1、中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 1 MiR-21-5p 介 导自噬异 常在 可溶性尿 酸诱 导肾小管 上皮细胞炎症 反应 中的作用 严 业 何 文姬 谢恺庆（通讯作者）广西医科 大学第 二附属 医 院肾内科，广西 南宁 530008 摘要：目的 探讨可 溶性尿酸（SUA）诱 导肾小 管上皮细 胞（HK-2 细胞）炎症反应下 miR-21-5p 与 自噬异常 的关系。方法 建立SUA 诱导 HK-2 细胞 炎症模 型，检 测炎症因 子 MCP-1、miR-21-5p 和自 噬标志 蛋白 Beclin 1、LC3-II 和 P62 的表达。将 miR-21-5p 转染至 HK-2 细 胞，经
2、 SUA 干 预，检 测 MCP-1、LC3-II 和 P62 的 蛋白表 达情况。结果 SUA 诱导HK-2 细胞炎症 发生，miR-21-5p 表达 明显 下降，自噬 标志蛋 白 Beclin-1、LC3-II 和 P62 的表达均增 加。可 溶性尿 酸干预 miR-21-5p 转染的 HK-2 细胞，检测 显示：相较于 NC 组，UA 组 的炎症 蛋白 MCP-1、自噬标志 蛋白 LC3-II、P62 表达显著 增加；且相 较于 UA 组，UA+miR-21 mimics 组的 MCP-1 也表 达增加，但 LC3-II 表达下 降，P62 表达 增加；而 UA+miR-21 inhib
3、itor 组 LC3-II 和 P62 的表 达增加。结论 在 可溶性 尿酸诱 导的 HK-2 细胞 炎症反 应中，miR-21-5p 与 炎症密 切相关，可能 通过介 导自噬 异常进 行调控；其或 可能成 为可溶 性尿酸 诱导的肾 小管上 皮细胞 炎症的 一种新 型的生 物学标 志物。关键词：可溶性尿酸；炎症；miR-21-5p；自噬；CKD 中 图 分 类号：R 5 8 9 0 引言 慢性肾脏 病（CKD）是 一种 全球流行 性疾病，第 六次中国慢 性病及 危险因 素监 测报告，我国 CKD 患病率约为 8.2，老龄、吸烟、肥胖、高 血压、糖尿病 等人群患 病 率增 加1。大 量 证据 表
4、明，miR-21-5p（以 下简称 miR-21）与肾脏疾病联 系紧密2，通 过介导 自噬3、细胞凋亡4/焦亡5、TGF-1 诱导的纤维 化6等进行调控。自噬 对维持 肾细胞 稳态、肾脏结 构和功 能是必 不可少的，自噬 缺陷会 增加肾 损 伤的风险，导致肾 纤维化7。SUA 可诱导肾小管上皮 细胞 炎症，甚 至导致 肾纤维 化，加重 CKD8，但其与 miR-21 的研究一直 未得到 阐明。据此，研 究设计 探讨 miR-21 在可溶性尿 酸诱导 肾小管上 皮 细 胞 炎 症 的 作 用 及 其 成 为 生 物 学 标 志 物 的 可 能 性。1 实验方法 1.1 细胞 培养及 干预 将 H
5、K-2 细胞均匀接种于六 孔板中培 养，待 其生长铺满孔板 面积的 80时，去除旧培 养基，PBS 缓冲液清洗后加 入含 12 mg/dl 的 SUA 的完全培养基，作 用12、24h。实验设立空白对照 组（NC 组），SUA 干预 12、24h 的 UA(12h)组、UA(24h)组。1.2 细胞 转染 细胞长满 六孔板约 80，弃旧液后 清洗细 胞，加入 混 匀 的 转 染 复 合 物，余 下 一 孔 加 入 等 量 的 无 血 清 培养基。转染 24h 后，检测miR-21 的表达，确定进 行细胞转染的 miR-21 模拟物及 其阴性对 照物所 需的 siRNA浓度为 20 nM，miR
6、-21 抑 制剂及其 阴性对 照物的 浓度为 30 nM。1.3 转染 后干预 重新于 60mm 细胞培养皿中 均匀接种 培养 HK-2 细胞，确定 转染浓 度后将 铺满 培养皿 80的细胞 随机分为空 白对 照组（NC 组）、尿 酸组（UA 组）、尿酸+miR-21模拟物阴 性对照 组（UA+miR-21 mimics NC 组）、尿酸+miR-21 模拟物组（UA+miR-21 mimics 组）、尿 酸+miR-21 抑制剂阴性对 照（UA+miR-21 inhibitor NC 组）和尿酸+miR-21 抑制剂组（UA+miR-21 inhibitor 组），按组别进 行具体 转染。转
7、染 完成后，除空 白对照 组，其余 5 组均用 12 mg/dl 的 SUA 刺激 HK-2 细胞 12h。1.4 统计 学方法 所有数据 均采 用 SPSS 22.0 进行 统计 分析，以均数标准 差(x s)表示。两组比 较采用 独立样 本 t检验，多组间 比较采 用方差 分析；P 0.05，差异 有统计学意义。中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 2 2 结果 2.1 SUA 诱导HK-2 细胞 炎症因子MCP-1 产生 HK-2 细胞经可溶性 尿酸干 预 24h 内，RT-qPCR 检测炎症因子 MCP-1 的 mRNA 表达均显 著上调（P 0.05或 P 0.01），见于下图 1A
8、；Western blot 检测炎症蛋白 MCP-1 的表达也明显增加（在尿酸 刺激 12h 时 P 0.05，在尿酸刺激24h 时 P 0.01），见于下 图 1B；并且MCP-1 在mRNA 和蛋白水平上的表 达均随 着时间 的增加而增加，有一 定的时 间依 懒性（P 0.05）。图 1 SUA 诱导 HK-2 细胞后 MCP-1 的表达情况 2.2 SUA 诱导HK-2 细胞 对 miR-21 表达的 影响 12mg/dl 的可溶性尿酸溶 液 干预HK-2 细胞12、24h后，RT-qPCR 检测炎症反应 下 miR-21 表达水平，结果显示：miR-21 在可溶性尿酸 刺激作用12h（
9、P 0.0001）、24h（P 0.01）后均可 见表 达明显下 降；且可溶 性尿酸溶液刺激 HK-2 细胞后，miR-21 在 12h 时表达下降达 到低谷，随后表 达增 加（增加 明显，P 0.01，有 统计学意义），但相 较于对 照组，其在 24h 时依旧表现为 表达下降，具 体可见 下图 2。图 2 SUA 诱导对 miR-21 表达的影响 2.3 SUA 干预HK-2 细胞 后对自噬 的影响 12mg/dl 的可溶性尿酸溶液 刺激HK-2 细胞12h 后，Western blot 检测自噬标志 蛋白 Beclin-1、LC3-II 和P62 的表达水平，结果显 示：与对 照组相 比，
10、尿酸干 预组的自噬 标志蛋 白 Beclin-1（P0.05）、LC3-II（P0.01）和 P62（P0.05）的表达均 增加，且 LC3-II 与 LC3-I的比值也 增加（P0.05），见下图 3。图 3 SUA 干预 HK-2 细胞对自噬的影响 2.4 转染 后干预 对 HK-2 细胞 MCP-1 表达 的影响 miR-21 转染 HK-2 细胞 24h 后，SUA 干预 12h，Western blot 检测炎症蛋白MCP-1 的表达情况。结果显示：与 NC 组相比，UA 组的 MCP-1 表达增加（P 0.001）；UA 组、UA+miR-21 mimics NC 组、UA+miR
11、-21 inhibitor NC 组与 UA+miR-21 inhibitor 组的 MCP-1表达结果 无差别；相较于UA 组，UA+miR-21 mimics 组的 MCP-1 表达增加（P 0.05），见下 图 4。图 4 SUA 干预对 miR-21 转染后HK-2 细胞 MCP-1 表达的影响 2.5 转染 后干预 对自噬 的 影响 12mg/dl 的可溶性尿酸溶液 干预 miR-21-5p 转染后的 HK-2 细胞 12h 后，Western blot 检测自噬标志蛋白 LC3-II 和 P62 的表达水平，结 果显示：与 NC 组相比，UA 组的LC3-II 表达 增加（P 0.
12、001），P62 表达也增加（P 0.05）；UA 组、UA+miR-21 mimics NC组和 UA+miR-21 inhibitor NC 组的LC3-II 和P62 表达结果均 无差别；相较 于 UA 组，UA+miR-21 mimics组的 LC3-II 表达下降，P62 表达增加（P 0.05）；UA+miR-21 inhibitor 组LC3-II 和P62 均表达增加（P 0.05），见下图 5。3 讨论 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 3 图 5 SUA 干预 miR-21 转染后HK-2 细胞对自噬的影响 肾 脏 疾 病 患 者 常 可 观 察 到 无 症 状 的 高
13、 尿 酸 血 症9-10。尿酸诱导 内皮细 胞减少，减少 NO 释放，增加 与单核 细 胞 的 粘 附 性 以 及 黏 附 分 子 的 表 达，血 管 平 滑 肌 细胞 增殖增 加并迁移，释 放高 迁移率族 蛋白 1 以及炎症趋化因子，包 括 MCP-1；促进巨噬细 胞黏附11。过往研究认为，尿酸促 炎作用 主要 是尿酸盐 晶体作 用，如 通过激活 NLRP3 炎症小体诱导 炎症反应12。随 着研究 的开展，可溶 性尿酸 的促炎 作用 得到了很 好的研 究。无 论缺氧与否，SUA 可激 活 NLRP3 炎症小体，增 加 IL-1 的表 达，发 挥 促 炎 作 用13-15。课 题 组 前 期
14、研 究 也 证 实 了SUA 的促炎作用，且 炎症因 子 MCP-1 在一定范围内 与时间和剂量 呈正相 关16。本研 究显示，可溶性 尿酸干 预后，MCP-1 表达具有时间 依懒性，证实 了 可溶性 尿酸的 促炎作用，提示细 胞炎症 模型成 功建立，且在 24h 内，随着时间的增 加，炎 症加重。在高尿酸 血症中，miRNAs 表 达差异明 显，并与MCP-1、CRP、血肌酐和eGFR 水平密切相 关17。在本 次研究中，miR-21 在 SUA 刺激后表 达下降，随 着炎症 的加重，miR-21 表达增加，但依旧 低 于正常水 平，提示 miR-21可能与炎 症反应 密切相 关；同时，可
15、能有细 胞保护 程序参与了炎 症反应 调节。本研 究似乎也 肯定了 这一点：在SUA 干预后，自噬标志 蛋白 Beclin-1、LC3-II 和 P62的表达明 显增加，LC3-II/LC3-I 也增加，提示 SUA 诱导自噬活 化，自 噬可能 参与 了炎症反 应。研究发现，高糖 可通过 诱导 miR-21 抑制 RECK 表达，加 重 糖 尿 病 肾 病18。在 肾 病 综 合 征 患 者 血 清 中，miR-21 显著上调，且 与 TGF-1、IL-18 表达水平呈正相关19。据此，实验设 计用 SUA 干预 miR-21 转染后的HK-2 细胞，miR-21 模拟物加重了炎 症反应；mi
16、R-21 抑制剂对炎 症无明 显影响，几 乎与 miR-21 抑制剂阴性对照物的致 炎水平 一致，可能 与 SUA 刺激 HK-2 细胞后，miR-21 表达显著下降相关，提示可 能只有 达到一 定水平的 miR-21 才具有致炎作 用。另外，LC3-II 和P62 经SUA 诱导后表达增加，表明 在炎症反 应下自 噬诱导 激活；miR-21 模拟物抑制了自噬，自噬小体 形成减 少；而miR-21 抑制剂逆转了 这种诱 导，活化自噬，自噬小 体增加。此外，miR-21 可靶向抑制 TLR4，进一步抑制 NF-kB/NLRP3 通路，减轻炎症 反应和细 胞焦亡，促进 肾小管上皮细 胞的修 复5。
17、在 肾 缺血再 灌 注损伤 中，miR-21表达增加，介导 NRK-52E 细胞自噬 异常，并通过 靶向Rab11a，降低细胞活 力，诱 导细胞凋 亡3。课 题组前 期研究发现，自噬 调控 SUA 诱导HK-2 细胞炎症反应，且靶向 TLR4 介导自噬流异常20。本研究 首次披 露了 miR-21 介导自噬，影响可 溶性尿 酸诱导 HK-2 细胞炎症，但具体机制未知，或可能通过靶向 PTEN21、PDCD422和TLR423介导减轻炎症反 应，实验有待 进一步 研究。综上所述，在SUA 诱导的HK-2 细胞的炎 症反应 中，miR-21 与炎症密切相关，并可能介 导自噬 异常，加重肾 小 管
18、上 皮 细 胞 炎 症，可 能 成 为 可 溶 性 尿 酸 诱 导 肾 小管上皮细 胞炎症 反应的 一种 生物学标 志物。参考文 献 1WANG L,XU X,ZHANG M,et al.Prevalence of Chronic Kidney Disease in China:Results From the Sixth China Chronic Disease and Risk Factor Surveillance J.JAMA Intern Med,2023,183(4):298-310.2FIERRO-FERNNDEZ M,MIGUEL V,LAMAS S.Role of redo
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