1、1第五章 微生物的生长与生存因子一、目的要求要求学生掌握微生物生长的研究方法，了解调控微生物生长繁殖的因素。二、教学内容1 微生物纯培养的生长2 测定微生物生长的方法3 微生物的生长规律4 影响微生物生长的因素三、重点内容微生物的生长测定与微生物生长的规律四、教学方法采用多媒体教学微生物在适宜的条件下，不断地吸收营养物质并按照自己的代谢方式进行代谢活动，如同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。所谓生长就是指生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加；繁殖是指生物个体数目的增加。但是在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，
2、个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上常以群体生长作为衡量微生物生长的指标。群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程。第一节 微生物纯培养的获得微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一种微生物，必须把它众混杂的微生物类群分离出来，以得到只含有一种微生物的培养。微生物学中将在实验条件下，从一个细胞或同种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。纯培养的获得有下列几种方法。一、平板划线分离法2有接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的
3、话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。二、稀释倒平板法先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如110、1100、11000、110000） ，然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至 45左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。三、单孢子或单细胞分离法采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（
4、单孢子）分离法。单细胞他离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体较小的细菌则较难。在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。四、利用选择性培养基分离法各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。另外，还可以将样品预处理，消除不希望分离到的微生物。如加温杀死营
5、养菌体而保留芽孢，过滤去除丝状菌体而保留单孢子。微生物纯培养分离方法的比较分离方法 应用范围平皿划线法 方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法 即可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法 局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法 适用于分离某些生理类型较特殊的3第二节 微生物生长的测定微生物生物情况可以通过测定单位时间里微生物数量或生物量的变化来评价。通过微生物生长的测定可以客观地评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响，或评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制（或杀死）作用的效果，或客观反应微生物的生长规律。因此微生物生长的测量在理论上和实践上有着重要的意义。微生物生长的测量有计数、重量和生理指
6、标等方法。1计数法此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。计数法又分为直接计数法和间接计数两类。（1）直接计数这类方法是利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积 1mm2和高 o.1mm 的计数室，在 1mm2的面积里又被刻划成 25 个(或 16 个)中格，每个中格进一步划分成 16 个(或 25 个)小格，但计数室都是由 400 个小格组成。将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计算 4-5 个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出
7、每毫升样品所含的细菌数。每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数400l0 000稀释倍数(2)间接计数法此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。将待测样品经一系列 10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取 0.2ml 放入无菌平皿，再倒入适量的已熔化并冷至 45左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数：每毫升原菌液活菌数同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数稀释倍数5此法还可以将稀释的菌液取 0.2m1 加到已制备好的平板上，然4后用无菌涂棒将菌液涂布整个平板表
8、面，放入适宜温度下培养，计算菌落数，再按上公式计算出每毫升原菌液的所含活菌总数。此法可因操作不熟练造成污染，或因培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。尽管如此，由于该方法能测出样品中微量的菌数，仍是教学、科研和生产上常用的一种测定细菌数的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽抱与抱子等的数量均可用此法测定。但不适于测定样品中丝状体微生物，例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等。除上述两种常用的计数方法外，还有膜过滤法、比浊法。膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下
9、计算膜上(或一定面积中)的细菌数；比浊法原理是在一定范围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(OD)表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。微生物计数法，发展迅速，现有多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法。2重量法此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由
10、水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于 105烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至 50，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用 50的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。除了干重、湿重反映细胞物质重量外，还可以通过测定细胞中蛋白质或 DNA 的含量反映细胞物质的量。蛋白质是细胞的主要成分，含量也比较稳定，其中氮是蛋白质的重要组成元素。从一定体积的样品中分离出细胞，洗涤后，按凯氏定氮法测出总氮量。蛋白质含氮量为 16，细菌中蛋白质含量占细菌固形物的 50
11、一 80，一5般以 65为代表，有些细菌则只占 13一 14，这种变化是由菌龄和培养条件不同所产生的。因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算：蛋白质总量含氮量6.25核酸 DNA 是微生物的重要遗传物质，每个细菌的 DNA 含量相当恒定，平均为 8.410-5ng。因此从一定体积的细菌悬液中所含的细菌中提取 DNA，求得 DNA 含量，再计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。3生理指标法对于一些非溶液的样品，要测定微生物数量除了用活菌计数法外，还可以用生理指标测定法进行测定。生理指标包括微生物的呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等。这是根据微生物在生长过程中伴随出现的这些指标，样
12、品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。这类测定方法主要用于科学研究，分析微生物生理活性等。第三节 微生物的生长规律一、细菌群体生长规律细菌接种到均匀的液体培养基后，当细菌以二分裂法繁殖，分裂后的子细胞都具有生活能力。在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线，这种曲线称为生长曲线称为生长曲线(growth curve)。一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四
13、个生长时期。1迟缓期(1ag phase) 又称延滞期、适应期。细菌接种到新鲜培养基而处于一个新的生长环境，因此在一段时间里并不马上分裂，细菌的数量维持恒定，或增加很少。此时胞内的 RNA、蛋白质等物质含量有所增加，相对地此时的细胞体最大，说明细菌并不是处于完全静止的状态。产生6迟缓期的原因，认为是微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏足够的能量和必需的生长因子， “种子”老化(即处于非对数生长期) 或未充分活化，接种时造成的损伤等。在工业发酵和科研中迟缓期会增加生产周期而产生不利的影响，但是迟缓期无疑也是必需的，因为细胞分裂之前，细胞各成分的复制与装配等也需要时间，因此应该采取一定的措施：通过遗
14、传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；利用对数生长期的细胞作为“种子” ； 尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。2对数生长期(log phase)又称指数生长期(exponential Phase)。细菌经过迟缓期进入对数生长期，并以最大的速率生长和分裂，导致细菌数量呈对数增加，而且细菌内各成分按比例有规律地增加，此时期内的细菌生长是平衡生长。对数生长期细菌的代谢活性、酶活性高而稳定，大小比较一致，生活力强，因而它广泛地在生产上用作“种子”和在科研上作为理想的实验材料。3稳定生长期(stationary phase)由于营养物质消耗，代
15、谢产物积累和 pH 等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零( 即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数量)，结束对数生长期，进入稳定生长期。稳定生长期的话细菌数最高并维持稳定。如果及时采取措施，补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等可以延长稳定生长期，获得更多的菌体物质或代谢产物。4衰亡期(decline 或 death Phase)营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率逐步增加和活细菌逐步减少，标志进入衰亡期。该时期细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌
16、死亡的速率降低。此外，不同的微生物，甚至同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或 NH4+等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力( 例如乳糖或 NO3-等)。前者通常称为速效碳源(或氮源)，后者称为迟效碳源(或氮源) 。当培养基中同时含有这两类碳源(或氮源)时，微生物在生长过程中会产7生二次生长现象。二、同步培养微生物个体生长是微生物群体生长的基础。但群体中每个个体可能分别是处于个体生长的不同阶段，因而它们的生长、生理与代谢活性等特性不一致，出现生长与分裂不同步的现象。同步培养(synchronous culture)是一种培养方法，它能使群体中不
17、同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物。同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。用一般培养方法获得的细胞通常是不完全同步的细胞，就是同步培养方法获得的同步细胞经几次传代之后，也会出现不同步的现象。如何使不同步转变为同步，以及如何使用同步细胞能较长时间地保持同步，这是同步培养中要研究的课题。同步培养方法很多，可归纳为机械法与环境条件控制两类。1机械方法这是一类根据微生物细胞在不同生长阶段的细胞体
18、积与质量或根据它们同某种材料结合能力不同的原理设计出来的方法。其中常用的有：(1)离心方法将不同步的细胞培养物悬浮在不被这种细菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，通过密度梯度离心将不同细胞分布成不同的细胞带，每一细胞带的细胞大致是处于同一生长期的细胞，分别将它们取出进行培养，就可以获得同步细胞。(2)过滤分离法将不同步的细胞培养物通过孔径大小不同微孔滤器，从而将大小不同的细胞分开，分别将滤液中的细胞取出进行培养，获得同步细胞。(3)硝酸纤维素滤膜法根据细菌能紧紧结合到硝酸纤维素滤膜上的特点，将细菌悬液通过垫有硝酸纤维素滤膜的过滤器，然后将滤膜颠倒过来，再将培养基流过滤器，以洗去末结合的细菌，然
19、后将滤器放入适宜条件下培养一段时间，其后仍将培养基流过滤器，这时新分裂产生的细8菌被洗下，分部收集并通过培养获得同步细胞。2环境条件控制技术这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原理设计的一类获得同步细胞的方法。(1)温度最适生长温度有利于细菌生长与分裂，不适宜温度如低温不利于细菌生长与分裂。通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可获得同步细胞。(2)培养基成分控制培养基中的碳、氮源或生长因子不足，可导致细菌缓慢生长直至生长停止。因此将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间，然后转移到营养丰富的培养基里培养，能获得同步细胞。另外也可以将不同步的细胞转接到含有一定浓度的，能抑
20、制蛋白质等生物大分子合成的化学物质如抗生素等的培养基里，培养一段时间后，再转接到完全培养基里培养也能获得同步细胞。(3)其他对于光合细菌可以将不同步的细菌经光照培养后再转到黑暗中培养，这样通过光照和黑暗交替培养的方式可获得同步细胞；对于不同步的芽孢杆菌培养至绝大部分芽孢形成，然后经加热处理，杀死营养细胞，最后转接到新的培养基里，经培养可获得同步细胞。环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种处理可能是导致胞内某些物质合成，它合成和积累可导致细胞分裂，从而获得同步细胞。三、连续培养连续培养(continous culture of microorganisms)是在微生物的整个培养期间，通过
21、一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。根据生长曲线，营养物质的消耗和代谢产物的积累是导致微生物生长停止的主要原因。因此在微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。在连续培养里，培养容器中细菌的数量一方面以比生长速率的数量增加，同时又在以稀释率的数量减少。连续培养有两种类型，恒化器连续培养和恒浊器连续培养。前者是在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本9恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。培养基中的某种营养物质通常是作为细菌比生长速率的控制因子，这类因子一般是氨基酸、氨和铵盐等
22、氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质。恒化器连续培养通常用于微生物学的研究，筛选不同的变种。后者主要是通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。菌液浓度大小通过光电系统调节稀释率来维持菌数恒定，此种培养方式一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业，从而获得更好的经济效益。恒浊器连续培养与恒化器连续培养的比较装置 控制对象 培养基 培养基流速 生长速率 产物 应用范围恒浊器 菌体密度无限制生长因子不恒定 最高速率大量菌体或与菌体相平行的代谢产物生产为主恒化器培养基流速有限制生长因子恒定低于最高速率不同生长速率的菌体
23、实验室为主连续培养如用于生产实践上，就称为连续发酵，连续发酵与单批发酵相比有许多优点：高效，它简化了装料，灭菌、生产时间和提高了设备的利用率；自控，便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量较稳定；节约了大量动力、人力等资源。连续培养或连续发酵也有其缺点。最主要的是菌种易于退化。其次易遭杂菌污染。此外营养的利用率一般亦低于单批培养。在生产实践上，连续培养技术已广泛用于酵母菌体的生产，乙醇、乳酸和丙酮-丁醇等发酵。以及用假丝酵母进行石油脱蜡或是污水处理中。第四节 环境对微生物生长的影响生长是微生物同环境相互作用的结果。在液体培养中生长曲线是在正常培养条件下，反映微生物接种后的培养过程中菌数变化同培养
24、时间之间的关系。微生物在培养过程中，环境的变化会对微生物生长产生很大的影响。一、环境对微生物生长的影响10影响微生物生长的主要因素有营养物质、水的活性、温度、pH和氧等。1.营养物质营养物质不足导致微生物生长所需要的能量、碳、氮源、元机盐等成分不足，此时机体一方面降低或停止细胞物质合成，避免能量的消耗，或者通过诱导合成特定的运输系统，充分吸收环境中微量的营养物质以维持机体的生存；另一方面机体对胞内某些非必要成分或失效的成分进行降解以重新利用，这些非必需成分是指胞内贮存的物质、无意义的蛋白质与酶、mRNA 等。例如在氮、碳源缺乏时，机体内蛋白质降解速率比正常条件下的细胞增加了 7 倍，同时减少
25、tRNA 合成和降低 DNA 复制的速率，导致生长停止。2水的活性水是机体中的重要组成成分，它是一种起着溶剂和运输介质作用的物质，参与机体内水解、缩合、氧化与还原等反应在内的整个化学反应，并在维持蛋白质等大分子物质的稳定的天然状态上起着重要作用。微生物在生长过程中，对培养基的 aw 有一定的要求，每种微生物生长都有最适的 aw，高于或低于所要求的 aw 值，都会通过影响培养基的渗透压力变化而影响微生物的生长速率。微生物不同，生长所需要的最适配 w 值也不同。3温度根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜热和超嗜热等五种不同的类型。它们都有各自的最低、最适和最高生长
26、温度范围。微生物类型 生长温度 最低 最适 最高嗜冷微生物 0 以下 15 20兼性嗜冷微生物 0 20-30 3；嗜温微生物 1520 20-45 45 以上嗜热微生物 45 55-65 80超嗜热或嗜高温微生物 65 80-90 100 以上表中列出不同微生物生长温度的一些典型例子。温度的变化都会对每种类型微生物的代谢过程产生影响，通过改变它们的生长速11率。以适应温度的变化而生存。温度对微生物生长的影响具体表现在：影响酶活性，微生物生长过程中所发生的一系列化学反应绝大多数是在特定酶催化下完成的，每种酶都有最适的酶促反应温度，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞物质合成；影响细胞质膜的流
27、动性，温度高流动性大，有利于物质的运输，温度低流动性降低，不利于物质运输，因此温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌；影响物质的溶解度，物质只有溶于水才能被机体吸收或分泌，除气体物质以外，温度上升物质的溶解度增加，温度降低物质的溶解度降低，最终影响微生物的生长。4pH微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适 pH 范围，在此范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大，因此微生物生长也有一个最适生长的 pH 范围。此外微生物生长还有一个最低与最高的 pH 范围，低于或高出这个范围，微生物的生长就被抑制，微生物不同生长的最适、最低与最高的 pH
28、 范围也不同。微生物 最低 PH 最适 PH 最高 PH细菌 3-5 6.5-7.5 8-10酵母菌 2-3 4.5-5.5 7-8霉菌 1-3 4.5-5.5 7-8pH 通过影响细胞质膜的透性、膜结构的稳定性和物质的溶解性或电离性来影响营养物质的吸收，从而影响微生物的生长速率。质子是一种唯一不带电子的阳离子，它在溶液里能迅速地与水结合成水合氢离子(H 3O+等)。在偏碱性条件下，OH -占优势，水合氢离子和OH-对营养物质的溶解度和离解状态，细胞表面电荷平衡和细胞的胶体性质等方面均会产生重大影响；在酸性条件下 H+可以与营养物质结合，并能从可交换的结合物或细胞表面置换出某些阳离子，从而影响
29、细胞结构的稳定性；同时由于 PH 值较低，CO 2 溶解度降低，某些金属离子如 Mn2+、Ca 2+、Mo 2+等溶解度增加，导致它们在溶液中的浓度增加，从而对机体产生不利的作用。5氧根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为好氧、微好氧、耐氧型、兼性厌氧和专性厌氧五种类型，它们在液体培养基试管中的12生长特征见图。因此，在培养不同类型的微生物时，一定要采取相应的措施保证不同类型的微生物能正常生长。例如培养好氧微生物可以通过振荡或通气等方式使之有充足的氧气供它们生长；培养专性厌氧微生物则要排除环境中的氧，同时通过在培养基中添加还原剂的方式降低培养基的氧化还原电势；培养兼性厌氧或氧的耐氧型微生物，可
30、以用深层静止培养的方式等。微生物与氧的关系微生物类型 最适生长的 O2 体积分数好氧微好氧氧的忍耐型兼性厌氧专性厌氧等于或大于 202一 lO2以下有氧或无氧不需要氧、有氧时死亡氧对于好氧微生物生长虽然可以通过好氧呼吸产生更多的能量，满足机体的生长需要，但另一方面，氧对一切生物都会使其产生有毒害作用的代谢产物，如超氧基化合物与 H2O2，这两种代谢产物互相作用还会产生毒性很强的自由基 OH.。自由基是一种强氧化剂，它与生物大分子互相作用，可导致产生生物分子自由基，从而对机体产生损伤或突变作用，直至死亡。氧之所以对专性厌氧微生物以外的其他四种类型微生物不产生致死作用，是因为它们具有超氧物歧化酶，
31、可催化起氧化基化合物分解，最终分解成水。第五节 微生物生长繁殖的控制在适宜条件下，对数生长期的微生物能以最大的比生长速率进行生长繁殖，产生大量的新个体，例如每个 E.coli 细胞的重量虽然大约只有 10-12g，但是，如果一个 E.coli 在肉汤培养基和在适宜条件下，培养 48h 产生的新个体的总重量可超过地球重量的 4000 倍！实际上生长是微生物与环境相互作用的结果。在自然界电离辐射、太阳、温度、湿度、营养物质消耗和代谢产物积累等环境影响下，E.coli 不可能以最大比生长速率无限制地生长下去，再加上 E.coli 噬菌体作用，一些 E.coli 也会被裂解而死亡，使细菌数量不会无限增
32、加。另一方面微生物中有不少是动物、植物和人类的病原菌，也13必须对这类病原菌进行控制。因此，如何控制微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。有关的术语抑制(inhibition)：抑制是在亚致死剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这种因子后生长仍可以恢复的生物学现象。死亡(death)：死亡是在致死剂量因子或在亚致死剂量因子长时间作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使这种因子移去后生长仍不能恢复的生物学现象。防腐(antisepsis)：防腐是在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或防止其他物质霉变。例如日常生活中
33、以干燥、低温、盐腌或糖渍等防腐方法是保藏食品( 物) 的主要方式。具有防腐作用的化学物质称为防腐别。消毒(disinfection)：消毒是利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施，它可以起到 1肋止感染或传播的作用：具有消毒作用的化学物质称为消毒剂(disinfectant)，一般消毒剂在常用浓度下只能杀死微生物的营养体，对芽孢则无杀灭作用。灭菌(sterilization)：灭菌是指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施。灭菌后的物体不再有可存活的微生物。化疗(chemotherapy)：化疗是指利用具有选择毒性的化学物质如磺胺、抗生素等对生物体内部被微
34、生物感染的组织成病受细胞进行治疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对机体本身无毒害作用的治疗措施。理化因子对微生物生长是起抑菌作用还是杀菌作用并不是很严格分开的。因为理化因子的强度或浓度不同作用效果也不同，例如有些化学物质低浓度有抑菌作用，高浓度则起杀菌作用，就是同一浓度作用时间长短不同，效果也不一样；不同微生物对理化因子作用的敏感性不同，就是同一种微生物，所处的生长时期不同，对理化因子作用的敏感性也不同。一、控制微生物的化学物质1抗微生物剂抗微生物剂(antimicrobial agcnt)是一类能够杀死微生物或抑制微14生物生长的化学物质，这类物质可以是人工合成的，也可以是生物合成的
35、天然产物。根据它们抗微生物的特性可分为：抑菌剂，它们能抑制微生物生长，但不能杀死它们，作用机理是这类物质结合到核糖体上抑制蛋白质合成，导致生长停止，由于它们同核糖体结合不紧，它们在浓度降低时又会游离出来，核糖体合成蛋白质的能力恢复，使生长恢复；杀菌剂，它们能杀死细胞但不能使细胞裂解，由于它们是紧紧地结合到细胞的作用靶上，即使在浓度降低时也不能游离出来，因此生长不能恢复；溶菌剂，它们能通过诱导细胞裂解的方式杀死细胞，将这类物质加到生长的细胞悬液里以后会导致细胞数量成细胞悬液的混浊度降低，能抑制细胞壁合成或损伤细胞质膜的抗生素就属于溶菌剂。抗微生物剂又称杀菌剂，通常又将它们分为消毒剂和防腐剂，前者
36、通常用来杀死非生物材料上的微生物，后者具有杀死微失物或抑制微生物生长的能力，但对于动物或人体的组织无毒害作用。杀菌剂广泛用于热敏感的其他物质或用具，如温度计、带有透镜的仪路设备、聚乙烯管或导管等的灭菌；在食品、发酵工业，自来水厂等部门常用杀菌剂杀死墙壁、楼板与仪器设备等表面和自来水中的微生物；对于空气中的微生物则用甲醛、石炭酸(酚) 、高锰酸钾等化学试剂进行薰、蒸、喷雾等方式杀死它们。表中列出了与健康有关的一些常用的消毒剂与防腐剂及其作用的机理。2抗代谢物在微生物生长过程中常常需要一些生长因子才能正常生长，那么可以利用生长因子的结构类似物干扰机体的正常代谢，以达到抑制微生物生长的目的。例如磺胺
37、类药物是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物，磺胺类药物被微生物吸收后取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸的合成，抑制了转甲基反应，导致代谢的紊乱，从而抑制生长。同样，对氟苯丙氨酸、5-氟尿嘧啶和 5-溴胸腺嘧啶，分别是苯丙氨酸、尿嘧啶和胸腺嘧啶的结构类似物，由这些结构类似物取代正常成分之后造成代谢紊乱，以抑制机体的生长。因此生长因子等的结构类似物又称为抗代谢物(antimctabolite) ，它在治疗由病毒和微生物引起的疾病上起着重要作用。3抗生素抗生素(antibiotic)是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们是能抑制其他微生物生长或杀死它们的化合物，15它们主要是通过抑制细菌
38、细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、抑制蛋白质和核酸合成等方式来抑制微生物的生长或杀死它们。抗生素与其他一些抗代谢药物如磺胺类药物通常是临床上广泛使用的化学治疗剂，但多次重复使用，使一些微生物变得对它们不敏感，作用效果也越来越差。根据对某些抗生素不敏感的抗性菌株的研究表明，抗性菌株具有以下特点：细胞质膜透性改变，如抗四环素的委内瑞拉链霉菌的细胞质膜透性改变，阻止四环素进入细胞；药物作用靶改变，二氢叶酸合成酶是磺胺类药物作用的靶，抗磺胺药物的菌株改变了二氢叶酸合成酶基因的性质，合成了一种对磺胺药物不敏感的二氢叶酸合成酶；合成了修饰抗生素的酶，这些酶有转乙酰酶，转磷酸酶或腺苷酸
39、转移酶等，在这些酶的作用下，分别使氯霉素乙酰化，链霉素与卡那霉素磷酸化或链霉素腺苷酸化，这些被修饰的抗生素也失去了抗菌活性；抗性菌株发生遗传变异，发生变异的菌株导致合成新的多聚体，以取代或部分取代原来的多聚体，如有些抗青霉素的菌株细胞壁中肽聚糖含量降低，但合成了另外的细胞壁多聚体等。抗性菌株所具特征，表明了它们耐药性的机理。二、控制微生物的物理因素控制微生物的物理因素主要有温度，辐射作用、过滤、渗透压、干燥和超声波等，它们对微生物生长能起抑制作用或杀灭作用。1高温灭菌当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌的温度越高，微生
40、物死亡越快。通常情况下温度为 121.3。衡量灭菌效果的指标之一是十倍致死时间 (decimal reduction time，D)，即在一定的温度条件下，微生物数量十倍减少所需要的时间。温度愈高，十倍致死时间愈短。另外 D 值大小还随微生物的种类、生长时期、检测培养基的性质等因素有关。测量某种微生物在某个温度下的十倍致死时间是一个很复杂的过程，因为这种方法要测定活菌的数量。另一种比较容易测定的指标是热致死时间(thennaldeathtime)，即在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的时间。这样只要在一定温度下将待测样品加热处理不同时间16后，分别与培养基混匀，然后培养，当所有细菌被杀死
41、时，被培养的样品中没有细菌生长。待测样品中的微生物数量大(即浓度高) ，杀死所有微生物所需的时间比杀死微生物浓度低的样品所需的时间长。因此当微生物的浓度一致时，可以通过比较热致死时间长短来衡量不同微生物的热敏感性。干热灭菌法对于一些玻璃器皿、金属用具等耐热物品还可以用干热灭菌法进行灭菌，但干热灭菌所需时间比湿热灭菌温度高和时间长。例如171需要 1h，160需 2h，121需 16h 等。煮沸消毒 即将待消毒物品如注射器、金属用具、解剖用具等在水中煮沸15min 或更长时间，以杀死细菌或其他微生物的营养体和少部分的芽孢或孢子。如果在水中适当加 1碳酸钠或 2一 5的石炭酸则杀菌效果更好。间隙灭
42、菌法对于某些培养基，由于高压蒸汽灭菌会破坏某些营养成分，可用间隙灭菌法灭菌，即流通蒸汽(或蒸煮)反复灭菌几次，例如第一次蒸煮后杀死微生物营养体，冷却，培养过夜，孢子萌发，又第二次蒸煮，杀死营养体。这样反复 23 次就可以完全杀死营养体和芽孢，也可保持某些营养物质不被破坏。巴氏消毒法高压蒸汽灭菌适用于耐热材料的灭菌（如培养基、溶液等。 ）对于牛奶及其热敏感物质不适宜，因为高热破坏了食品的营养与风味。现在，牛奶或其他液态食品一般都采用超高温灭菌，即 135150，灭菌 26s，既可达杀菌和保质，缩短了时间，又提高了经济效益。2辐射作用辐射灭菌(radiation Sterilization)是利用
43、电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效力法。用于灭菌的电磁波有微波、紫外线(UV)、X 射线和 y 射线等，它们都能通过特定的方式控制微生物生长或杀死它们。例如微波可以通过热产生杀死微生物的作用；紫外线(UV)使 DNA 分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制 DNA复制与转录等功能，杀死微生物；X 射线和 y 射线能使其他物质氧化或产生自由基(OH 、H )再作用于生物分子，或者直接作用于少物分子，打断氢键、使双键氧化、破坏环状结构或使某些分子聚合17等方式，破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。3过滤作用高压蒸汽灭菌可以除去液体培养基中的微生物，但对于空气和不耐热的
44、液体培养基的灭菌是不适宜的，为此设计了一种过滤除菌的方法。过滤除菌有三种类型。一种最早使用的是在一个容器的两层滤板中间填充棉花、玻璃纤维或石棉，灭菌后空气通过它就可以达到除菌的目的。为了缩小这种滤器的体积，后来改进为在两层滤板之间放入多层滤纸，灭菌后使用也可以达到除菌的作用，这种除菌方式主要用于发酵工业。第二种是膜滤器，它是由醋酸纤维素或硝酸纤维素制成的比较坚韧的具有微孔(0.22 0.45um)的膜，灭菌后使用，液体培养基通过它就可将细菌除去、由于这种滤器处理量比较少，主要用于科研。第三种是核孔滤器，它是由用核辐射处理的很薄的聚碳酸胶片(厚 10um)再经化学蚀刻而制成。辐射使胶片局部破坏，
45、化学蚀刻使被破坏的部位成孔，而孔的大小则由蚀刻溶液的强度和蚀刻的时间来控制。溶液通过这种滤器就可以将微生物除去，这种滤器也全要用于科学研究。4高渗作用细胞质膜是一种半透膜、它将细胞内的原生质与环境中的溶液(培养基等 )分开，如果溶液中水的浓度高于细胞原生质中水的浓度，那么水就会从溶液中通过细胞质膜进入原生质，使原生质和溶液中水的浓度达到平衡，这种现象为渗透作用，即水或其他溶剂经过半透性膜而进行扩散的现象称为渗透；在渗透时溶剂通过半透膜时受到的阻力称为渗透压。渗透压的大小与溶液浓度成正比。如纯水的aw 值为 1，溶液中的溶质趋向于降低 aw 值，即溶液中含的溶质愈多，溶液中的 aw 值愈低，而溶
46、液的渗透压愈高。细菌接种到培养基里以后，细胞通过渗透作用使细胞质与培养基的渗透压力达到平衡。如果培养基的渗透压力高(即 aw 值低) ，原生质中的水向培养基扩散，这样会导致细胞发生质壁分离使生长受到抑制。因此提高环境的渗透压即降低 aw 值，就可以达到控制微生物生长的目的。例如用盐( 浓度通常为 10一 15)腌制的鱼、肉、食品就是通过加盐使新鲜鱼肉脱水，降低它们的水活性，使微生物不能在它们上面生长；新鲜水果通过加糖( 浓度一般为 50一 70)制成果脯、蜜饯也是降低水果的 aw 值，抑制微生物生长与繁殖，起到防止腐败变质的效果。5干燥18水是微生物细胞的重要成分，占生活细胞的 90以上，它参
47、与细胞内的各种生理活动，因此说没有水就没有生命。降低物质的含水量直至干燥，就可以抑制微生物生长，防止食品、衣物等物质的腐败与霉变。因此干燥是保存各种物质的重要手段之一。6超声波超声波处理微生物悬液可以达到消灭它们的目的。超声波处理微生物悬液时由于超声波探头的高频率振动，引起探头周围水溶液的高频率振动，当探头和水溶液两者的高频率振动不同步时能在溶液内产生空当即空穴，空穴内处于真空状态，只要悬液中的细菌接近或进入空穴区，由于细胞内外压力差，导致细胞裂解，达到灭菌的目的，超声波的这种作用称为空穴作用；另一方面，由于超声波振动，机械能转变成热能，导致溶液温度升高，使细胞产生热变性以抑制或杀死微生物。目
48、前超声波处理技术广泛用于实验室研究中的破细胞和灭菌。复 习 思 考 题1什么是纯培养？获得纯培养的方法有哪些？适应的范围是什么？2测定微生物的生长量常用哪几种方法？试比较它们的优缺点。3什么是生长曲线？单细胞微生物的典型生长曲线可分几个时期？各有何特点？4何谓同步生长？获得同步生长的方法有哪些？5什么叫连续培养？什么叫连续发酵？提出连续培养的依据是什么？6什么叫恒浊连续培养和恒化连续培养？试加以比较？7连续发酵有何优缺点？8根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为几种类型？它们的最适温度范围如何？9什么叫最适温度？最适温度对同一微生物的生长速度、生长量、各代谢产物累积量的影响是否相同？10 从分子氧的要求看，微生物可分哪几种类型？它们各用特点？11 试比较抑制与死亡；灭菌与消毒、防腐、化疗的异同。12 什么叫抗微生物剂、抗代谢物、抗生素？它们的作用机制是什么？13 微生物产生耐药性的途径有哪些？14 利用热进行消毒的方法有哪些？它们的适用范围是什么？15 除了温度外还有哪些方法可用来灭菌或抑菌？19主 要 参 考 书1.微生物学教程 ，周德庆著，高等教育出版社，19912.微生物学 （第二版） ，武大、复旦大学编，高等教育出版社，19873.微生物学 ，黄秀梨著，高等教育出版社，19974 微生物学 ，沈萍著，高等教育出版社，2000
