1、肝癌细胞增殖受 MCSF 胞内和胞外自分泌的双重调控?2382?文章编号10004718(2005)12238206中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology2005,21(12):23822387肝癌细胞增殖受 MCSF 胞内和胞外自分泌的双重调控*张蒙夏 I,罗红梅,唐圣松,雷小勇,龙治锋,张晓红,汪煜华(南华大学 医学院 ,药物药理研究所药物蛋白质组学研究室,湖南衡阳 421001)摘要目的:研究胞内 MCSF 及其受体在肝癌 SMMC7721 细胞的表达与性质,探讨胞内 MCSF 对 SMMC7721 细胞增殖的影响及其机制方法:以高表达 MCSF
2、 的人肝癌细胞系(SMMC7721 细胞)为模型 ,以免疫组化,流式细胞计数,反义技术与蛋白印迹等方法观测胞内 MCSF 对 SMMC7721 细胞增殖的影响及其机制.结果:MCSF及其受体主要在 SMMC7721 细胞的胞质,胞核中表达,胞内的 MCSF 的相对分子量为 20000,MCSFR 的相对分子量为 1200130;免疫共沉淀分析证明 MCSF 在细胞内与 MCSFR 以复合物的形式存在;M CSF 的单克隆抗体及其反义寡聚核苷酸能抑制 SMMC7721 细胞的增殖,下调 cyclinD1/E 的表达和上调p16 的表达,且 MCSF 的单克隆抗体及其反义寡聚核苷酸的联合使厢能进一
3、步加强对 SMMC7721 细胞抑制作用和增加下调 cyclinD1/E 和上调 p16 的表达幅度.结论:SMMC7721 细胞受 MCSF 胞外自分泌和胞内自分泌的双重调控.关键词 巨噬细胞集落刺激闪子;SMMC7721 细胞;肝肿瘤【中图分类号R363【文献标识码AProliferationofhumanhepatomacellsareregulatedbytheintracrineandan-tocrineloopofthemacrophagecolony-stimulatingfactorsystemZIANGMengxia,LUOHongmei,TANGShengsong 一,LE
4、IXiaoyong2,IJ0NGZhifeng,ZHANGXia0 一 hong,WANGYuhu(MedicalCollege,DivisionofPharnuwoproteomb,ProteomicslmtituteofPhamtacyandPharmacology,NanhtUniversity,Henang421001,China)ABSTRACTAIM:Tostudytheexpressionandcharacterizationofintraeellularmacrophagecolonystimulatingfactor(MCSF)inhumanhepatomacelFline,
5、SMMC7721cell,andtoexplorethemechanismbywhichMCSFregulatesthepmliferationofhumanhepatomacells.METHODS:Theinununohistochemicalstaining,flowcytometry,antiserrtechniqueandWesternblottingwereusedtostudytheeffectsandmechanismsofintracellularMCSFontheproliferationofhumanhepatomacells.RE-SULTS:SMMC7721cells
6、hi;l1JyexpressedMCSFanditsreceptor.ThelocalizationofpositivereactionswasmainlyincytoplasmaandnucleusinSMMC7721cells.Incytoplasmaandnucleus,oneiformsofMCSFwasfoundwiththemolecularweight(MW)of20kD,whileonetypeofMCSFRWasdiscoveredwithMWof120kD.1nununopvecipitationassayshowedthattheselig?andsexistentinb
7、indingwithitsreceptor.Monoclonalantibody(McAb)againstMCSFandantisenseoligodeoxynucleotides(ASODN)blockingMCSFexpressioninhibitedtheproliferationofSMMC7721cells.McAbandASODNregulatedtheexpressionofcyclinDI/Eandp16.SimultaneousadnfinistmtionofbothMcAbandASODNinhibitedtheproliferationofSMMC7721cellsand
8、modulatedtheexpressionofcyclinsatgreaterdegrees.CONCLUSION:OurresultssuggestthatallautocrineandanintracneloopofMCSF/MCSFRarepresentinSMMC7721cells.KEYWORDSMacmphagecolonystimulatingfactor;SMMC7721cells;Liverneoplasms巨噬细胞集落因子(macrophagecolonystimulatingfactor,MCSF)是一个功能多样,结构复杂,有多种异型体(isoform)的细胞因子 ,研
9、究表明:可溶性 MCSF(solubleMCSF,SMCSF)通过胞外自分泌收稿日期20050415 修回日期2005 0627*基金项目 国家自然科学基金资助项日(No.30270684);湖南省杰出中青年专家专项基金资助项目(No.02JJYB004);湖南省自然科学基金重点项目(No.04JJ2006)通讯作者 Tel:o7348282854;Email:和旁分泌发挥作用,与多种生理和病理过程密切相关,膜结合型 MCSF(membraneassociatedMCSF,mMCSF)通过并置性刺激 ,发挥细胞因子和粘附分子双重作用_20;此外 mMCSF 可介导 MCSF 可溶性受体的内吞,
10、并把胞外信号传人胞内 ,有受体样作用_4.5J.已有报道:很多肿瘤细胞都高表达胞质和胞核 MCSF 及其受体_6,这些异型 MCSF 与肿瘤的转移和预后密切相关,但机制不清_6J,那么它们是否通过 intracrine 在肿瘤细胞 automation中发挥作用呢? 针对这个问题 ,本文以高表达胞质和胞核异型 MCSF 的人肝癌细胞系为实验体系,研究 MCSF 对肝癌 SMMC7721 细胞增殖的影响,旨在探讨肝癌细胞自律性生长的机制.材料和方法1 细胞培养人肝癌细胞系 SMMC772l 细胞培养于 RPMI 一1640 培养液,其中含 10%(V/V)FBS,1lO5U/L 青霉素,100m
11、e/L 链霉素 ,在 37oC,5%co2,饱和湿度条件下培养;取对数生长期细胞涂片,ABC 免疫酶标染色.2 寡聚核苷酸的制备MCSF 的反义寡聚核苷酸(ASODN)和正义寡聚核苷酸(SODN)根据文献【J 提供的 MCSFcDNA设计,互补于 MCSF 起始密码下游 117 号密码子,经全硫代修饰,由 Sangon 公司合成,其序列为:SODN:5一 atgaccgcgcggggcgc 一 3;ASODN:5一gcgCCCcgcgcgat 一 3.3ABC 免疫酶标按常规方法进行.抗 MCSFR 单克隆抗体(MCSFRMcAb)和抗 MCSF 单克隆抗体(MCSFMcAb),其特异性结合区
12、为 MCSFR 或 MCSF的氨基端,抗 MCSFR 多克隆抗体购于晶美公司;生物素标记的羊抗小鼠单抗,卵白素标记的辣根过氧化物酶为 Vector 产品 .4 细胞质和细胞核蛋白的提取和免疫共沉淀取 310“/L 细胞,PBS 洗细胞 3 次,低渗缓冲液(10mmol/LHepes,pH7.9,1.5mmol/LMgC12,10mmol/LKC1,0.2mmol/LPMSF,10mg/Laprotinin,10mg/Lleupeptin)洗细胞 1 次 ,4oC,1850g 离心,细胞重悬低渗缓冲液,冰上溶胀 30min,匀浆 10min,4cc3300g 离心 15rain,上清为粗提取物,
13、沉淀物依次加入低盐缓冲液(20mmol/LHepes,pH7.9,25%甘油,1.5nunol/LMgCl2,20mmol/LKC1,0.2mmol/LPMSF,0.2mmol/LEDTA,10mg/Lapmtinin,10mgLleupeptin)和高盐缓冲液(20mmol/LHepes,pH7.9,?2383?25%甘油 ,1.5mmol/LMgCl2,1.2mol/LKC1,0.2nunol/LEDTA,0.2mmol/LPMSF,10mg/Laprotinin,10mg/Lleupeptin)匀浆,4cc,16500g 离心,上清为胞核提取物;胞质粗提取物加入 10胞质提取缓冲液(0.
14、3mol/LHepes,1.4mol/LKC1,0.03mol/LMgCl,),4oC,100000g 离心 1h,上清为胞质提取物.取细胞质和细胞核提取液 100,加入抗 MCSFR 多抗(IgG,1:200 稀释),置 4处反应 24h,阴性对照加抗 p16 多抗(IgG,1:50);加入 50LproteinAsephamseCL 一 4B,置 4cc 振摇反应 2h;离心沉淀,用裂解液漂洗沉淀 3 次,离心弃上清.5 蛋白免疫印迹(Westernblotting)细胞质,细胞核提取液和免疫沉淀物加还原性上样缓冲液煮沸后,SDS 一聚丙烯酰胺电泳,转膜,用5%的脱脂奶粉的 TBS 缓冲液
15、(20mmol/LTfis,0.05%Tween,0.5mol/LNaC1)封闭 ;细胞质,细胞核提取液首先分别用 MCSFMcAb 和 MCSFRMcAb,免疫沉淀物用 MCSFMcAb 孵育,洗膜;然后用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体孵育,洗膜;0.1%NiC1 的 DABH2O2 显色.6MCSFMcAb,SoDN 和;IDDN 对肝癌7721 细胞生长的影响将细胞 4lOs/IJ 接种 24 孑 L 培养板,分别加入一定浓度的 MCSFMcAb,MCSF 的 SODN 和 ASODN,对照管分别用 PBS 替代 MCSFMcAb,SODN 和 ASODN,37oC,5%CO2 培养
16、48h 台盼蓝染色,细胞计数,抑制率按下述公式计算:抑制率:(对照组细胞数一实验组细胞数/对照组细胞数)l00%.7 细胞周期分析用 CycleTESTTMPLUSDNARegentKit(BectonDickinSODN),按制造商说明进行,FACScan(BectonDickinSODN)测定荧光强度.8 肝癌 SMMC7721 细胞中 MCSF,cyclinD1/E,CDK2/6 和 p16 表达水平的测定取 110 细胞,用含 1%甲醛的 PBS 在冰浴中固定 15min,PBS 漂洗,220 g 离心 5min;并用 80%乙醇在一 20cc 的环境下固定 l015min,220g
17、离心 5min,PBS 漂洗;加入 0.25%Triton 一 100,冰浴 5min,PBS 漂洗 ,220g 离心 5min;然后分别用 MCSFMcAb,cyclinD1,cyclinE,Cdk2,Cdk4 和 p16 抗体(SataCruz,1:50)室温孵育 45min,PBS 漂洗细胞 2次;加入 FITC 标记的抗小鼠 IsG(Vector),室温孵育30min,PBS 漂洗细胞 2 次 ;用 PBS 替代一抗作为阴?2384?性对照,细胞的荧光强度用流式细胞仪(BectonDick-inSOON)N 定.9 统计学处理实验数据以均数标准差表示,差异显着性检验采用非配对 t 检验
18、分析.应 WindowsSPSS10.0软件分析数据.结果1MCSF 及其受体(MCSFR) 在肝癌 SMMC7721 细胞中的表达及存在形式免疫组织化学显示:肝癌 SMMC7721 细胞能表达 MCSF 及其受体,阳性定位在细胞膜,细胞质和细胞核;流式细胞计数显示:SMMC7721 细胞表达 MCSF 的总阳性率为 88.7%,其中细胞膜阳性率为8O.3%,细胞质加细胞核的阳性率为 78.6%;SMMC7721 细胞表达 MCSFR 的总阳性率为 89.7%,其中细胞膜阳性率为 85.4%,细胞质加细胞核的阳性率为 72.7%.蛋白免疫印迹结果显示:SMMC7721 细胞的胞质和胞核都存在一
19、种分子量为 20000 的 MCSF 和一种分子量为 120000 的 MCSFR(图 1).免疫共沉淀分析显示:细胞质和细胞核的 MCSF 被抗 MCSFR 多抗沉淀 (图 1),细胞内的 MCSF 和 MCS.FR 能形成复合物.CFiglCoplasmaandnuclearMCSFandMCSFRinHL 一 60cells.A:coplasma(1ane1)andnuclear(1ane2)extraewereNottedwithMeAbagainstMCSF.B:coplasma(1ane1)andnuclear(1ane2)extmctswere_.blottedwithMeAba
20、gainstMCSFR.C:nuclear(1aneland2)andcoplasma(1ane3and4)extrdctswereNottedwithMcAbagainstMCSF.图 1 肝癌 SMMC772l 细胞胞质和胞核 MCSF 与 MCS.FR 的表达及其相互作用分析2MCSFMcAb 对肝癌 C7721 细胞增殖的抑制作用在培养的细胞中加入 MCSFMcAb 以阻断细胞外的 MCSF,结果显示:MCSFMcAb 能抑制SMMC7721 细胞增殖 ,这种抑制作用有剂量和时间依赖性(图 2);细胞周期分析表明 :MCSFMeAl,能增加 Go/G.期的细胞百分数(45.5%56.2
21、%),降低 S 期的细胞百分数 (48.9%38.2%).这些结果提示:SMMC7721 细胞增殖依赖于 MCSF 胞外自分泌.3ASODN 对肝癌 SMMC7721 细胞增殖的抑制作用用 ASODN 处理细胞,免疫荧光和流式细胞计数技术分析显示:ASODN 能抑制 MCSF 的表达,而SODN 对 MCSF 的表达几乎无影响(图 3);同时,A.SODN 能抑制 SMMC7721 细胞增殖,而 lCSF 的正义寡聚核苷酸(SODN)对细胞增殖的影响很小(图4);细胞周期分析显示:ASODN 能增加 GoG.期细胞百分数(45.5%61.3%),降低 S 期细胞百分数(48.9%34.5%),
22、而 SODN 几乎不改变细胞在细胞周期各时相中的比例.并且 ASODN 的这种抑制是可逆的,当用培养液洗去 ASODN 时,SMMC7721 细胞的 MCSF 表达水平得以恢复(图 3).这些结果提示:SMMC7721 细胞的增殖依赖于细胞内源性 MCSF 的表达 .4 抗 MCSF 的单克隆抗体及其反义寡核苷酸联合使用对肝癌 SMMC7721 细胞增殖的协同抑制作用用 ASODN 和 MCSFMcAb 混合液处理细胞48h,结果表明:ASODN 和 MCSFMcAb 混合液比单一的 ASODN 或 MCSFMcAb 抑制细胞增殖的能力增强,而 SODN 和 MCSFMcAb 混合液与单一的
23、MCSFMcAb 抑制细胞增殖的能力无明显差异(图 4).分析 ASODN 和 MCSFMeAl,混合液对SMMC7721 细胞周期影响的结果显示:ASODN 和 MCSFMcAb 混合液能增加 GoG.期细胞百分数(45.5%68.6%),降低 S 期细胞百分数 (48.9%22.7%);而 SODN 和 MCSFMcAb 的混合液只能轻度增加 GoGl 期细胞百分数(45.5%55.5%),降低 S 期细胞百分数 (48.9%39.9%),与 MCSFMcAb 的单独效应基本一致,当洗去培养液中的 MCSFMcAb 和 ASODN 时 ,细胞增殖得以恢复,说明这种抑制作用的可逆性.这些结果
24、表明 ASODN和 MCSFMcAb 有协同抑制 SMMC7721 细胞生长的作用,提示:SMMC7721 细胞中存在 MCSF 胞内自分泌作用.70605040302Ol0024h48h?2385?TheconcentrationofM-CSF-McAb(mg/LFig2TheinhibitoryeffectofMCSFMcM3OilSMMC7721cellproliferation.aandb:thedoseandtimedependenteffectofMCSFMcAbonSMMC7721cellproliferation,respectively.图 2MCSFMcAb 对肝癌 SMMC7721 细胞增殖抑制作用t-0EjC=0URelativetuorescencedensity
