1、褶纹冠蚌外套膜组织培养及蛋白质电泳特性研究吉林农业大学 2002,24(3):9295JournalofJilinAgriculturalUniversity褶纹冠蚌外套膜组织培养及蛋白质电泳特性研究钱伟平(绍兴文理学院生物系,浙江绍兴 312000)摘要:采用褶纹冠蚌的外套膜进行组织块培养,将培养后的组织块做切片和涂片观察,再用胰蛋白酶消化组织块成单细胞,培养后进行细胞计数.同时采用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳技术,比较了褶纹冠蚌的外套膜,珍珠囊,珍珠粉蛋白与经过培养的组织块蛋白的变化.试验结果表明:经过培养的组织块有旺盛的分泌活动,并会出现自溶现象.培养过程中细胞数量的增长呈现明显的规律
2、性,产生一个由快速增长到逐渐衰退的变化.外套膜与珍珠囊所含蛋白质基本相同,培养后的组织块蛋白质组分减少,珍珠粉蛋白质的电泳谱带明显少于外套膜与珍珠囊.关键词:褶纹冠蚌;外套膜;组织培养;细胞增殖;蛋白质电泳中图分类号:$966.222 文献标识码:A 文章编号:1000.5684(2002)03.009204StudiesonTheMantleTissueandProteinCharacterofCr/stariaplicataLeachQIANWeiping(DepartmentofBiology,ShaoxingArtsandScientificCollege,Shaoxing,Zheji
3、ang312000,China)Abstract:Inthisexperiment,themantletissuewerecultured,andSconstructionwasobservedundermicroscope.ThetissueweredispersedintosinglecellwhichCanbeculturedandcounted.Thecharacterofproteinsfrommantle,pearlsac,pearlandculturedtissuewerecomparedusingPAGEtechnique.Theresultsshowedthatthemant
4、letissuehavethephenomenonofsecretionandself-lysis.Thecellsdividedrapidlyatearlystageofculture,slowdownatlaterstage.Theproteinsfrommantleandpearlsacweresimilarwhiletheproteinfromculturedtissueismuchreduced.ThePAGEbandsofpearlwaslessthanthatofmantleandpearlsac.Keywords:CristariaplicataLeach;mantle;tis
5、suecuhure;cellmultiplication;proteincharacter褶纹冠蚌(CristariaplicataLeach) 是用于生产珍珠的母蚌之一.自然条件下,蚌的外套膜有分泌功能,其外缘突起能分泌形成贝壳角质层,背面表皮细胞分泌形成棱柱层.而珍珠层则是由外套膜的外表皮细胞分泌形成,这是珍珠生长的关键所在.关于珍珠形成的机理已有较多报道,对于外套膜的组织学,发育学,超微结构和珍珠囊形成过程和酶化学技术已进行了研究.通过育珠手术,在蚌体外套膜中植入异体的外套膜小片,可以刺激母蚌外套膜组织增生形成珍珠囊,然后在珍珠囊中不断沉积钙盐而形成珍珠.由此可见,外套膜小片的刺激是珍珠
6、生长的主要诱因,因而研究外套膜的分泌作用,细胞特性,离体后蛋白质成分所发生的变化等,对于探讨珍珠形成机理有一定的价值.同样,笔者通过研究外套膜组织的珍珠蛋白分泌作用,将有利于弄清珍珠沉积的机理,这对于提高珍珠产量,改善光泽,获得高等级珍珠可提供理论依据.-作者简介:钱伟平(1965 一).男,讲师.主要从事经济动物养殖学研究.收稿日期:20011211第 24 卷第 3 期钱伟平:褶纹冠蚌外套膜组织培养及蛋白质电泳特性研究 931 材料与方法 2 结果与分析1.1 材料试材取育珠龄 1 年的褶纹冠蚌;仪器主要有CO,培养箱,垂直电泳仪,细胞计数器,OLYMPUSBX50 摄影显微镜等,试剂主要
7、有组织培养试剂Hank 液,0.5%胰蛋白酶,70% 乙酸,琼脂,考马斯亮蓝 R250 等.1.2 方法1.2.1 材料灭菌配制 Hank 液培养基并调节pH 值为 6.87.0,然后与解剖用具,培养皿,纱布,青霉素瓶一起,在 121oI=下灭菌 30min.灭菌后置于无菌工作台中,倒平板备用.1.2.2 外套膜组织块培养 75%酒精棉球擦拭蚌壳外沿,打开蚌壳,用解剖刀取下外套膜组织,放人 75%酒精中 23S,取出置于灭菌后 Hank 液中并放于无菌操作台中.用无菌纱布擦去外套膜粘液,切成 1cnlX1cnl 的小块,接种到培养基上.每皿接种 34 个组织块,于 2527oI=下培养,逐 1
8、3 观察其变化.同时取组织块和分泌物做涂片,苏木精染色 23min,显微镜下观察并摄影.1.2.3 外套膜表皮细胞培养外套膜剪成 23mln,37oI=恒温水浴中用 0.5%胰蛋白酶液消化至组织块离散.用无菌纱布滤去组织块,得细胞原液,用 Hank 液稀释原液并计数.滴加0.0lg/mL 酚红 12 滴作指示剂,分装入青霉素瓶,在 C0培养箱于 2527oI=下培养,在 3,6,10,15d 分别取样计数.同时吸取培养物离心 10min(2000r/min),取其沉淀部分做涂片,苏木精染色,显微镜下观察其细胞形态.1.2.4 蛋白质电泳取褶纹冠蚌外套膜,珍珠囊,加适量生理盐水研磨成匀浆,离心
9、3min(3500r/rain),取上层液作为外套膜蛋白质样品和珍珠囊蛋白质样品.取珍珠 10g 加 1mol/LHCI,磁力搅拌器上 4ooI=水解 6h,离心,取白色絮状沉淀物加葡萄糖溶液研磨成匀浆,离心,取上层液作为珍珠蛋白质样品.取培养 10d 的组织块和分泌物,分别研磨后离心,取上层液体部分层液作为组织培养外套膜蛋白质样品.以上各样品加溴酚蓝 5 滴作为指示剂,进行 PAGE 凝胶不连续体系蛋白质电泳.考马斯亮蓝 R250 染色 1h,7%乙酸脱色,对图谱进行摄影并进行图像处理.2.1 组织块形态变化外套膜组织块培养 ld 后,组织块周围就出现了一圈分泌物,并且不断向周围扩散.对不同
10、培养时间分泌物的面积进行统计,见表 l.表 1 不同培养时间组织块分泌物的面积Table1Thesecretion,Sareaofmantletissueculturedfordifferenttimecm注:各组的组织块效分别为 34,34,42,36 个Nore:Theamountofspecimenineverygroupis34.34,42,36piece组织培养的第 3d,组织块形状未变,颜色为淡黄色,分泌物呈半透明;从第 4d 起,组织块颜色变深,分泌物呈乳白色,粘度增加;6d 后,分泌物中出现黑褐色斑点,同时组织块逐渐变薄;到第7d,组织块离散呈暗黄色粘稠状,与分泌物混合扩散;到
11、第 10d 已呈不规则弥散状,周边出现棕色斑点;10d 以后,组织块失去分泌能力,呈干皱状,分泌物变干.2.2 培养液的细胞计数和形态观察培养液经过均匀摇动,取样,在显微镜(10X40)下用血球计数板对经培养 015d 的培养液进行细胞数量计数,结果见表 2.表 2 不同培养日龄细胞数量统计Table2.Thecountofcellculturedfordifferenttime培养 6d 的细胞增殖显着,培养液由纯清变得稍显混浊.6d 后培养液出现较多的沉积物质,计数表明细胞增殖减缓.对培养 6d 后产生的沉积物质进行涂片,染色,在显微镜下观察,可以看到成团聚集的上皮细胞,个别细胞呈分散状,
12、见.图 l.吉林农业大学 2002 辱图 1 培养 6d 的上皮细胞形态Fig.1.Microscopeofcellculturedfor6day2.3 电泳图谱电泳图谱中条带出现的位置可定性某种蛋白质,而条带的宽度说明此种蛋白质的含量多少.图 2 是外套膜,珍珠囊,珍珠蛋白的对照电泳图谱,图谱中分为相同的 4 组.按加样槽孔计数,从左到右 l,2,3 孔为 A 组,加样 5L;4,5,6 孔为 B组,加样 10tL;7,8,9 孔为 C 组,加样 15L;10,11孔为 D 组,加样 20L.在 1,4,7,l0 孔加入外套膜(M)样品 ;2,5,8,1l 孔加入珍珠囊(PS)样品;3,6,
13、9 孔加入珍珠蛋白(PP)样品.可以看出外套膜和珍珠囊的谱带十分接近,而它们与珍珠蛋白的谱带相差较大.l23456789l0ll图 2 外套膜,珍珠囊,珍珠蛋白的电泳图谱Fig.2.PAGEpatternofmantle.pearlsacandpearl图 3 是培养后的外套膜,珍珠蛋白的对照图谱,同样分设 4 个组别并做不同样本量的 4 种处理.从左到右按电泳柱计数为 l7.其中 l,2 为A 组,加样 5L;3,4 为 B 组,加样 l0;5,6 为c 组,加样 l5rtL;7 为 D 组,加样 20L.在 l,3,5,7 孔中加入经过培养后的外套膜(CM)样品,在2,4,6 孔中加入珍珠
14、蛋白(PP)样品.电泳结果显示,经过培养后的外套膜的电泳谱带与珍珠蛋白有一定差异,但与图 2 比较,培养后的外套膜蛋白质组分数量处于珍珠囊与珍珠蛋白二者之间.】234567图 3 经过培养后外套膜,珍珠蛋白的电泳图谱Fig.3.PAGEpatternofculturedmantletissueandproteinofpearl图 4 是结合图 2,图 3 的电泳谱带位置所给出的模式图,4 条谱带从左到右分别为外套膜(M),珍珠囊(PS),培养后外套膜组织(CM),珍珠蛋白(PP).从中可以看出: 珍珠囊的电泳带与外套膜差异较小,即蛋白质种类接近.培养后的外套膜电泳条带显示有蛋白质缺失现象,而珍
15、珠蛋白所含种类缺损最多.MPSCMPP图 4 外套膜,珍珠囊,培养后外套膜组织,珍珠蛋白电泳模式图Fig.4.ThePAGEpatternofmantle.pearlsac.culturedmantletissueandpearlsprotein第 24 卷第 3 期钱伟平:褶纹冠蚌外套膜组织培养及蛋白质电泳特性研究 953 讨论褶纹冠蚌在珍珠形成过程中要经历初生珍珠囊的形成,溶解和次生珍珠囊的形成.初生珍珠囊是由植入的外套膜小片转变而来.从培养的外套膜组织块来看,6d 前后出现不同程度的自溶,10d 后的组织块完全“溶解 “,这是形成初生珍珠囊的初期变化阶段.这一阶段,组织块极强的分泌活动是
16、初生珍珠囊形成的刺激原,这一生理活动是建立在植入的外套膜细胞快速增殖的基础之上的.即珍珠的形成是由于受到外来的异体蛋白质刺激作用的结果.由于组织细胞活动的产物是分泌物,说明在分泌物中含有刺激母蚌形成珍珠囊的异体蛋白质.外来插片的组织增生能力和细胞活性是决定珍珠囊形成的关键因素.在外套膜组织培养中发现,其组织块的分泌活性持续约 10d,外套膜细胞的增殖也有一个由快到慢,最终趋于稳定的现象,10d 以后的组织和细胞均失去了生理活性.这说明在珍珠生长过程中,植片之后的 10d 是比较重要的时期,在育珠操作中应引起注意.初生珍珠囊形成后,不断地分泌蛋白质等有机质,次生珍珠囊仍具有分泌活动.外套膜与珍珠
17、囊的大多数蛋白质组分相同,这说明珍珠囊发源于外套膜,主要是通过外套膜表皮细胞的增殖而来.其中某些蛋白质条带的不同说明在育珠时期,珍珠囊内的蛋白质合成过程并不完全与外套膜相同,这正是珍珠形成的生理生化机制所在.珍珠蛋白组分的大量减少还说明另一个问题:珍珠蛋白质是由珍珠囊合成,分泌并最终沉积在珍珠之中的.在此过程中可能发生蛋白质的丢失,其机理有可能发生在珍珠囊液的生化反应中.另一方面,在珍珠囊发育的早期和晚期,珍珠囊上皮细胞能合成不同的蛋白质,这一点可从电泳图谱上得到证明.还有可能是珍珠囊不同时期的不同分泌机理造成最终形成珍珠蛋白时发生了变化,这一点目前尚未明了,有待进一步研究.珍珠蛋白质(PP)
18、的电泳带区位与外套膜(M),珍珠囊 (Ps),培养后外套膜组织(CM)的区位之间缺少相应位置的关联.造成这种现象的原因估计与试验处理中蛋白质的酸性水解(1mol/LHC1)有关.在水解条件下,蛋白质不同程度地被分解成多肽和氨基酸,正是由于蛋白质的完整性被水解破坏,因而通过这些图谱无法分析四者之间的相关性,但是这并不说明它们之间不具备相关性,相反,我们认为只有承认它们之间的相关性,才有可能搞清楚珍珠形成的机理.作为插片的外套膜小片,在培养前后发生了蛋白质组分变化,说明插片离体后,细胞停止了某些蛋白质的合成,据推断可能为某些酶类.其条带缺失现象证明培养后的组织细胞的分泌特性有所改变.这种改变实际上
19、决定着河蚌育珠生产上的插片成功率和珍珠质量.现行生产上的植片操作是利用外套膜小片的组织活性,它所带来的缺点就是植入点创口过大,小片易脱落,伤口易感染,从而产生大量空珠,污珠和不规则低档珍珠.鉴于细胞的活性是一切组织活性的基础,而且外套膜小片细胞的分泌活动是珍珠形成的起点,结合本试验的结果,建议在生产上应改变原有的划口植片方法,改用注射经过培养的组织提取液或活细胞.从理论上分析其原理和效果是一致的.参考文献:1胡曦璇,石安静 .背角无齿珍珠囊形成过程的组织学和酶组织化学研究J.水生生物.1995(6):139.144.2石安静.龚由彬 .椭圆背角无齿蚌外套膜组织培养与未培养细胞分泌活动的扫描电镜观察J.水生生物.1993(3):3539.3杜晓东,何海平 ,吴熙载.褶纹冠蚌珍珠囊发育的研究J.水生生物,1991(9):227 232.4杨汉民.细胞生物学实验M.北京:高等教育出版社.1997:8992.5李建武.余瑞元 .生物化学实验原理和方法M.北京:北京大学出版社.1994:272276.6戈贤平.河蚌育珠与珍珠加工技术问答M.北京:科学普及出版社.1996810.
