因组文库。（把某种生物基因组
5、的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。） cDNA 文库：以 mRNA 为模板在反转录酶的作用下将形成的互补 DNA（cDNA ）与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立克隆株，即 cDNA 文库（gene library）。（以 mRNA 为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成 cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部 mRNA 信息的 cDNA 克隆集合称为该组织细胞的 cDNA 文库。cDNA 文库特异地反映某种组织或细胞中，在2特定发育阶段表达的蛋白质的
6、编码基因，因此 cDNA 文库具有组织或细胞特异性。）Transformation（转化）：细菌转化是一种常见的分子生物学技术，通过热激、冰浴、复苏等步骤后，把外源 DNA 转入细菌感受态细胞，使外源基因在宿主细菌胞内扩增、表达等。 转染：病毒（含噬菌体）DNA 及其重组子 DNA 导入宿主细胞（或细菌）的过程。由于噬菌体是细菌的病毒，因此噬菌体 DNA 导入大肠杆菌的感受态细胞也称转染。 转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传递遗传物质的方式之一。是指一个细胞的 DNA 或 RNA 通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。启动子：是位于结构基因上游，转录起始调控所必
7、需的一段 DNA 序列，是 RNA 聚合酶与模板 DNA 结合的部位。内含-35 区（与 因子结合）和-10 区（和核心酶结合）的保守序列。当启动子与全酶结合后可在+1 转录起始点开始转录。P46 起始密码子：mRNA 上的碱基顺序每 3 个碱基用解读框架划分开，可决定其所生成蛋白质的氨基酸顺序，为了使碱基顺序作为遗传信息能正确转译，通常需要从某个特定的位置开始转译，这个起始点的密码子就叫做起始密码子，对应于 AUG。其中原核生物的起始密码子 AUG 翻译对应的是甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物的起始密码子 AUG 翻译对应的是甲硫氨酸（Met）。终止子：是给予 RNA 聚合酶转录终止信号的
8、 DNA 序列，在一个操纵元中至少在构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。 P52粘性末端：当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将 DNA 的两条链分别切开时，在切口处留下几个未配对的核苷酸片段，这些片断可以通过重叠的 5末端形成的氢键相连，或者通过分子内反应环化，因此称这些片段具有粘性，叫做粘性末端。终止密码子： 蛋白质翻译过程中，终止蛋白质合成的 mRNA 上的三联体碱基序列，终止密码子有 UAG,UAA,UGA。 锌指结构：一种常出现在 DNA 结合蛋白中的一种结构基元。是由一个含有大约 30个氨基酸的环和一个与环上的 4 个 Cys 或 2 个 Cys 和 2 个 His 配位的 Zn
9、2+构成，形成的结构像手指状。 载体：指在基因工程重组 DNA 技术中将目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的 DNA 分子。三种最常用的载体是 细菌质粒、噬菌体、动植物病毒。 PCR：聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制，PCR 的最大特点，是能将微量的 DNA大幅增加。Genomic DNA：基因组 DNA，即组成生物基因组的所有 DNA，包含一个生物体的全部遗传信息，即 DNA 的全部核苷酸序列。对于二倍体高等生物，其配子的 DNA 总和即为一组基因组。不同区域具有不同的功能，有些编码蛋白质，有些调控基因的复制，
10、转录和蛋白质表达等。Split gene：断裂基因，真核生物结构基因，有若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因或间隔基因。 Intron：内含子（introns）在转录后的加工中，从最初的转录产物除去的内部的核苷酸序列。也指编码相应 RNA 内含子的 DNA 中的区域。内含子对翻译产物的结构无意义，它比外显子累积有更多的突变。 3Exon：外显子，是指真核细胞的基因在表达过程中能编码蛋白质的核苷酸序列。是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达
11、为蛋白质。外显子是最后出现在成熟 RNA 中的基因序列, 又称表达序列。既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的 RNA分子中的核苷酸序列。Transcription（转录）：是遗传信息由 DNA 转换到 RNA 的过程，是蛋白质生物合成的第一步。即以 DNA 中的模板链为模板，以ATP、CTP、GTP、UTP 四种核苷三磷酸为原料，在 RNA 聚合酶催化下合成 RNA 的过程。 翻译：在多种因子辅助下，细胞内以 mRNA 为模板，在核糖体上通过以 tRNA 识别mRNA 的三联体密码子和转移相应氨基酸，组装合成蛋白质肽链的过程。在多数情况下，新生多肽还需经过转译后加工和修饰才能成为有活性的蛋
12、白质。 顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。 反式作用因子：是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。有时也称转录因子。大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，从而激活另一基因的转录。这种调节蛋白称反式作用因子。 Transcription factor：即转录因子，能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质
13、，活化后从胞质转位至胞核，通过识别和结合基因启动子区的顺式作用元件,启动和调控基因表达。 瞬时表达：即瞬时转染后的初期，质粒或 DNA 片段是游离在细胞中的，能够进行表达，成为瞬时转染表达。随后，游离在细胞中的质粒或 DNA 片段有两种归化，一种是被降解，还有一种是插入染色体中而能够持续地稳定地表达。 稳定表达：(1)外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。重组基因的稳定表达水平一般要比短暂表达低 12 个数量级。(2)基因工程表达系统中工程菌株或细胞虽经过多次传代或条件变化，但表达水平仍然保持稳定的现象。 亮氨酸拉链：出现在 DNA 结合蛋白质和其它蛋白质中的一种结构基元。当来自同一个或
14、不同多肽链的两个两用性的 - 螺旋的疏水面（常常含有亮氨酸残基）相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构时就形成了亮氨酸拉链。 基因突变：基因组 DNA 分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。在一定的条件下基因从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个过程叫做基因突变。 无义突变：是指由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。 编码氨基酸的密码子突变为终止密码子，使肽链合成中断，形成一条不完整的多肽链。 错义突变：是编码某种氨
15、基酸的密码子经碱基替换以后,变成编码另一种氨基酸的密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。错义突变的结果通常能使多肽链丧失原有功能，许多蛋白质的异常就是由错义突变引起的。 4同义突变：碱基被替换之后,产生了新的密码子，但由于生物的遗传密码子存在简并现象,新旧密码子仍是同义密码子，所编码的氨基酸种类保持不变，因此同义突变并不产生突变效应。 限制性核酸内切酶：是可以识别 DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA 的一类内切酶，简称限制酶。 根据结构，辅因子的需求、切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型：型限制性内切酶既能催化宿主DNA 的甲基化，又催化非甲基化的 DNA 的水
16、解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的 DNA 的水解。III 型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。 基因拼接：将有共同限制性内切酶切点的基因连接起来形成多种基因杂合体，如将IFN-1 与 IFN-2 亚型间进行拼接，可形成 IFN-1/2 或 IFN-2/1 等，称 IFNs 杂合体。此外，也可根据需要将具有协同效应的不同基因进行接拼。（重组 DNA） 基因缺失：将原基因中的非功能区域的编码子人为地使之缺失的过程称为基因缺失，所表达的产物相对分子质量虽然小了，但有时可提高表达效率，如 IL-6 缺失 N 端 1725 个核苷酸可使 IL-6 的表达效率提高。有时还可降低一些毒性作用，如
17、 TNF 基因缺失某一区域可使毒性下降。重组病毒载体：将外源性的 DNA 直接插入缺陷型的病毒基因组上，插入的外源片段的大小同被取代的病毒基因组区段是等同的。这样形成的重组体 DNA 能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并包被成病毒颗粒。但为了补充被取代病毒基因组 DNA 功能，必须用一种与之互补的辅助病毒。 重组质粒型载体：即 重 组 病 毒 -质 粒 载 体 ， 这 类 载 体 只 取 病 毒 基 因 组 中 维 持 在 哺乳 动 物 中 进 行 复 制 的 有 关 序 列 以 及 抗 性 标 记 基 因 ， 使 它 与 一 个 细 菌 质 粒 融合 ， 这 样 的 重 组 体 也 能 够 在
18、 大 肠 杆 菌 中 进 行 复 制 和 增 殖 ， 不 过 这 种 重 组 体不 能 够 被 包 装 成 病 毒 颗 粒 ， 不 能 出 现 裂 解 感 染 的 情 况 。 基因工程多肽疫苗：使微生物对人体具保护作用的抗原基因经体外重组表达后所制备的生物活性多肽类疫苗称基因工程多肽或亚单位疫苗。其表达系统可以是酵母，也可以是哺乳动物细胞，若无需糖基化的多肽疫苗甚至可在大肠杆菌等原核细胞中表达。 基因置换：基因置换就是用正常基因通过体内基因同源重组，原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的 DNA 完全恢复正常状态。属于基因治疗的一种方法。基因修正：是指将致病基因的突变碱基序列得以纠正，而正常
19、序列部分予以保留，使突变的致病基因恢复正常功能，即，使致病基因的突变序列纠正为正常序列（用碱基点突变技术）。 基因修饰：基因修饰是基因治疗机理的一种，主要是指利用生物化学方法修改 DNA序列，将目的基因片段导入宿主细胞内，或者将特定基因片段从基因组中删除，从而达到改变宿主细胞基因型或者使得原有基因型得到加强的作用。基因失活：基因失活是基因治疗机理的一种，是指利用反义技术，使非正常基因或有害基因不表达或降低表达活性，以达到治疗某些特定疾病的目的。 转基因动物：将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体表达外源基因的动物，称为转基因动物。 动物克隆：是一种通过核移植过程进行无性繁
20、殖的技术。不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术。 基因敲除：是用 DNA 重组技术剔除或破坏生物体基因组内某一特定基因，而后观察由此引起的表型改变。 （基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术，可培养出靶向性剔除5某基因的小鼠，而导致行为特性改变。但由于同源位点和重组率低等原因，障碍较大。）ES 细胞：embryonic stem cell ，即胚胎干细胞，是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。 二、 问答题 1.什么叫基因？何谓基因的新概念？其
21、主要功能是什么？P26-28答：基因就是指编码有功能蛋白质多肽链或 RNA 分子所必须的全部核酸序列。所谓基因的新概念是随着近年分子生物实验技术的发展，从分子水平上研究基因的结构和功能，提出的移动基因，断裂基因，重叠基因，假基因等基因的新概念。功能：基因是编码蛋白质或者 RNA 分子基本遗传信息的基本遗传单位，最终可合成各种特异的多肽，具有不同的功能。从化学角度看，基因是具有特定功能和结构的连续脱氧核糖核苷酸序列，是构成染色体的重要组成部分，是构成 DNA 的功能单位。2.真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？能，为什么？不能，为什么？答：不能，真核细胞基因序列中的内含子
22、是插入在结构基因中间使其不能连续的间隔基因序列片段，可随 DNA 转录参与形成前体 mRNA，而后在转录后的加工修饰过程中通过两次转脂反应而剪切，在原核细胞中，由于其基因组序列不包括这类内含子，也缺乏相应的内含子的剪接功能和转录后加工系统。因此不能完成内含子基因序列的剪切过程，是一种无效转录。同时，真核生物基因在原核细胞中表达还必须有相应的原核 RNA 聚合酶以及可识别的原核细胞的启动子, 才能催化 RNA 的合成。3.试述 DNA 分子的结构及其意义。P5答：DNA 一级结构：即 DNA 分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序。其中 A,T,C,G 碱基分布不均匀，但脱氧核糖和磷酸均一样。意义：1、
23、蕴藏着极为丰富的转换为蛋白质的遗传信息；2、一些特定序列以其大量信息决定着 DNA 的空间结构及基因间相互作用和调控功能。DNA 二级结构：为 DNA 双螺旋结构，由两条反向平行互补的脱氧核糖核苷酸链组成，两条链之间靠碱基间的氢键结合，多为右手螺旋。意义：解释了 DNA 复制时两条链可分别作为模板生成新的子代互补链，从而形成遗传信息稳定传递的半保留复制机制。DNA 三级结构，指双螺旋结构基础上的卷曲，包括线状双链中可能有的扭结和超螺旋、多重螺旋和分子内单链形成的环及环状 DNA 中的扭结、超螺旋和连环等体拓扑学状态。意义：1、使 DNA 体积更小，2、DNA 的线性序列带遗传信息，而紧绷的超螺
24、旋状态储存着必要的生物学过程的能量和信息。是一种重要的功能态。三链 DNA：双螺旋结构基础上形成的三链螺旋结构。意义：1、作为精确切割双螺旋 DNA 靶序列的分子剪刀；2、作为基因表达抑制物，选择阻断靶基因，抑制转录；3、阻止序列专一性蛋白质结合，影响 DNA 与蛋白质结合及 DNA 复制转录等。四链 DNA：如端粒酶是真核细胞 DNA 3末端特殊重复序列，对染色体起保护作用。4.试述 cDNA 文库的构建过程及其意义。P156答：过程：1、cDNA 克隆：选用目的基因含量丰富的组织细胞，提取总 RNA，根据3末端 polyA 尾长度不一，用亲和层析法获取较纯的 mRNA2、第一股 cDNA
25、合成：以分离纯化的 mRNA 为模板，以 Oligo(dT) 为引物在反转录酶的作用下，沿模板的 35方向合成。对于较长的 mRNA 分子很难得到全长 cDNA，也可用随机引物法，以668 个核苷酸为随机引物，从 mRNA 的不同结合点合成全长 cDNA 第一链（RNA-DNA）3、第二股 cDNA 的合成： 自身引导法 置换合成法 外加引物合成法 4、cDNA 与载体连接和导入宿主细胞：cDNA 加头或衔接尾，使产生的黏性末端与载体相应的黏性末端互补，形成重组 DNA。意义：1、以成熟 mRNA 为模板合成的 cDNA 无内含子，大大减小其长度，便于操作。2、真核生物细胞表达 mRNA 的量
26、比人类基因组少很多，因此减少了筛选目的基因的工作量。3、某一特定功能基因在 mRNA 中拷贝量大于基因组，利于获得较多模板。4、可从全长 cDNA 序列中直接找到编码区，推测氨基酸顺序，分析性质和功能。5、基因克隆后可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白。 5.试述基因组文库的构建过程及其意义。答：过程：（1）分离纯化基因组 DNA,提取哺乳动物细胞染色体 DNA；（2）制备全部基因组的 DNA 片断：包括完全酶解，部分酶解和机械切割。（3）构建基因组文库载体，常用载体：粘性质粒， 噬菌体，酵母人工染色体系统。（4）DNA 片段与载体的连接包装：直接与经 BamH消化酶切的 噬菌体的黏性末端在 T
27、4 连接酶的作用下进行重组结合形成重组 DNA，然后进行体外包装产生完整的具有强感染力的噬菌体颗粒，继而形成噬菌斑。（5）导入细胞，一定条件下进入大肠杆菌培养增殖。基因组 DNA +粘性质粒重组 DNA转化细菌菌落 基因组 DNA + 噬菌体重组 DNA包装成噬菌体感染细菌噬菌斑意义：（1）可便于研究基因组中 5末端控制基因转录的调控序列，内含子的分布和作用以及重复序列的数量及分布的大小。（2）开展“人类基因组计划”研究。3、在哺乳动物细胞中，是表达目的蛋白的基本形式之一。6.什么是限制性核酸内切酶？答：限制性核酸内切酶是一类可以识别双链 DNA 的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DN
28、A 的一类限制酶。主要从原核生物中国分离纯化而来。根据限制酶的结构,辅因子的作用方式，可将限制酶分为三种类型：I 型、II 型及 III 型。型既能催化宿主 DNA 的甲基化，又催化非甲基化的 DNA 的水解；而型只催化非甲基化的 DNA的水解；III 型同时具有修饰及认知切割的作用。7.试述双脱氧末端终止 DNA 测序法的原理及过程。答：原理：将 2 ，3双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的 DNA 链中，由于参入的 ddNTP 缺乏 3羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。过程：测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入 2,3-双脱氧的 A,
29、C, G, T 核苷三磷酸(称为 ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应. 在第一个反应物中, ddATP 会随机地代替 dATP 参加反应一旦 ddATP 加入了新合成的 DNA 链, 由于其 3 位的羟基变成了氢, 所以不能继续延伸.所以第一个反应中所产生的 DNA 链都是到 A 就终止了; 同理第二个反应产生的都是以结尾的; 第三个反应的都以 G 结尾, 第四个反应的都以 T 结尾, 电泳后就可以读出序列了。8.试绘图并说明大引物 PCR 定点诱变法的过程。答：原理：以第一轮 PCR 产物作为第二轮 PCR 扩增的引物。第一轮以引物 2 和引物3 扩增出
30、短片段 DNA，引物 2 含有预先设计的突变序列。待 PCR 产物经纯化后除去原来的引物，然后以上一轮 PCR 扩增产物作为大引物，并与引物 1 一起再对靶基因作第二轮 PCR 扩增，其产物即为突变的 DNA。79.何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明？P42-43答：四大里程碑：1、1944 年 Oswald Avery 报道肺炎球菌转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是 DNA，而且还证明了 DNA 可以转移，并把一个细胞的性状传递给另一个细胞；2、1953 年 James waston 和 Francis Crick 阐明了 DNA 双螺旋结构，建立了DNA 半保留复制及蛋白质合成的中心
31、法则，提出了遗传信息是 DNARNA蛋白质，也阐明了转录翻译过程中出现误差造成生物变异；3、遗传密码子的破译：1961 年 Monod和 Jacob 提出操纵子学说，1968 年 Crick 和 Nireberg 完全破译 64 个遗传密码子，确定遗传信息是以密码子方式传递的；4、基因转移载体的发现：20 世纪 60 年代，发现了细菌的质粒，它是指生物体染色体以外的环状 DNA，具有独立自我复制的能力，可在微生物细胞间转移。三大技术发明：工具酶的发明（内切酶、合成酶、连接酶）；基因合成和测序（合成仪、测序仪）；PCR 技术（PCR 扩增仪）。10.基因工程常用的载体有哪些？其共同特性如何？P9
32、3答：常用载体有 5 类：质粒， 噬菌体的衍生物，柯斯质粒，单链 DNA 噬菌体M13，动物病毒。共同特征： 自主复制易于扩增分离纯化有非必需区有单一酶切位点（多克隆位点）单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点；多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点有选择标记基因表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD 序列）11.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？P93答：作为理想的质粒载体应具备以下几个条件（1）能自主复制，即本身是复制子（2）具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能（3）在基因组中有 1-2 个筛选标
33、记为寄主细胞提供易于检测的表型特征（4）分子量要小，多拷贝，易于操作。12.什么叫插入失活，举例说明之？答：外源基因片段克隆到插入型载体上后，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应，也为克隆基因的选择提供了表型。常用的有免疫功能失活和大肠杆菌-半乳糖甘酶失活。例一：免疫功能失活。Imm434 是噬菌体 434 的免疫区段，通过噬菌体杂交的办法导入噬菌体基因组，构成插入型的派生载体。在 C 基因内部有 EcoR和 Hind的单一切割位点，若在这两个位点中任意一个插入外源 DNA 片段，都会导致 C基因的失活，阻遏蛋白合成受阻，进入溶菌周期，结果产生出清晰的噬菌斑，而亲本噬菌体 C
34、未失活，可以变成溶原的状态，形成浑浊的噬菌斑。例二：-半乳糖甘酶基因组中含有一个大肠杆菌的 LacZ 区段，在诱导物 IPTG 存在下，可指导合成-半乳糖甘酶与 X-gal 结合形成蓝色化合物。因此由这样的载体感染的大肠杆菌 Lac-指示菌，涂布在含有 IPTG 和 X-gal 的培养基上，会形成蓝色噬菌斑。但若在 LacZ 区段插图外源 DNA 片段，就会阻断其编码序列使其失活，从而不能形成相应的蓝色噬菌斑。13.如何从所克隆到基因重组体中鉴定目的基因的存在和正确性？答：1、利用遗传标志的表型特征筛选：（1）由载体提供的性状进行筛选：a、抗生素抗性标记筛选：当带有完整抗性基因的载体转化抗性细
35、胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌，能在含相应抗生素的平板上生长形成菌落，而未转化的原宿主菌则不能生长。b、抗性基因的插入失活筛选：在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因 DNA 片段插入其中一个抗性基因，就会导致抗性基因功能失8活，用两个含不同抗生素的平板进行对照筛选。c、-半乳糖甘酶 LacZ 基因失活：通过基因内互补作用，使缺失 LacZ 基因的突变体和带有完整 LacI 而无-半乳糖甘酶活性的的突变体结合，形成有功能活性的-半乳糖甘酶。（2）根据插入基因的遗传性状进行筛选：如亮氨酸（Leu）为 Leu 营养缺陷菌所必须，如果外源基因中能够表达Leu，则可使细菌生
36、长。2、根据重组子的结构特征筛选：（1）重组子大小鉴别筛选：菌落提取质粒单切酶电泳质粒。携带外源目的基因的重组子质粒分量大，条带滞后，反之在前。适用于插入片段大的重组体筛选。（2）酶切鉴定：菌落提取质粒双切酶电泳质粒。原载体无外源目的片段，电泳为一条带，装有外源基因的载体有原载体和目的基因片段两条带。（3）PCR 筛选法：利用能与插入基因片段两端互补的特异引物，以少量抽提的重组子 DNA 为模板扩增出特异片段的转化子为携有目的基因的重组子，还可进行直接测序。（4）原位杂交：在培养基平板上的菌落或噬菌斑按照其原来的位置原位不变的转移到滤膜上，并在原位溶菌裂解，DNA 变性和用特异探针进行杂交。（
37、5）斑点杂交：将重组体 DNA 或 RNA 提取出来，将样品点在硝酸纤维膜上进行杂交。纯化的重组体去除了杂质干扰。（6）Southern blot：将同源片段定位在某个酶切片段中，可用于对克隆后片段的基因定位，也可测其含量。14.质粒单酶切点的基因连接缺点及如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？答：一般用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶（BAP 或 CAP），预先处理线性的载体DNA 分子，以移去其末端的 5-P 基团，于是在连接反应中，它自己的两个末端就再也不能被连接酶共价连接起来了。这样形成的杂种 DNA 分子的每一个连接位点中，载体DNA 都只有一条链是外源 DNA 连接上的，而另外一条链
38、由于失去了 5-P 基团，不能作此连接，故留下一个具有 3-OH 和 5-OH 的缺口，尽管如此，这样的 DNA 分子仍然可以导入细菌细胞，并在寄主细胞内完成缺口的修复工作。另外，也可改用双酶切片段的定向克隆，用两个不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和载体，产生两个不同的粘性末端，避免该现象。15.如何利用抗体标记基因筛选阳性克隆？ 答：1、抗生素抗性标记筛选：大多数质粒载体均带有抗生素抗性基因，如抗氨苄西林基因等，当带有完整抗性基因的载体转化抗性细胞后，所有转入载体的细菌都获得了抗性，被转化的阳性克隆菌能在相应抗生素的琼脂平板上生长，如 pBR220 的抗氨苄西林基因可使克隆菌在氨苄西林平板
39、上生长并形成菌落，而未被转化的原宿主菌则不能生长。2、抗性基因的插入失活：在含有两个抗性基因的载体中，如果目的基因 DNA 片段插入其中一个抗性基因，就会导致该抗性基因的功能失活，用两个分别含不同抗生素药物的平板进行对照筛选，可筛选出阳性重组子克隆菌株。如 pBR322 质粒编码有 Tet抗性基因和 Amp 抗性基因，若通过外源 DNA 片段使 Tet 或 Amp 抗性基因失活，则重组体克隆能在只含有一种抗生素的平板上生长繁殖的重组体克隆即为阳性转化。16.真核表达调控的顺式作用元件和反式作用因子有哪些？其作用特点是什么？答：顺式作用元件有：启动子，增强子，沉默子，衰减子，终止子。作用特点：1
40、、多数位于真核生物结构基因上游，只有终止子位于下游，而增强子可以在上游也可以在下游。2、能够与 DNA 结合蛋白质结合的特定序列的 DNA 片段。3、决定转录起始位点和 RNA 聚合酶的转录效应。反式作用因子因子：通用转录因子和转录调节因子。作用特点：1、同一 DNA 序列可被不同蛋白质识别。2、不同蛋白质因子可与不同DNA 序列发生联系，但直接连接为少数。3、蛋白质-蛋白质或 DNA-蛋白质的结合，均导致构象上得细微变化，构象变化常是实现调控功能的分子基础。4、在反式作用因子的自身生物合成过程中，有相当大的可变性和可塑性。17.目的基因表达系统有哪几种？其特点如何？9答：主要有原核（如大肠杆
41、菌）和真核(如哺乳动物细胞)两大表达系统。两个系统的特点：1、真核生物 DNA 大部分是非裸露的，由核膜包裹，DNA 转录后需由特殊的肽链引导出核膜后开始翻译。原核生物大部分 DNA 属于非结合状态，又无核膜相隔，边转录边翻译。2、真核生物 DNA 中存在内含子，不翻译，可在转录后的加工修适中剪切掉。原核生物 DNA 序列中没有内含子，也没有转录后相应的剪切过程。3、真核生物具有在需要时以可控方式重拍某些 DNA 片段和扩增特定基因的机制，原核生物中罕见。4、真核生物有 3 种不同的 RNA 聚合酶，分别参与不同类型的 RNA 分子转录作用。而原核生物往往只有一种 RNA 聚合酶。5、真核生物
42、产生的 mRNA 分子寿命大多比原核生物长。6、真核生物初级转录产物可进行转录后的加工修饰。不仅可除去内含子，还可以再 mRNA 分子的 5末端加帽，3末端加尾。7、真核生物不存在操纵子结构，转录产物 mRNA 为单顺反子，其表达调控成散在瀑布样型。原核基因表达调控顺序为操纵子，转录产物为多顺反子，可直接与一定数量的核糖体结合形成为多聚核糖体。8、真核生物基因为多拷贝。而原核生物中除了 rRNA，tRNA 和启动子部分区域为重复序列，其余基因很少含重复序列。9、真核生物一条 mRNA 上同时只能合成一条肽链，原核生物每个核糖体可独立合成一条肽链，多聚核糖体可同时在一条链上合成多条肽链。10、真
43、核生物翻译过程不需要 SD 序列的特异性结合，原核生物必须依赖这种序列。11、原核生物表达的外源基因蛋白产物不能被糖基化。18.基因工程疫苗研究开发常用的技术途径有哪些？19.基因治疗展望和应用如何？答：展望：基因治疗存在感染率低，表达水平低，长期表达效果难，整合随机性带来危害等自身问题，以及伦理道德，安全性，技术复杂，要求条件高，所用细胞寿命短等技术问题。但它是人类治疗疑难疾病的新方法，新技术，随着研究和应用的不断发展，不断深入，技术不断完善成熟，基因治疗将会在人类常见病和多发病及疑难病的有效治疗中发挥巨大作用，许多原来视为“不治之症”的疾病将应用这先进技术得到治愈，其应用前景极为广阔。应用
44、：1、遗传性疾病的基因治疗 2、肿瘤的基因治疗（1）抑癌基因转移的基因治疗（2）反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法（3）药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用（4）癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗（5）多重耐药性基因转移的肿瘤基因治疗 3、病毒的基因治疗（1）阻止病毒复制策略（2）使感染 HIV 细胞死亡的方法（3）降解策略20 有哪几种反义核苷酸基因失活疗法？简述其原理。答：原理：反义 RNA 是一种与 mRNA 互补的 RNA 分子，它是双链 DNA 中无意义链转录的 RNA，因此肿瘤癌基因活化表达的 mRNA 的起始翻译部位就会被相应的反义 RNA 互10补结合形成 RNA/RNA 双链体，进而就阻
45、止了核糖体与启动子结合，或阻止核糖体 mRNA上移，以抑制 mRNA 的翻译，起到了抑制癌基因过高表达癌蛋白的效果。反义核酸包括三类：1、将特异的反义基因重组到表达载体上，导入靶细胞中转录出反义 RNA，形成双链 RNA,阻碍基因的翻译。2、人工合成寡聚脱氧核糖核酸经过化学修饰导入细胞，与 mRNA 和 DNA 结合，形成 RNA/DNA 杂链或 DNA 核苷酸三聚体，影响基因的翻译或转录。3、特异性的核酸，根据癌基因设计出特异的“锤头”或“发夹”结构，它能够催化切割，降解异常表达基因的 mRNA 而影响基因的翻译。21.何谓动物克隆技术？有何应用价值？答：动物克隆：是一种通过核移植过程进行无
46、性繁殖的技术。取发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，使之与去掉细胞核的卵母细胞融合，经短期培养后形成胚胎细胞并移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。应用价值：1、培育优良畜种和生产实验动物。2、生产转基因动物。3、生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法。4、复制濒危动物物种，保存传播动物物种资源。22.试述 PCR 的原理及过程。P135答：PCR 原理：是依据细胞内 DNA 半保留复制的机理，以及体外 DNA 分子
47、于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，在试管中给 DNA 的体外合成提供一种合适条件：模板 DNA，寡链核苷酸引物，DNA 聚合酶 ，合适的缓冲液系统和 DNA 变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的 DNA 得以迅速扩增。PCR 过程：1、DNA 模板变性：与体内不同，体外用 94C 左右的高温使其变性形成单链 DNA。2、模板与引物退火：PCR 需要两条寡链核苷酸作为合成时的引物，分别与待扩增 DNA 的序列两端互补。在降低温度过程中，通过控制退火条件就能使其与扩增区域两端配对。3、引物延伸：在 4 种 dNTP 及 Mg 离子存在的条件下，DNA 聚合酶在最适作用温度下可将核苷酸从引
48、物 3端掺入，沿模板延伸。整个过程约需要 30 轮的循环。23.试述 RT-PCR 的原理及过程。P143答：原理：即逆转录 PCR，先在逆转录酶的作用下以 mRNA 为模板合成 DNA,再以cDNA 为模板进行 PCR 反应。这样低浓度的 mRNA 被扩增放大易于检测。是一种快速、简便且敏感性极高的检测 RNA 的方法，可用于分析基因的转录产物、克隆 cDNA 及合成cDNA 探针、改造 cDNA 序列等。11RT-PCR 过程：1、mRNA，引物和逆转录酶以及适当的缓冲体系在 70C5min，生成相应的 cDNA。2、dNTP，DNA 聚合酶，引物，适当的缓冲体系，37C1h，而后 95C
49、5min灭活反应体系中的其他杂质，4C 保存。24 试述肿瘤的发生机理。答：1、癌基因（原癌基因）的异常表达。2、抑癌基因的失活，会对癌基因的异常表达失去抑制作用。3 细胞在增殖过程由于某些因素使 DNA 在复制过程中产生碱基错配的基因，由于细胞 DNA 修复功能的丧失而无法得到校正。4 肿瘤转移基因和肿瘤转移抑制基因相互制约的关系发生失调或障碍。5 肿瘤细胞免疫功能的强弱也与肿瘤的发生相关。25.试述肿瘤的发生与细胞周期调控的相关性.答：细胞周期素和 CDK 等细胞周期相关蛋白过表达或者缺陷，特别是那些决定细胞有 G1 进入 S 期的蛋白若表达异常，使细胞周期进程超越或突破细胞周期的控制点，细胞不能正常发生细胞自发产生的细胞死亡，衰老或分化，从而造成细胞恶性增生，形成恶性肿瘤。P53，Rb 等抑癌基因的突变或缺失，与许多恶性肿瘤的发生进展和不良预后相关，如某些生长因子及其受体的高表达与癌基因异常激活有关，特别是一些与信号转导有关的蛋白酶的异常活化，以及抑制细胞凋亡基因的异常表达，均与细胞的恶变相关，如周期素 D2 在直肠癌中呈高表达。此外，cdk 抑制物如 P21、P27 等基因在
