1、肝硬化患者红细胞型补体受体基因点突变与数量表达的变化?454?胃肠病学和肝病学杂志 2003 年 10 月第 12 卷第 5 期 ChinJGastroHepa,0ct!.!:肝硬化患者红细胞 I 型补体受体基因点突变与数量表达的变化张晓峰曾珍王海滨陈黎明王陆军韩玉坤耿华【摘要】目的动态观察肝炎肝硬化患者红细胞 I 型补体受体基因点突变与数量表达及其天然免疫黏附功能(erythrocytecellnature-immune-adhesi.nfIlncti.n,RNIAF)的变化,探讨它们在评估肝炎肝硬化病情严重程度中的应用价值.方法分别检测 134 例肝炎肝硬化不同分级的 I 型补体受体基因点
2、突变与数量表达及其 RNIAF 的变化.结果与正常人群相比较,肝硬化患者 I 型补体受体基因点突变率无统计学差异,而肝硬化 Child 分级各组的 CR1 数量表达及RNIAF 都明显低于正常人群组,且随着分级病情严重 ,CRI,RNIAF 逐渐降低 .结论红细胞 I 型补体受体活性及天然免疫黏附功能可灵敏地反映肝炎肝硬化患者病情的发展,红细胞 CRI及 RNIAF 可作为判断肝炎肝硬化病情严重程度的重要参考指标.【关键词】红细胞;基因点突变;天然免疫黏附功能;肝炎肝硬化Thechangesofgenomicdensitypolymorphism,qnarltitativeexpression
3、ofcomplementreceptortype1(CR1)andnature-immune-adhesionfunctionoferythrocytecellinpatientswithcirrhosisZHANGXiaofeng,zengZhen,WANGHaibin,etal3rdDepartmentof302ndHospital,ng100039,China【Abstract】ObjectiveTostudythechangesofgenomicdensitypolymorphism,quantitativeexpressionofcomplementreceptortype1(CR1
4、)anderythrocytecellnature?immune?adhesionfunctioninhepatocirrhosispatients,andinvestigatethesignificanceofCR1anderythrocytecellnatureimmuneadhesionfunction.whicheVa=hlatetheseverityofcirrhosis.MethodsTestedspotmutationratesoferythrocyteCR1densitygene,CR1,RNIAFin134hepatoeirrhosispatients.ResultsSpot
5、mutationratesoferythrocyteCR1densitygeneinhepatocirrhosispatientswerenotsignificantlydifferentwitIIthoseofhealthyindividuals.ButtheamountofCR1andRNIAFwassignificantlylowerthanthatofhealtllyindividuals.CR1andRNIAFweredecreasedordinallyfromChild?PughA,B,Crespectively.ConclusionDefectiveexpressionofCR1
6、inhepatocirrhosispatientsisacquierythrocytethroughcentraland/orperipheralmechanisms.CR1andRNIAFareimportantindexestoreflecttheseverityofliverfunctioninclinic.【KeyWords】Erythrocyte;Genespotmutation;Natureimmuneadhesionfunction;Hepatocirrhosis肝病患者红细胞 I 型补体(complementreceptortype1,CR1)受体的密度相关基因点突变及其红细胞
7、免疫黏附功能(erythrocytecellnatureimmuneadhesionfunction,RNF)与肝病的转归密切相关.我们对不同Child 分级的肝硬化患者的细胞 I 型补体受体的密度相关基因点突变,数量及其红细胞免疫黏附功能(crythrocytecellnmureimmuneadhesionfunction,RNIAF)表达进行检测,了解其与病情发展的相关性.报道如下.资料与方法一,病例来源肝炎肝硬化 134 例,按 ChildPu【ghgroup 分级,其中ChildA 级 66 例,ChildB 级 48 例,ChildC 级 20 例,均为中国人民解放军 302 医院住
8、院确诊病人,诊断符合作者单位:100039 北京,北京中国人民解放军第 302 医院感染三科2000 年全国传染病与寄生虫病学术会议修订标淮(西安).分别在入院时,入院后 30 天检测其肝功能,红细胞 RNIAF,PT/PA.并对病人进行病情积分 (白蛋白30g/L 为 3 分,3032g/L 为 2 分,3235L 为 1 分;总胆红素170ttmol/L 为 3 分,85170mol/L 为 2分,3485ttmol/L 为 1 分;PTA20%为 3 分,20%40%为 2 分,40%一 65%为 1 分;CHE2000 为 4 分 ,20003000 为 3 分,30004500 为
9、2 分,450054OO 为 1 分,累计相加的和为病情积分.75 例正常人为 302 医院体检的健康人群.二,研究方法1.红细胞 CR1 分子定量测定方法:根据文献(2)建立红细胞 CR1 分子测定方法,取 EDTA 抗差即为测定值.凝血用 PBS 洗涤 3 次 ,用戊二醛固定,用 PBS 配成 2%的红细胞悬液.取 25 红细胞悬液加入 v 型板,分别加入抗红细胞 CR1 分子一抗,碱性磷酸酶标记胃肠病学和肝病学杂志 2003 年 l0 月第 l2 卷第 5 期ChinJGastroHepa,Oct2003,Vo1.12,No.5的二抗抗体和相应底物.离心,吸取上层显色液于另一个干净 u
10、型板测定 405nm 吸光度(A405)值,设立空白对照,实验组 A405 值与空白对照之.2.红细胞 CR1 基因点突变测定:根据红细胞 CR1 分子基因中 1 个内含子点突变可使红细胞表达 CR1 分子减少,而通过 Hind酶切引物扩增的 1.8kb 的 DNA 片段,可获得 0.5I【b 和 1.3kb 两片段.据文献(3)设计引物 1:5.CCTIAI.cGAI.GGTGc 舡.3(4415.4435); 弓 I 物 2:5-CC.CrIGAAGcAAG13(引物 3 端距结构基因内含子Hir酶切位点 25.11bp)建立 PCR 技术.取 EDTA 抗凝血提取 DNA,进行 PCR
11、扩增,然后进行 Hind酶切,可将CR1 分子密度相关基因分为高表达(删,1.8kbl 条带),中表达(眦 ,1.8kb,1.3kb 和 0.5kb3 条带)和低表达(LL,1.3kb和 0.5kb2 条带)三种基因表达形式.3.红细胞 RNIAF 测定:50l 红细胞悬液(用自身血浆配成 1.25%)与 100l 新鲜配置的小鼠艾氏腹水肿瘤细胞悬液(1X106/ML)混匀.37,水浴 30rain.加 100 固定缓冲液轻轻摇匀,过夜阅片.阅片要求:取混匀液 150ttl 加瑞.吉氏染液混匀,悬浮涂片(玻片的2/3),分上,中,下;左,中,右 9 区阅片,每区阅读 1012 个肿瘤细胞,结合
12、 5 个及以上红细胞的肿瘤细胞为一个结合单位,计算黏附率.4.统计学处理:采用 Students 检验和检验.结果一,肝硬化患者红细胞 C 砌基因点突变与其瑚-AF 的变化的关系不同分级的肝硬化患者红细胞 CR1 基因点突变与正常人比较差异无显着意义(P0.05).而肝硬化Child 分级各组的 CR1 数量表达及 RNIAF 都明显低于正常人群组,且随着分级病情严重,CR1,RNIAF 逐渐降低,其差异有显着意义(P0.01)(见表 1).表 1 肝硬化患者红细胞 I 型补体受体密度相关基因点突变与数量及 RIqlAlr 的变化二,各型肝硬化患者红细胞 CRI 基因点突变与其数量表达,在 C
13、hildA,B,C 级各组,基因点突变为 HH 病人的CR1 均高于基因点突变为 HL 及 LL 的患者其差异有统计学意义(P0.05),基因点突变为 HL 的患者 CR1 与LL 比较,差异有统计学意义(P0.05)(见表 2).表 2 肝硬化红细胞 CR1 基因点突变对数量表达的影响三,红细胞 CRI 基因点突变及其 RNIAF 变化与肝硬化治疗效果的关系在 CxildA,B,C 级各组,基因点型为 HH 病人的RNIAF 均高于基因点突变为 HL 及 LL 的患者,其差异有统计学意义(P0.05),基因点突变为 HL 的患者RNIAF 与 LL 比较,差异无统计学意义(P0.05)( 见
14、表 3).临床分析发现:在 ChildA,B 级的肝硬化病人中,基因点型为 HH 的病人好转率高达 95%以上,基因点突变为 HL 及 LL 的患者好转率为 85%,在 ChildC级病人,基因点突变为 HH 的患者好转率为 54.4%,而HL 或 LL 的病人好转率为 33.3%.表 3 肝硬化红细胞 CR1 基因点突变对 RIqlAlr 变化的影响讨论红细胞 CR1 具有许多重要的免疫功能,该受体的数量与位于 1 号染色体补体受体激活调节区内 7.4 和6.9kbHind片段有关 HJ,研究表明,该基因若发生点突变,将影响红细胞 CR1 的数量的表达,从而对红细胞CR1 分子免疫黏附功能产
15、生影响,红细胞 CR1 的活性,数量与许多疾病密切相关.病毒性肝炎是肝硬化发生的首要病因,病毒性肝炎由于持续病毒复制,机体免疫应答过程中产生的病毒抗体,自身抗体,抗原抗体复合物及补体复合物等物胃肠病学和肝病学杂志 2003 年 l0 月第 l2 卷第 5 期ChinJGastroHelm,Oct2003,Vo1.12,No.5质,是导致肝细胞持续慢性损害的主要原因_5J,因此 ,机体清除病毒颗粒,病毒抗原及抗原抗体复合物等物质的能力,将直接反映肝脏功能受损的程度.红细胞广泛表达的补体一型受体(Complementreceptortypel,CR1)成簇分布,具有重要的天然免疫黏附功能_6J,不
16、但能黏附循环中的抗原抗体复合物等物质,将其运输到肝脏及脾脏中销毁,而且还将循环抗原“提呈“ 淋巴细胞 J.因此,红细胞的天然免疫黏附功能与肝功能损伤状况密切相关.本研究发现:肝炎肝硬化 Child 分型的各型病人红细胞 CR1 基因点突变率与正常人无差异,但其数量的表达及 RNIAF 随着疾病严重程度的加重而降低,认为CR1 数量及 RNIAF 的降低系后天获得,与疾病本身的因素有关.因此,可以认为肝硬化患者红细胞 CR1 活性降低与肝炎肝硬化的发生有相关性,RNIAF 可以提示疾病的预后:肝炎肝硬化的病人在肝硬化发生之前,已有病毒感染史,病毒在肝脏细胞内生长繁殖造成肝脏单核一巨噬系统功能损害
17、,使红细胞携带 Ic 的不易被清除,致 Ic 蓄积,过多 Ic 长期刺激肝脏,引起肝纤维化,最终形成肝硬化.当肝脏严重受损时,Ic激活补体,使 CR1 降解增加;占据 C3b/C4b 的结合位点使 CR1 功能失效 J 肝硬化合并脾脏功能亢进时 ,红细胞破坏增加,使红细胞 CR1 总数减少等,如上因素都可导致红细胞天然免疫黏附功能降低,使红细胞对白细胞免疫功能的调控和促进作用减弱.白细胞免疫功能的减弱势必影响到免疫监视,免疫防御及免疫自稳等功能,从而影响疾病的预后.本文结果提示:在各型肝硬化患者(Child.Pugh 分型)中,HH 基因型患者红细胞 cm 数量及 RNIAF 均高于 HL,L
18、L 型,且 HH 型病人病情预后明显好于基因点突变型患者,这说明 CRI 活性及 RNIAF 的高低能提示病情的预后,因此 CR1 活性及 RNIAF 的变化可考虑作为临床肝病病情严重程度的重要判断指标.参考文献1】王海滨 ,张景萍,王辉,等.红细胞 CR1 分子的定量测定及其临床意义.中华微生物及免疫学杂志,2000,20(4):381 384.2CornilletP,PhilberF,KazatchkineMD,eta1.Genomicdetermination0fthe?CRI(CD35)densityp0lymDI,lIi 哪 onerythytestlsingpolymareseeh
19、einreactionamplificationandHindmrestrletionenzylDedigestion.Jlmnm,aolMethods,1991,136(2):193.197.3WongwW,CahillJM,RosenMD,eta1.ctureofthehmnanCRlsene.Moleculartlsi8ofthestnwturalandquantitativepolymorphismsandidantificationofanewCRIlikeallele.JE 砷 Med,1989,169(3):847.863.4DiBonaD,MotaltoG,ClemenzaL,
20、eta1.Solublecomplementreeeptotype1($cR1)inchronicfiverdisease:8enmlevehatdifferentstagesoferdis.eases.ClinEIpImmunol,1998,114(1):102.105.【5KantoT,HayashiN,TakehareT,eta1.Lowexpression0feIytlI10cytCornplemontreceptortype1inchronichepatitisCpaient.JMedViro1.1996,50(2):126-134.6王海滨,钱宝华 ,郭蜂,等.肝病患者红细胞 CR
21、1 分子基因型及数量表达的变化.中华肝脏病学杂志,200O,15(6):380-382.【7JSadallahS,GiostraE,MentlmG,eta1.Increasedlevelsofsolublec0 唧.meritreceptor1in8rulnpatient8withliverdiseases.Hepatolol,1996,24(I):Il8.122.8CosioFG,ShenXP,BirminghamDJ,eta1.Evaluationofthemeehanimsponaibleforthereduefianin 目 ythmcytecomplemeatreceptorswho
22、nimmunecomplexesforminvivoinprinmtes.1mmunol,1990,145(12):41984206.9EdhergJC,WrightE,Taylorlip.Quantitativeanalysesofthebinding0fsolublecomplement?fdn8antlhedy/dsDNA_Hu 把 complexestoCRIonhum8nelllIocytebloodcells.JiMMUNOL,1987,139(II):37393747.收稿日期:2O03-09-09关于向本刊投稿的几点意见一,一稿多投,一稿多发的再建议从上次刊出有关这一问题的几点
23、建议之后,此种现象有所改进.但在我们的工作中仍时有发现,深感有再次提出的必要.因为多投会增加多个杂志社的编审任务.多登更会造成纸张和印刷浪费.本刊规定自收到稿件之日起之后的半年时间为编委审阅讨论定稿时间,如作者拟改投它刊,请事先函告.此外,因种种原因个别编委未在规定时间未能按时将稿件返回编辑部的情况也是有的.现将本刊来稿约要求简述如下:1.来稿请附单位介绍信,并同时寄来审稿费.稿件需打印,一式两份.2.来稿请注明无一稿两投.并注明作者名字的排列顺序无争议.3.本人同意编辑部对稿件作内容及文字修改.4.同意来稿被转载,被中国学术期刊(光盘)等收录.二,综述,专题,短篇文稿请参考 2003 年本刊规定的格式.写出中文关键词,英文题目,英文关键词,英文第一作者的通讯地址.三,来稿请留第一作者或通讯作者的联系方式:电话 ,手机,Email.四,欢迎临床实践中的稿件,不论长篇论着或短篇报道均需有新意.只要有一管之见都会对读者有启发.低水平的重复稿件一般不会采用.五,来稿除 1 份打印稿外,还须寄来存有本文稿的光盘.六,来稿须付稿件处理费 20 元,来稿一经确认刊登,须按通知数额付版面费.七,论文所涉及的课题如取得国家或部,省级以上基金或属攻关项目,应脚注于文稿首页左下方,并附基金证书复印件.
