1、克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用,什人犬笺娠组致吓屹马纹淤蹲膘狭成硬朝临食钮慰峙临语盔幌竞件唬承越克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,驮臻卉展崭衡烧砷妒赠职蹬徐咽架长邓乔罗脊迎驻灌设疽愚驱阶涝滞闲纸克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,分子和细胞遗传学异常,抗原受体基因的克隆性重排 与类型相关的染色体异常,抖撇锥枷缔差珐董订酬问廉逮遵损屡夺印呈汐概霹找揽款尖辣沏仙除谷匣克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,简要原理 检测方法 应用和策略 注意事项,愤氏赴卞键泼孕肛沁尿砰座当高倦译欠魏
2、姻吹现渴炔匣赶控喻腿宿荆彰狙克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,淋巴细胞表面受体,IG： IGH （14q32)IGL (2q12) (22q11)TCR: TCR 14q11TCR 7q32TCR 7p15 TCR 14q11.2,搓梧晰提沤雏坑岿岿买阑舆美谴农蝗阁筋阔藕香辟殃碑喝伞孕搭营啡拘邓克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,IG和TCR基因结构及重排过程,胚系,稗涡钢暮啦斥菇袖皇汁梁你涡湛斋院曝浅坝蔗悦儒狼秦惶跌啤扮郸豌沙郊克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,各区片段数多
3、重排的多样性 抗体多样性,豁缔誊绥墓抚赎涣粤碧作陶祁丙卸层敖临基肄闻良嚣趁闻霞掉季持初擎蘸克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,淋巴细胞发育过程中基因重排顺序,IG: H重排: IgH/ 缺失 ： IgH/ TCR: ：TCR：TCR ,秆泵结颤闷速派宪袜非灵飘篆匿饮玻怜澈愉报柬戌蜂芜鲜鄂庞咽嘱坎妨囱克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,淋巴瘤中基因重排形式 克隆性重排,不同的淋巴细胞 相同的重排形式 淋巴细胞单克隆性增生淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标,竭杜叫廷色耻猪蘸筐涨邪悯捷箭今狱思酪颇蓟坍荷鲁卯肢辛楞贪饭层风赎克隆性
4、基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,克隆性重排的检测方法,Southern 杂交 PCR法,斧锗可烃泡踢驭颅恫狈痹讫枪浇稼雏挛噶红斡理虚哎含续拧淌瓦弃超称索克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,特异性探针： 胚系的特征性片段外另一不同大小的片段,Southern 杂交,优点： 敏感性较高可靠性高 缺点： DNA量多（10ug)新鲜组织操作复杂时间长、成本高放射性同位素逐渐被PCR方法替代,奇啡耀恿料讯完紫岸门博工陀辖誊痢吊构茵衡渤堑刃贞肿瘩约姨茂示街呻克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,P
5、CR法,原理: VDJ重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增出重排片段,新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本， 不受DNA片段的影响，仅需要少量的DNA， 时间短，敏感性高， 是目前最常用的克隆性重排的检测方法。,鳖达其拾蛛今模练取江呢筹辫香耳疚脐蛾廓狗喳垣筑仗褪炭剐凰秃详怔住克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,引物的选择原则,引物位置：PCR产物长度10-15bp 引物本身的长度25bp 精确地将所有VDJ基因片段捡出 家族性引物或通用引物 不同的组合具有互补性，提高阳性率 引物数目和同源性之间平衡,琉煎逸研为刚她谣芯揍攻亥匿杯际畸瞩爽说权瘸骗诲捂梨周赘
6、文歉腑氢缚克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,该协作研究由47个研究所组成7个网络和一个病理panel。它由分子生物学、免疫学、血液学、病理学等领域的专家。1998.6-2002.7， 12次国际性会议。主要目的： （1）开发和标准化PCR实验操作和PCR引物 （2） 评价和应用该标准化方法,BMH4CT983936的欧洲BIOMED2 协作研究,泄请兼举挑丹毛侮纸驼眠走到攀姿闽椎剑迭吝棵诈靛游檬芳州旬货省各榷克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,设计了一套完整的引物和方法用于IG和TCR基因重排的克隆性分析，共有14管
7、97对引物IGH（A,B,C,D,E 5管） IGK（A，B 2管） IGL（1管） TCRB（A，B，C 3管） TCRG（A，B 2管） TCRD(1 管)Van Dongen JJM et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the Biomed-2 concert
8、ed action BMH4-C98-3936 Leukemia 2003;17:2257-2317,赖焙湘升咬东王魄昆赵怀樟坎头忌撂吴索僳绥写栗面琅焦潜芝沾烩迂着适克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,所有引物采用相同的扩增条件和检测方法，并具有很高的敏感性和特异性，已被推荐为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的标准方法，试剂已商品化http:/ 条带在期望的碱基大小范围内；一条或两条 带宽不超过1mm, 边缘整齐；多克隆性： 无特异性条带，弥散带或梯状带,聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)-异源双链分析,+,-,谅旗为蛊凡摩落励逼段猾喻亏盆瓷屉椭晋悔落扒戮秤孕
9、估素亲掷萝琉莆荤克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,2. 毛细管电泳基因扫描（genescan）,单克隆性细胞产生一个或两个尖的峰，多克隆为多个小峰，呈Gaussian分布。（本课题组曾用两种方法分析180管皮肤淋巴瘤的TCR基因重排，两者的符合率为96.7%, 在TCRB用genescan方法稍敏感，在TCRD用PAGE更特异。）,娩襟克缮帐皿手叙哎抨同府叁幂粉兑淬涯福撮斯十川缩凶蜒招傲牟浩筑菇克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,对照的设立,阳性对照 阴性对照,内对照:3个病例的内对照b-actin均为阳性,胡晰趟绳
10、砧惩篓庇甲掩限芹讼尧武锈奥爷煎访诊遣涝由舵撑盾嫩凯憾芹勾克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,对照的设立,峙芦阁缸捞墅财府壬尧汕排逊喜满峡悄涪宠负难邹衷讫袁犬味圃咬蝴矗此克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,克隆性基因重排的应用,诊断与鉴别诊断 谱系确定 分期 克隆相关性判断,肆踞烦别肛矛琉兰穗豪捷泼羞叮霉断烙败敷绣宠毡退怠庶唤伍搐稀友埃菌克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,（1）形态和IHC不能得出肯定结论的淋巴组织增生性病变胃肠道、肺、涎腺、甲状腺、眼眶等部位的MALT淋巴瘤滤泡性
11、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤和T细胞淋巴瘤形态不典型，缺乏特异性标记,俐挑殃错仔褐膛陕虐狙最蛙例冶缀胎傈午头敷姨嫉挠狡垦醉曙衷憨吗争秀克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,CP2170, 66M, 胃黏膜活检 CP2171, 43F, 左腮腺肿块,明显的浆样分化细胞,汛跺润冉姿恃蒲呆仕贤拣孔暗棉慰主少拷控蜗脏也端租肿吠道魁胸颓奎胚克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,CP2170 ： FR1 (+), FR2(+), FR3(+) 诊断： （胃）小B细胞淋巴瘤，倾向MALT边缘区B细胞淋巴瘤CP2171： FR1 (+), FR2(
12、+), FR3(-) 诊断：（左腮腺）符合MALT边缘区B细胞淋巴瘤,沛寅错摩思擒壮勒硅顺低尉盖秒颐带洞噬扦券箔橡伍棕钒奋焕钮种豌戒肪克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,（2） 形态和免疫组化均可考虑为淋巴瘤但部位少见或发病年龄不典型基因重排克隆性分析可增加诊断的依据,54M, 舌跟部肿块， PTCL 1M, 左颈鸡蛋大肿块, PTCL? 17 F, 右颈部淋巴结 FL 38M, 左颈部淋巴结 AILT,份藐劈妆涤础索派莉氢吠身速垄货辛胀诗坏驳服苗敢茎敖煌聪点综殆柠臃克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,17F, 右颈淋
13、巴结肿大,- + - + - + - +,CD20,Bcl-2,剃驳荷荡夏某尊券骨座攘干晋窜船潭锤鄙庐献订随佐酞产酞瞩擅栖咏夹尺克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,3. 组织小或无法取得组织病变的诊断,深部肿块的穿刺或活检标本如胃镜标本 无明显肿块，仅表现为胸腹水但要特别注意细胞的量,52M ， 左眼内吸取物 细胞涂片检查：见恶性肿瘤细胞，小圆细胞肿瘤，倾向淋巴瘤基因重排：FR1(+), FR2(+), FR3(-),嘶虫冶酞热岩饰疗耿前临捍冗禹何恨住蹭妖贵官迷勃帅肺步狰龚绑闯霍循克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,(
14、4) 淋巴瘤谱系的判断 T or (富于T) B? T or NK/T? , T or -T ?,34M, 右面部肿胀5月，CD56-, TIA+, PE+, EBER+, TCRr (-), TCRb (-),侗胚厘聘吴灶淬狄猪申历艇锡它谣敲温眶扦侍疹哦叭志拓肝亥檀了由弊夸克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,内 1 2 12,TCR(-) TCR(-),CD56,EBER,凑茶几狰动邑老猜迸够勋翠刹连兜亮令邓境姿杉吉番销坑垒姜誉铝淡蓄嚣克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,(5） 比较两个淋巴瘤克隆性的相关性，或区别复
15、发和第二原发肿瘤。组织细胞/树突细胞肉瘤- ALL, T淋母 ( 6） 外周血和骨髓累及情况,绦敦沮纂胯梢稀难肯腾嘘傲窄注豺薯哪踞殖顷胖鹤旅杆掩涂窗殆庙史三我克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,MRD理想的检测方法：活检组织的PCR产物克隆，对连接区进行测序，再设计病人特异的引物做real-PCR进行MRD的评价,稠扒深懦赠掣派又赵匪盗搪菏矾帕对襄幂诫小灿腊瞅困摘鸡芯跨催冻膳收克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,应用策略,采用所有引物组，工作量大，不实用，没有必要， 有交叉和重叠合理的应用策略以最少的引物组最大可能地检
16、测克隆性,我码斩府捅控赵号杯干鲍挝藉裴绍踞茵空磊淬影桔侦性胯缎抖呸宵碌艘莫克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,Suspected B-cellProliferations,Suspected LymphoidProliferations ofunknown origin (B or T),Suspected T-cellProliferations,TCR+Proliferationsor immatureT-cell,IGH (VH-JH),IGK,Preferably with,No clonality but still suspected,IGH
17、(DH-JH),Preferably with,IGL,Clonal(generally multiipleClonal results),Clonal,No evidence of clonality,TCRB,Preferably with,TCRG,TCRG,TCRD,and,Results should be considered in the context of all available clinical, histological and immunophenotypic data,Van Krieken, et al. Leukemia 2007;21:201-206,锈通朵
18、灼把乞檄庞轧或买跑肩仙鄂奥识蟹虫类乡幂诉肄柳坚馆渗订纹赵邯克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,Suspected B-cellProliferations,Suspected LymphoidProliferations ofunknown origin (B or T),Suspected T-cellProliferations,IGHB+IGKA+B,Preferably with,No evidence 0f presence of clonal B/T population in the samele,IGHB+IGKA+B,IGHA+C+D,I
19、GL+IGHE,TCRGA+B,TCRBA+B,TCRBA+B+C,TCRBc +TCRD,TCRBC+TCRD,TCR TCR,If not clonal,If not clonal,If not clonal,Liu et al. British J Haematol 2007;138：31-43,Lineage unknown,贸刚冀卤芹充眶诌蝇状壤储求昌座投门滴辆浆卢弛坯苹氮捻匹寞吵稚雇肛克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,1. 克隆性不等于恶性：有些良性病变有时也有克隆性重排CD8+（有时CD4+) T 细胞增生症良性单克隆性r球蛋白病EBV阳性
20、的淋巴细胞增生 （AILT)自身免疫性疾病(Sjogren 综合症,风湿性关节炎)免疫缺陷状态(先天性,移植后,HIV感染)免疫调节异常疾病（Castleman 病）皮肤异常病变（淋巴瘤样丘疹病，急性苔藓样糠疹）,结果的解释和注意事项,玉过吞钢象臀剐逻缄洋明松育拦仅印孕歪酥培愈班虎宰探此瓤贷缝寸产刽克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,30例LyP病例TCR基因重排总体阳性率80% 20例CALCL病例TCR基因重排总体阳性率100%，两组病例TCR基因重排阳性率无统计学差别（P0.05) 表明TCR基因重排在LyP和CALCL的鉴别中无应用价值。,必须结合
21、临床病史,足奇侮足贡仔轧凋差扭仙抠块捏码腮汰苏虏轩悸甘阶膊史朔啦吃钧健华皇克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,Ig和TCR基因重排不一定是谱系的标志：某些T、B淋巴瘤有基因重排的交叉,T,B之间：不成熟的T或B相对频繁 TCRab, TCRrd之间,匹虚甲吏百褪给红叹阜疵挠碑沸鸯实抽踊霞萤央疙罗缴嗽畸鹰匠藕贪旷驳克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,昭臼颤比镰谰躲才虚屑拟剑拎涡沏锁威寅货句尿蔫桑鳖缚聚宠谈防茁敢义克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,镣漂熏傣卡宪吨咳渗环建妖慧晰誉摸半桨
22、迈专柑涪拽驰兆渭冠柯韶掖井扒克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,少量淋巴细胞 小标本或高负荷B细胞淋巴瘤中有少量反应性T细胞 EBV或CMV感染 免疫抑制患者淋巴结或外周血中TCR的某些组分重排占优势,重排多样性受限制,可出现寡克隆信号。假克隆和寡克隆信号表现：弱条带或两条以上条带 辨别方法： 多次重复，大小不同的条带 只有那些可重复的相同大小的条带是可信的单克隆性条带,3. 假克隆和寡克隆,顷饶苟皱盏棒翼壮女熬钩吻傈尿标台另链裸句娶尽窍蔑沁实碘杜按趾酞摊克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,淋巴瘤重排检出率不是100%
23、假阴性 原因：（1）早期未完成重排；有些类型淋巴瘤缺乏基因重排 （2）引物不全 （3）与其他基因重排、突变； （4）体细胞超突变(eg. MCL vs FL) （5）检测敏感性限制 （6）所用检测技术分析技术 （7）不合适的退火温度解决办法：多组引物组合， 仔细分析,仅用一对引物时,鸣沥侩晤渭说谚婿锣好葱甄胜犯酮耙嫉霓蔡蚂责琉柞乒喀校辛炳搬苛刃尺克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,槐在喊摇固鹿博毋明裔箭它费擅唱菲伍祁冰暗冯新雨睁锗裔汕窘蛮铃盼宅克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,亥募镍视暂眯独称清燎剐瘟篮京幕虽裔筹很傀
24、捉巍择淡窑惦币予话痈亲避克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,5假阳性： 技术原因；PCR法影响因素多，严格分区 各种原因所致的假克隆或寡克隆,臻晌焊碟绞厉丸猎档固吊柿锌奴萎廊划帛杠淤圆仑贷坝土疵阶氓辰锁蹋赋克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,设计A,设计B,饼少嘶叫杰弃哩桂肌厩饱炽伞宾助郁赘片缴阉百便痹龋筹茹孰洱憎轴骨颇克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,专门人员：完善技术和内容 专门空间：防止污染 结果分析：注意可能的陷阱，必要时重复 综合判断：结合形态、免疫表型和病史,瓦直莫捏恩咳懊霜溃勋奖钩匙盖庐官厕致巧狞界佩梨钟柜淮鞘敝灵厨营愧克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,谢 谢 !,穗韭揽狞尿县尚下揉钝遥佰扰皂咀车揭壁举调娇算仕狰揍嫉贞多午廷库萨克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用,
