1、干扰素 -2b 长效注射微球的制备和体外释药成团.加入 5 一溴.2 一脱氧脲苷后见少量细胞溶解坏死.72h 后部分细胞伸出典型突起且少数突起相互连接,细胞呈梭形或多边形生长.5d 后有明显突起的细胞增多,细胞数目明显减少.3.2Nissel 体染色检查胞膜完整的细胞中大部分为 Nissel 体阳性染色细胞,表明存活细胞中大部分为视网膜神经细胞:3.3 视网膜神经细胞(RN)活性与空白对照组比较,维拉帕米,尼莫地平质量浓度大于 33 哗?L 时吸光度值明显降低(P0.05,P0.01),表明高质量浓度使活细胞数目减少,抑制RN 存活; 而尼莫地平质量浓度为 0.5,l,2,4H?L时其吸光度明
2、显升高(P0.05),表明其呵使活细胞数目增加,促进 RN 存活.见表 1.表 1 维拉帕米,尼莫地平对培养视网膜神经细胞存活的影响.n:8,戈sTab1EffectofverapanfilandnimodipineonlivingofrelinaneuIonsinvitro,n:8,膏s注:对照组比较,1P005,2)P(0,0lNotemc.mI,dgroup,P(0.05,P(0.叭(收稿日期:2004-10-24)干扰素 Q.2b 长效注射微球的制备和体外释药吴诚,尹东锋,鲁莹,钟延强(第一二军医大学药学院药剂学教研室,上海 200433)中图分类号:R943,41 文献标识码:A 文
3、章编号:10012494(2005)15119703干扰素 a 一 2b(IFNIa 一 2b)属蛋白质类药物,在临床上广泛用于治疗多种病毒性疾病和恶性肿瘤,但其生物半衰期短,需频繁注射给药,给病人用药带来了很大的便.本研究采用聚乳酸.羟基醋酸共聚物(PI 一GA)将 IFN 廿 2I)包被成微球,通过微球内部的孔道以及高分子材料的融蚀降解来凋控 IFN 一一 2b 住体外的释放.从而制得了于扰素 a 一 2b 长效微球注射剂.1 仪器与材料超声乳化仪(美国 Brmlson 公司);CARY100 紫外分光光度仪(美国 Varian 公司);日立 S 一 6OOO 型扫描电镜(日本 Hitat
4、?hi 公司);IS230 激光粒度分析仪(美国 Coulters 仪器公司);离心超滤浓缩管( 截留相对分子质量 10000,泽泉科技有限公司)干扰素 a 一 2h 原液(上海万兴生物制药有限公司);PLGA(IA GA=50:50,ResomerRG503H,特性黏度 0.4dl?g,德国 BoehringerIngelheim 公司);PIGA(LAGA=50:50,特性黏度 0.19dl?g,美国 BirminghamPolymers 公司); 聚乙烯醇 1788(PVAI788,北京有机化工厂);叠氮钠( 纯度 99.9%,AMERSON分装);BCA 含量测定试剂盒(美国 Pier
5、ce 公司);二氯甲烷,十二烷基硫酸钠(SDS)等其他试剂均为分析纯.2 实验方法2.1 微球的制备取一定体积 IFN 心 2b 原液,加入 10%甘露醇等保护剂,冷冻干燥 24h,得 IFNa 一 2b 冻于粉.用 10nuno?LpH6.8 磷酸盐缓冲液将冻干粉重新溶解作为内水相,与 PLGA 的二氯甲烷溶液混合,冰浴条件下超声乳化制成初乳,将初乳滴加到 PVA 水溶液中,高速搅拌 2min 得复乳,并将其立即用蒸馏水稀释,低速搅拌 4h,离心收集微球,蒸馏水洗涤 3 次,冷冻干燥 24h 得微球干粉.部分处方在微球制备前对 IFN 心 2b 原液进行了超滤处理,将其经离心超滤浓缩管超滤浓
6、缩除盐,并将缓冲系统更换为 50mmol?LpH7.4 磷酸盐缓冲液.2.2 微球包封率的测定精密称取含药微球约 l0 哗,加入 5,0mL0.1tool?LNaOH/0.5%SDS,37cI=水浴振荡 24h,使微球完全溶解,加 2tool?LHCI 调 pH 约为 7.0,用 BCA 法测定蛋白质含量.包封率(%)=PLGA 微球中 IFN.a2b 测得含量/投药量(mg?mg)100%.2.3 微球的形态,粒径大小和分布取 IFNa 一 2b 微球冻干粉适量,采用日立 S 一 6OO0基金项目:国家科技部资助课题(2004AA2Z3390)作者简介:吴诚,男,硕士通讯作者:钟延强,男,博
7、士,副教授 Tel:(o21)25070392Fax:(o21)65491664E-mail:yqzhong68hot_mail.corn国药学杂志 2OO5 年 8 月第 40 卷第 l5 期ChinPhannJ.2005Auguat.Vo1.40No.15f197电子扫描显微镜观察微球的形状和表面形态.取微球混悬液 3n,采用 IS230 激光粒径测定仪测定粒径大小和分布.2.4 体外释放实验精密称取含药微球 1030mg 置玻璃离心管中,加入 1.5n10mmol?LpH7.4 磷酸盐缓冲液(含 0.02%叠氮钠 ,0.02%F-68),置于恒温水浴摇床中,在 100rmin,(370.
8、5)条件下进行微球的体外释放度测定.取样时将全部释放介质取出并更换新的释放介质,用 BCA 法测定 IFN-Q_2b 的含量.2.5IFNd 一 2b 生物学活性的测定取微球 35mg,用 1mL 丙酮和二氯甲烷的?昆合溶剂(1:1)溶解 ,涡旋并适当水浴超声 ,高速离心去上清,重复 3 次,完全去除 PLGA 后真空干燥 2h,蛋白残渣用适量 pH7.4 磷酸盐缓冲液溶解,并用0.45tun 微孔滤膜过滤,按 2000 年版中国生物制品规程采用细胞病变抑制法(CPE)测定滤液中 IFN-Q-2b 的生物学活性.3 结果3.1 微球的理化性质扫描电镜下观察到的微球冻干粉呈球形,分布较均匀,放大
9、的电镜照片表明,微球表面具有许多细小的孔洞,是制备微球过程中二氯甲烷被萃取挥发所致.优化处方微球的平均粒径为(5027)m,包封率为 87%.3.2 处方工艺对微球释放特性的影响3.2.1IFNIa-2b 原液经超滤处理对微球释放特性的影响文献对于内水相的渗透压考察报道较少,但实验发现 IFN-Q-2b 原液超滤处理后显着影响 IFNa 一 2b 微球的体外释放特性.干扰素原液超滤的处理方法见“2.1“项下,体外释放曲线见图 1.,一:】t/d图 1IFN-2b 原液经超滤处理对微球体外释放特性的影响1 一未处理,PLGA100g?L 一:2 一未处理,PLGA160gL 一;3 一超滤,PL
10、GA100gL 一:4 一超滤,PIGA160gLng1EffectofultrafihrationofIFNa 一 2bbulkOnreleasebehaviorofmicrospheres1 一 untreated.PLGA100g?L 一:2 一 untreated,PIGA160gL 一;3 一 ultrafitrated,PIGA100gL 一:4 一 ultrafitrated.PIGA160gL 一-1198?Ch/nPharmJ2005AugustVo1.4oNo.15原液经超滤除盐后制备的微球突释效应显着减小,且用油相质量浓度为 160g?LPIGA 制备的微球释放也显着加快
11、.由于制备微球时的内水相较IFN-Q_2b 原液浓缩了约 40 倍,因而原液未经超滤处理可能导致内水相渗透压过高,在制备复乳的搅拌过程中外水相容易进入内水相.实验中也观察到原液未经处理制备的微球体积膨胀,密度减小,数量反而增多,因而突释效应增大.3.2.2PLGA 特性黏度(inherentviscosity,1V)对微球释放特性的影响微球的降解速度是影响微球体内外释药的关键因素.实验中采用了两种规格的 PLGA,特性黏度分别为 0.19 和 0.4dl?g,考察了 PIJ.GA 的特性黏度对微球释放特性的影响.体外释放曲线见图 2.40t/d图 2PIGA 特性黏度对于微球体外释放特性的影响
12、1 一=019;2 一=0.4Fig2EffectofinherentviscosityofPI;AOnreleasebehaviorofmicmspheres1 一=0.19;2 一=0.4实验表明,PLGA 的特性黏度对微球的突释效应影响较小,但可显着影响微球中 IFN-Q-2b 的释放速度.用特性黏度为 0.19dl?g 的 PLGA 制备的微球其释放速度显着加快.3.3 微球中干扰素 a.2b 的生物学活性3.3.1 未经释放的微球中 IFN-Q_2b 生物学活性的测定测定结果表明,微球中 IFN-Q-2b 生物学活性未明显下降,IFN-Q-2b 和保护剂甘露醇质量比为 1:5时,从微
13、球中提取出来的 IFN-Q-2b 的比活性是原液比活性的 91%,说明甘露醇在制备工艺过程中对IFNIa 一 2b 起到了较好的保护作用.3.3.2 体外释放过程中微球中 IFN-a-2b 生物学活性的测定将 IFN-Q_2b 一甘露醇=1:5 的处方进行了体外释放实验,并测定了体外释放过程中从微球中提取出来的 IFN-Q 一 2b 的比活性,以未经释放的微球中 IFN-Q_2b 的比活性作为参照,定为 100%.实验结果见表 1.从表 1 可见,在体外释放过程中微球中的 IFN.中国药学杂志 20O5 年 8 月第 4o 卷第 l5表 1 体外释放过程中 IFN-cc-2b 的生物学活性Ta
14、b1BiologicalactivityofIFN-c-2bfrommicrospheresduringinvitroreleasea 一 2b 稳定性下降 ,且随着释放时间的延长 ,比活性也呈下降趋势.4 讨论甘露醇在冷冻干燥和制备工艺过程中对 IFN 心2b 起到了较好的保护作用,但在体外释放过程中,微球中的 IFN 心 2b 生物学活性明显降低.因此体外释放过程中如何提高微球中 IFN 心 2b 的稳定性,维持其生物学活性还有待于进一步研究.(收稿 13 期:2004.1119)太子参醇提物对自然衰老大鼠组织一氧化氮合酶的影响袁逸铭,高湘,许爱霞,葛斌(1.兰州大学第二医院耳鼻喉科,甘肃
15、兰州 730030;2.甘肃省人民医院药剂科 ,甘肃兰州730000)中图分类号:R285 文献标识码:A 文章编号:10012494(2005,15119902太子参PseudosteUariaheterophylla(Miq,)PaxetHoffm.PHPH系石竹科植物异叶假繁缕的干燥块根,为传统中药,有补肺健脾功效.本实验用自然衰老大鼠模型,观察太子参醇提物(EPHPH)对自然衰老模型大鼠血清,肝,肾,耳蜗中一氧化氮合酶(NOS)活力的影响,旨在探讨衰老与 NOS 的相关性及太子参醇提物对衰老大鼠 NOS 的作用.1 材料和方法1.1 试剂及动物NOS 测试盒(南京建成生物工程研究所),
16、其他试剂均为分析纯.Wistar 大鼠,旱(兰州大学兰州医学院医学实验中心,合格证书号:医动字第 14-OO6).太子参购自本院药房,经甘肃省药品检验所宋平顺主任药师鉴定为石竹科植物异叶假叶繁缕的干燥块根.1.2 太子参醇提物的制备用回流提取法,将药材适度粉碎,用体积分数80%乙醇浸泡 24h,水浴中加热回流,放冷过滤,第 1次回流 lh,第 2 及第 3 次各约 0.5h,回收乙醇,浓缩成浸膏状,用蒸馏水配成所需悬浮液,贮存备用.1.3 动物分组及给药选 3 月龄 Wistar 大鼠 l0 只,设为对照组( 少龄对照组);选 l2 月龄大鼠 50 只,随机分为 5 组,即模型组(早老期对照组
17、), 阳性对照组及大中小剂量试药组.采用灌胃法(ig) 给药 ,试药组 ig 生药量 2.16,4.32,8.64g?kg?d 的醇提物 ,对照组及模型组 ig相当量的对照液(只含防腐剂羟苯乙酯),阳性对照组 ig 维生素 E200mg?kg?d.喂养和灌胃 6 个月进行各项指标测定.1.4 大鼠血清,肝,肾,耳蜗中 NOS 的测定用紫外分光光度法,肝,肾用 Tris 缓冲液(pH7.4.0.01mol?L 一 IsHC1.0.000lmol?LEDTA.2Na,0.01mol?L 蔗糖,0.8%NaC1)配成 5%组织匀浆,耳蜗配成 1%组织匀浆.取血清 30 或肝匀浆或肾匀浆或耳蜗匀浆 0
18、.1mL,按测试盒操作法加入试剂,反应终体积为 0.5mL.37oC 水浴中反应 15rain,加入终止剂,振荡混匀,于 530/1130 处测定吸光度(A)值,计算 ed,NOS 和诱导型一氧化氮合酶 (iN.OS).1.5 大鼠肝,肾,耳蜗组织中蛋白含量测定用考马斯亮蓝 G.250 染色法,取组织匀浆 6o.加 3mL 染色液,室温混匀 15min 后,于 595nnq处测定 A 值,用标准曲线计算相应 A 值的组织蛋白含量(g?L). 血清 NOS 或 iNOS 活力(tLmol?L)=(NOS 或 iNOS 测定管 A 值一空白管 A 值)/呈色物纳摩尔 f 肖光系数(38,3 10)
19、反应液总体积/取样量 Xl/比色光径(1)X 反应时间/1000.组织 NOS或 iNOS 活力(tmaol?g)=(NOS 或 iNOS 测定管 A值一空白管 A 值)/呈色物纳摩尔消光系数(38.310)反应液总体积/取样量1/比色光径(1)反应时间/蛋白含量.1.6 数据处理组间及组内实验数据显着性检验用单因素方差分析.实验数据用s 表示,统计软件用 SPSS.2 结果老龄对照组大鼠(与少龄对照组比较)血清,肝,基金项目:甘肃省科学事业经费项目(QS041 一 C3320)作者简介:袁逸铭,男,硕士,副主任医师通讯作者:葛斌,男,副主任药师TeL/Fax:(0931)8281809币再蓊孚 l2005 年 8 月第 4o 卷第 15 期Ch/nPharmJ,2005August,Vo1.40No.151199
