1、第七章,常用分子生物学技术的原理及应用（二） The popular technology in molecular biology: principle and application,Molecular Cloning Vectors plasmid phage cDNA genomic libraries cDNA libraries DNA ligation Recombinant DNA molecules Transformation Selection chromosome walking molecular hybridization DNA sequencing,The po
2、lymerase chain reaction (PCR) inverse PCR reverse transcriptase PCR Quantitative PCR asymmetric PCR RNAi Multiplex PCR Southern Blotting DNA ngerprinting Western blotting Northern blotting Arbitrary primer PCR fluorescence in situ hybridization (FISH) Gene chip or DNA chip,上一章常用技术词汇,四 核 酸 序 列 分 析 Nu
3、cleic acid sequence analysis,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法 (Maxam-Gillbert法)-略,DNA链的末端合成终止法 (Sanger法),(Sanger双脱氧链终止法),HO P O P O P O CH2,O,A, C, G or T,1,3 ,OH,5 ,双脱氧核苷三磷酸,脱去,二、DNA链末端合成终止法,Sanger 1958年和1980年两次获Nobel奖,三、DNA自动测序,用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。 用不同荧光分子标记4种ddNTP，然后进行Sanger测序反应，产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离。 通过
4、4种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出4种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,ABI PRISM 310型 DNA测序仪,主要用于DNA序列分析 (包括DNA测序,卫星序列、杂合子序列和三联体序列分析，单链构象多态分析,长片段PCR分析)，遗传疾病诊断，亲子鉴定等,PE 3700型DNA测序仪,DNA自动测序结果举例,五、生物大分子相互作用研究技术The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,一、蛋白质相互作用研究技术,酵母双杂交 各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉
5、淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选,常用蛋白质相互作用的研究技术,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。,（一）标签蛋白沉淀,标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。,标签融合蛋白沉淀实验流程示意图,（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途,酵母双杂交系统的应用,证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱
6、饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。,电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。,二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术,（一）电泳迁移率变动测定,凝胶迁移实验结果示意图,凝胶迁移实验结果图,染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipi
7、tation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。,（二）染色质免疫沉淀法,染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图,六、遗传修饰动物模型的建立及应用,The establishment and application of heredity-modified animal model,转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,转基因被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) 目的基因的受体动物,一、转基因技术,核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个
8、体的去胞核的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。,二、核转移技术,有目的去除动物体内某种基因的技术, 称为基因剔除（gene knock-out）或基因靶向灭活(gene targeting)。,三、基因剔除技术,四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用,建立动物模型 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) 多基因决定疾病模型,七、基因组学的建立及应用,The establishment and application of genome,人类基因组计划,基因组分类 病毒基因组 原核生物基因组 真核生物基因组,一、病毒基因组,
9、1每种病毒有_种核酸，成分为_； 2病毒核酸大小差别很大，通常为_bp； 3除_外，所有病毒基因都是_拷贝的。 4大部份病毒核酸是由_条双链或单链分子构成，仅少数RNA病毒由_个核酸片段组成 5真核病毒基因_内含子，噬菌体（感染细菌的病毒）基因中_内含子 6_(有或没有)重叠基因,1通常由_DNA分子组成2_子结构是原核生物基因组的结构特点之一3基因密度_，编码区比例_；重复序列_；含有同基因； GC含量变化_。4非编码区主要为_序列5_(有或无)转座现象。6_DNA具有自主复制能力,二、原核生物基因组,一、病毒基因组,1每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA； 2病毒核酸大小差别很大，
10、3X103一3X106bp； 3除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。 4大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成 5真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子 6有重叠基因,1通常由环状双链DNA分子组成2操纵子结构是原核生物基因组的结构特点之一3基因密度高，编码区比例大；重复序列少；含有同基因； GC含量变化大4非编码区主要为调控序列5存在转座现象6质粒DNA具有自主复制能力,二、原核生物基因组,癌 症,艾滋病,人口增长,粮食短缺,环境污染,生 命 科 学,人类基因组计划的缘起,人类基因组计划的缘起,人类基因组计划的动议
11、过程,1984年DOE委托Alta, White R.,Mendelsonhm M科学家举行专业会议。 1985年提出人类基因组计划的动议。 1986年McKusick V将从整个基因组层次上研究遗传的科学定义为基因组学。 1986年Dulbecco R在“Science”上发表文章。,人类基因组计划的动议过程,1987年DOE和NIH下拨研究经费。1988年成立了国家人类基因组研究中心,Watson任第一任主任。,人类基因组计划的目标,HGP（人类基因测序计划）其目标是通过以美国为主的全球性的国际合作，在大约15年的时间里完成人类24条染色体的基因组作图和DNA全长序列分析，进行基因的鉴定和
12、功能分析。 建立指导人类进化的“说明书”（人类遗传信息数据库）,人类基因组计划的发展进程,预计完成 30 亿对碱基的测序。美国承担了全部任务的54%，英国33%，日本7%，法国2.8%，德国2.2%。 中国于1999年9月加入人类基因组计划并承担了 1% 的测序任务。,人类基因组计划的研究策略,遗传图谱：指基因或专一的多态性DNA标记的相对位置的图谱。物理图谱：确定各测序片段连接顺序及遗传标志间物理距离的图谱。序列图谱：核酸序列图。基因图谱：基因组中占2-5%长度的全部基因按照具体位置、次序排列成的线性图。,1998年,1998年，生产DNA测序仪的最大厂家Perkin-Elmer(简称PE)
13、公司与文特尔领导的基因研究所合作成立了塞莱拉（Celera）遗传信息公司，并宣布他们将利用最新技术在3年内完成人类基因组的测序工作，这使得该计划处于一种公私竞争的状态，从而加快了人类基因组的研究步伐。,人类基因组计划的发展进程,2000年 人类基因组工作草图绘制成功,人类基因组计划的发展进程,2001年2月12日，美、英、日、法、德、中6国科学家指出：人类基因总数只有 3 3.5万个, 编码序列占2%。 2001年7月10日，中国“人类基因组计划”重大项目秘书长杨焕明教授宣布：在人类基因组完成图的绘制工作中，中国已率先超额（1.13%）完成所承担的任务。,中国人类基因组计划发展进程,1993年
14、，中国人类基因组计划（CHGP）启动，首先开展了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”。 1997年，我国启动了“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构与功能研究”项目。并在上海和北京相继成立了国家人类基因组南、北两个中心。,中国人类基因组计划研究成果,1%测序任务，第三条染色体3000万bp 精确度99.99% 发现142个基因，其中80个为预测基因,癌症基因组学,另一项远征计划的提出,癌症基因组计划的动议过程 （The Cancer Genome Atlas.TCGA）,2005年，一项为期10年、耗资15亿美元的计划诞生。 50种主要癌症的12500份肿瘤样品中系统地搜寻常见的基因突变。
15、（单核苷酸变异（SNP）、小插入和小缺失（indel）、拷贝数变化染色体结构重排（CNV）等。,Eric Lander,癌症基因组计划的动议过程 （The Cancer Genome Atlas.TCGA）,2005年12月13日,美国宣布启动癌症基因组计划这项为期10年的工程将帮助癌症专家阐明驱动每种不同肿瘤癌变的特殊变异行为。 2020年前找到所有导致细胞癌变的基因。,埃利亚斯泽古尼,癌基因组特征认证中心,中央生物样品核心资源库,信息资料 协调中心,基因组 测序中心,中国癌基因组计划发展进程,吕有勇教授为CCGC秘书长。初步确定 选择我国常见的高发肿瘤（食管癌、鼻咽癌、胃癌、肺癌、肝癌、结
16、肠直肠癌、白血病等）进行基因组分析工作，首先选择胃癌进行探索。,进 展,卵巢癌 神经胶母细胞瘤结肠癌 乳腺癌 白血病子宫癌 等,肺 癌,2.3万个变异是患病细胞所特有的，几乎所有变异是由60种左右的烟雾中的化学物质造成的。,黑素瘤皮肤癌,3.3万个变异是由直接暴晒阳光造成的。,新生儿快速DNA诊断 (3500 genetic diseases),解码儿童肿瘤 (3 yers, 65 million),基因组“巨变”诱导癌症发生,七、转录组学的建立及应用,The establishment and application of transcriptome,转录组学,转录组学（transcript
17、omics）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究细胞在某一功能状态下所含mRNA的类型与拷贝数。,转录组学实验方法,基于杂交技术的芯片技术包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片基于序列分析的基因表达系列分析SAGE （serial analysis of gene expression，SAGE）和大规模平行信号测序系统MPSS(massively parallel signature sequencing,MPSS)。,我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。随着这个功能基因组学问题的提出（后基因组时代，蛋白组学），涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（2-
18、D-gel）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和基因芯片（Genechip）技术,生命科学正迅速地演变为一门信息科学,美国继开展人类基因组计划以后，于1998年正式启动基因芯片计划。（多部门参加） 多所名校（斯坦福大学、麻省理工学院、英国剑桥大学及部分国立实验室如Argonne Oakridge也参与了该项目的研究和开发。 世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。而主要仍以少数几家公司为主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。 国内目前主要如清华大学（程京）、中科院生命科学院、
19、上海复旦大学、北京军事医学科学院、南京东南大学、西安等四十余家公司，而且可能还有一大批公司相继成立。,基因芯片是信息时代的产物,横跨： 生命科学、 物理学、 计算机科学、微电子技术 光电技术、 材料科学等现代高科技,2. 什么是基因芯片,生物芯片，将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分子各种生物分子存在的量的一种技术。 基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。,生
20、物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。 而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交的芯片。,生物芯片的分类,生物芯片的分类,根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。,基因芯片使用步骤,芯片制作,把探针固定于载体表面,样品处理,目标分子富集,分子间的杂交,结果检测与数据分析,Measurements:images, quantitation, specifications,10.基因芯片的应用,基因芯片具有巨大的应用前景
21、 1. 基因功能分析研究 2. 检测与疾病相关的基因, 进而用于疾病诊断 3. 药物筛选, 4. 检测基因突变 5. 其他(环境化学毒物的筛选 体质医学的研究 ),基因功能分析研究,将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。,通过相关基因进行疾病诊断,目前主要涉及： 癌症、 血液病、 心血管疾病、 遗传性疾病、 神
22、经系统疾病、 部分感染性疾病、 毒物引起的损伤、 免疫反应相关性疾病等。,Golub et al, Science , 286 (5439): 531, Oct 15, 1999,药物筛选,在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选（high throughout screening），可使新药开发获得技术上的突破。,帮助中医药走向世界,研究天然药物对人体的作用机制 筛选对人体有生物效应的单味天然
23、药物 筛选对人体有生物效应的有效成分 筛选对人体有生物效应的天然药物配方,中药的研究。尤其中药中众多成分中有效成分的筛选、有效药物的筛选、中药毒理学过程均被大大简化，将推动中药的迅猛发展。中药学引入基因芯片技术，将大大推动中药研究的国际化进程，为阐明中药作用机理，具有无可估量的重要意义。,蛋白质组学,蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。,蛋白质组学的概念及发展进展,蛋白质组（proteome）：PROTEins + genOME，意思是Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋白质）。19
24、94年由Williams和Wilkins提出，是一个动态的概念，指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质。,蛋白质组和蛋白质组学的概念,对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 。在空间和时间上动态变化着的整体。,蛋白质组：,蛋白质组学(proteomics),指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。,主要研究内容,了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；,明确各种
25、蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；,描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。,表达蛋白组学The study of global changes in protein expression,Proteomics,蛋白质组功能模式 The systematic study of protein-protein interactions through the isolation of protein complexes,蛋白质组研究包括两个方面：,基因组 转录组 蛋白组,The study of proteins expressed by gen
26、omes Completion of the sequencing of the 1st draft of human genome indicates there are approximately 250,000 proteins in the human genome Only 2-5% of proteins in human genome have been identified,功能蛋白质组学 (functional proteomics)的提出,功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。 介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学
27、之间。,从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。 将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。,发展进展,各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟： 1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（Australia Proteome Analysis Facility，APAF）,美国国立癌症研究院（NCI）投资1000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。 NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。 英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。,Celera公司投资上亿美元
28、独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。,1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议 1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议,我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会,2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。,科技部已将疾病蛋白质组研究
29、列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。 我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。,蛋白质组学研究内容,蛋白质组学研究的基本技术,蛋白分离技术：（1）经典双向电泳方法（2）DIGE（3）SILAC（4）iTRAQ质谱技术:蛋白鉴定、翻译后修饰（磷酸化、糖基化）,1：常规双向电泳,双向电泳基本原理：双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)的基本原理是利用蛋白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳等电聚焦（Isoelectric Focusing，IE
30、F）根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分离，第二向电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDSPAGE）利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分离。,双向电泳流程,2：DIGE,Mass Spectrometry: Methods & Theory,Mass Spectrometry,Analytical method to measure the molecular or atomic weight of samples,Peptide Mass Fingerprinting (PM
31、F),Mass Spec Principles,Ionizer,Sample,+,_,Mass Analyzer,Detector,m/z ratio:,Molecular weight divided by the charge on this protein,All proteins are sorted based on a mass to charge ratio (m/z),Typical Mass Spectrum,aspirin,Relative Abundance,120 m/z-for singly charged ion this is the mass,Query (MA
32、LDI) Spectrum,500 1000 1500 2000 2500,698,2098,1199,1007,609,450,2211 (trp),1940 (trp),Query vs. Database,Query Masses Database Mass List Results,450.2017 (P21234) 609.2667 (P12345) 664.3300 (P89212) 1007.4251 (P12345) 1114.4416 (P89212) 1183.5266 (P12345) 1300.5116 (P21234) 1407.6462 (P21234) 1526.
33、6211 (P89212) 1593.7101 (P89212) 1740.7501 (P21234) 2098.8909 (P12345),450.2201 609.3667 698.3100 1007.5391 1199.4916 2098.9909,2 Unknown masses 1 hit on P21234 3 hits on P12345Conclude the query protein is P12345,MASCOT,蛋白质组学-发展趋势,在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质
34、组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。,在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为目前生命科学最令人激动的新前沿。,组学在疾病诊断中的应用,阿尔茨海默病(
35、Alzheimers diseases, AD)中，神经元纤维缠结的大脑神经细胞基因表达谱有别于正常神经元,自闭症：由一组不稳定的基因造成的一种多基因病变。,164万“星星的孩子”,转录组的研究应用于临床的的另一个例子是可以将表面上看似相同的病症分为多个亚型，尤其是对原发性恶性肿瘤，通过转录组差异表达谱的建立，可以详细描绘出患者的生存期以及对药物的反应等等。,乳腺癌治疗突破,Greater than 1,300,000 cases and 450,000 deaths each year worldwide,1、Luminal A型 2、Luminal B型 3、H型 4、三阴性,Sample
36、s and clinical data,825 patients（466 tumours from 463 patients had data） Agilent mRNA expression microarrays (n=547), Illumina Infinium DNA methylation chips (n=802), Affymetrix 6.0 single nucleotide polymorphism (SNP) arrays (n=773) miRNA sequencing (n=697) whole-exome sequencing (n=507) reverse-ph
37、ase protein array (RPPA) data (n=403),30,626 somatic mutations:28,319 point mutations:6,486 silent, 19,045 missense, 1,437 nonsense, 26 read-through, 506 splice-site mutations819 mutations in RNA genes.4 dinucleotide mutations,2,302 insertions/deletions (indels).,Significantly mutated genes in breast cancer,HER2-based classifications and summary analysis,High mRNA expression correlations with serous ovarian cancers, as well as with lung squamous carcinomas. the activity of platinum analogues and taxanes in breast basal-like and serous ovarian cancers.,
