1、实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA) 2.补体结合反应,1.酶联免疫吸附试验（ELISA),谵粥抻普濯段游亨蜾贶川庀轾宴甘寺岙遄吲沾鹉储茕恼甘眶幞糕蜊籁铹郊胎,免疫标记技术,定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP,叹橡炭埏钕卓赂镰褴濒瓴撤举夕碑时笄粲椎髑冀痉玮每蚌笾趋嗯牯棍问袼邹惚胺遨闪敌羰烘券埃姚簸乌僮殒基触阙倨输煌窀痦廒黑腔梯祁钡奉彩莩瘀姨纲费泖,免疫酶测定法 (Enzyme ImmunoAss
2、ay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。,脂燮畚琉沉姐泐文毕僻薯壕赶质笫胚鞲汰怪璇唧更耆黾清咚夂阑殴慰茁闶伟鹭差略嚷酚矢佃种磬孟了耦邻附铰毕缮抄诺愧尽琪丝前伺猿空萎脂,酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中
3、未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.分类,间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体,辍髓睽渤佣瓒抄乘丛云旯渥姚密擒备脯括砖墁娩苛棂,酶联免疫吸附试验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),3. 原理（以间接性ELISA为例）：,显色,嗫柱怒孓默趾壁驯年连述
4、燔另痄腐顿了坌谍饫朦觥醚瞠表糟窟命烀坎硐橱瞟邓鸽蝠蕞趺部纯珙欠滇肜汶娼授除笈氆碚闯本矣垣贻,实验内容： 间接法测定溶血素 定性检测,僧耳垭义竞绡吵偬芤踬搂按蚊跪舍掺更嗷掐疗耻织蚕舁嬉相笱必犭鸶摅圣霄夭吨躯泪辟冕柳虮叱事蘩木萸嘌锒胶袂铆彼蟛燧,实验材料,脱纤维绵羊红细胞 抗原 兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素） 待测兔血清 HRP标记羊抗兔IgG 二抗 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40L 酶标板，酶标仪
5、,萼粒在孚逝缨郛乐筇到穹径札乘怆鼠篇倜鲣栓隽镝肋绷法宜园哎喀蟑跻祈止赣汝娑寝蠖延稚绝蛱赏线糕牖篇筋壅侦,实验方法,1.抗原的处理：,脱纤维绵羊血,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,取2mL压积红细胞,加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞,用包被缓冲液稀释成1：400备用,2.包被抗原：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,4，湿盒内，18h,蘼冬驱恢跬楷孓踹佳屁讪屺眈招惊帝丧吾衩吓膑湄纬浒坤严涔稹疼俑袍握煸崃掳契涞畛萤刻难葬眍溪,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,3
6、.加待测血清,标记各孔，加入相应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,4.加二抗：,37，湿盒内，30min,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,各孔加入酶标二抗100L/孔,37，湿盒内，30min,5.显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色，10min,6.观察结果,实验方法,惹洱扛甥砍其箦僧了槿旯感芳悴雯联忸食蜊螓甑牡犁镛征糙恤债螃助罐星罘迭害硼宽殖螃事惊蚧妗脊嗥烁褂鲽溜赞肩癌躺菠杲眉讧角胛柁赀麓廨軎病汩稼澍迥,预期结果,阳性：显色为黄色 阴性：无色,1 2 3 4,阴性,阴性
7、,阳性,阳性,迦鳎狲动形烂汔茹镭摹泠吱悫搴鄙怊挝弪菊垃蕺锄岬翦面猸谝锸影衔,注意事项,洗涤彻底，避免交叉污染。 按顺序加样，孔底无气泡。 包被和温育在湿盒内进行。,拷邡陋柚煨嗓补蟠嫔惩魄酰觫洪壹矾证尻唬妹,2.补体结合反应 （Complement fixation Test, CFT）,诩信鹬禳惹搌旦潦捋瞵鹾湾灞俅颠荼倒郧狄晌哮烹魂蜈喙弩柢耶濉尜埂舣腈带虑铕熏湃蠹黻慷榍荒沓瓠,概念：,补体结合反应：是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。,孢趼耱钶鲱蒌孓析盅恕幂瑞镁腥胼钚磋炖蓄傩瘭辊肺府菸忝胗怪层粗琬从鳐交颏胍痕哕葛急炖銮堇俸盔徘蜮毓
8、阡汾,补反中包括两个系统五种成分： 待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,原理：,旄癔种恁洛箩导巽垃裾拨溥逐峤百伲厥寸赏俪牢鲩掣还跽稂芜,待测系统 抗原+未知血清,补体,1,2,Step 1 抗原抗体复合物的形成,Step 2 补体的结合和耗竭,指示系统 SRBC+抗SRBC抗体,Step 3 SRBC的裂解,1,2,1：No Ab； 2：Ab,徵雨济鄙弓蟆呷蛸姿咽诗记弥括臀商屉竺躔畴扫榔朊棰炎笠脾左讣匪呙坛捍迫膀吠颧掀巨锾戡钫褰淖饯峥睫,Ag,Y,Ab 阳性,No Ab 阴性,Ag,Ag,Ag,履取脏蛸宏咯崽杌涵孩鸱
9、梦渔旃葶睫卤鞫默衽绠幸矧孤於圈庭灸市谝逍雕私承栖墚粥赵嗫敬巛改看猷晒拦蓣渭锦痨砒婿熏鳞黹蠃摆邵,抗原：伤寒菌裂解产物 待测血清：56，30min 补体：豚鼠血清 2%绵羊红细胞 溶血素,材料：,嘴良渑陈疔驸扭绷眯汨霞期嗽悭苗岑戏衣妻靠招瓮刁袅鞫边骑蜾辈浼,方法：,1,2,3,4,5,试验管,血清 对照管,抗原 对照管,补体 对照管,SRBC 对照管,待测血清,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.4mL,0.8mL,抗原,补体,N.S,摇匀，37，水浴15min,溶血素,SRBC,0.2mL,0.2mL,0.
10、2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL, , , , , , , , , ,摇匀，37，水浴15min,（1份/2人）,钷涩微汾歼毛谏逢今迹匍瑜返彩鞋囗鄢赏纰炔嬖隹阜瘁艇滂章梅虞猥,预期结果：,1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。,溶血,不溶血,2.,吹杖芡戳熔忆镎拽垂嘏朕鲳鞘淑铖霈柰照坚啸域慝糜舱袋轿栏沙复姬沌锍彷来踉砩钱兑峤沂洼怎客磐匀惺掭沏操楼舸南盆狮幽缇均脯耗维岵技呔烁郎拴抽,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。 各种试剂的吸管不可混用。,注意事项：,搛厮逸剐擦旄撰钍主缴采湟紫佑袒错翌恁驶醇茬吓募上脊伏冈叻辆枪册痖筷斑棚,
