1、 脂联素抗人脐静脉内皮细胞氧化损伤的作用研究脂联素抗人脐静脉内皮细胞氧化损伤的作用研究廖文强 1，庞燕 2，张翼冠 2，李晓辉 2 中日友好医院全国中西医结合心血管病中心，北京100029；2 第三军医大学药学院，重庆 400038)摘要 目的：研究脂联素(APN) 对过氧化氢 (H：O：)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)脂质过氧化的影响。方法：采用 Annexin VFITC 标记后流式细胞检测方法观测 H：O：引起的细胞凋亡情况。用硫代巴比妥酸微量法测定丙二醛(MDA)，黄嘌呤氧化酶法测总超氧化物歧化酶(SOD)，可见光法测过氧化氢酶(CAT)。体外自由基捕捉实验检测 APN 对超氧阴
2、离子和羟自由基的清除率。结果：APN 能明显抑制 H：O：引起的细胞凋亡。APN 预处理 HUVECs 后，H20，(200 ixmolL，6 h)所致的细胞膜脂质过氧化反应明显减弱，MDA 产生减少，CAT 和 SOD 活性增加，但仅以 APN 孵育HUVECs 对 SOD 和 CAT 活性没有明显的影响。结论：结果表明APN 对超氧阴离子和羟自由基有明显的清除效果。APN 通过抗脂质过氧化发挥抑制细胞凋亡，保护血管内皮细胞抵抗损伤的作用。【关键词】脂联素；脐静脉内皮细胞；自由基；细胞凋亡血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)作为机体调节心血管系统稳态
3、最大的内分泌器官越来越受到重视，其功能改变与心脑血管疾病的发生发展密切相关。脂联素(adiponectin，APN)是由白色脂肪组织分泌的约 30kD 的细胞因子，在哺乳动物血浆中有很高的含量，占总血浆蛋白的 O01。脂联素能诱导超氧化物歧化酶(superoside dismutase，SOD) 和过氧化氢酶(catalase，CAT) 的表达，亦可通过调节 Bcl 一 2 和 Bax 的表达抑制人神经母细胞瘤SHSY5Y 细胞的凋亡。研究表明，脂联素的内皮血管活性作用与磷脂酰肌醇一 3 一激酶依赖途径活化继而促进内皮细胞一氧化氮的产生有关 po；此外，脂联素具有抑制血小板聚集、抗动脉粥样硬化
4、、减轻心肌缺血损伤、保护 ROS 处理的血管内皮细胞等生理功能 H J。为进一步阐明脂联素的内皮细胞保护作用，本研究观察了脂联素对抗人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endotIIelial cells，HUVECs)脂质过氧化损伤的作用效果及其可能机制。材料和方法1 材料11 主要药品及试剂 脂联素购自北京爱迪博生物科技有限公司，Annexin VFITC 细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。1V1199 培养基和 I 型胶原酶购自 Gibeo；内皮细胞生长因子(endothelialcell groalondialdehyde，MDA)、SOD、CAT
5、 测定试剂盒购自南京建成公司。过氧化氢 (hydrogen peroxide，H202 ，30，临用 PBS 稀释)；5，5 一二甲基一 1 一吡咯啉一 N 一氧化物(5，5 一dimethyllpyrrolineNoxide，)Mr,o)用经活性碳纯化处理；黄嘌呤(xanthine)、黄嘌呤氧化酶(xanthineoxidase)均购自 Sigmao12 人脐静脉内皮细胞的体外培养参照 Nach 一 111811 等1 方法，在无菌条件下取健康新生儿脐带 2530 cm，灌入 01I 型胶原酶，37消化 10 rain。离心收集内皮细胞，用完全 N199(含 20胎牛血清、ECGF 20 m
6、gL、青霉素 1105 UL 和链霉素 100 mgL)接种细胞于T25 细胞培养瓶中，置 37，5CO：培养箱中培养。当细胞融合成单层时，以 002EDTA 消化传代，实验用第 l 一 3 代。2 细胞凋亡的测定HUVECs 于 24 孔培养板中培养，1105 cellsolLH202 处理 24 h；(3)APN 组：30 mecL APN；(4)APN+H202 组：APN 预处理 1 h 后给予 H202200 laxnolL 刺激 24 h。每组设立 3 个平行孔细胞，24 h 后收集细胞，PBS 洗细胞 1 次后，加入 200 斗 LAnnexin V 混合液(180L PBS+2
7、0 斗 L 10 X binding buffer+1 斗 L Annexin VFITC 抗体) ，4避光孵育30 rain 后，立即用流式细胞仪 (Bioltad)检测。3 脂质过氧化物 MI)A 测定MDA 的测定采用硫代巴比妥酸微量法【6】。于 24 孔培养板中接种 HUVECs，l X 10cellsolL H202 刺激 HUVECs 6h后，以 1Triton X 一 100 裂解细胞，按试剂盒说明操作，在酶标仪(BioRad)上测定裂解液的吸光度值，并计算 IVlDA 的含量(以 l Triton X 一 100 作空白对照)。4 SOD 和 CAT 活性测定将 HUVECs
8、接种于 24 孔培养板中，1 X 105cellsolL 刺激 HUVECs 6 h，或仅以脂联素孵育 1 h 后，按试剂前457盒说明书操作，测定细胞培养液中 SOD 活性及细胞裂解液中 CAT 的活性。5 体外自由基捕捉实验氧自由基的产生：产生超氧阴离子(o；) 自由基模型为黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶体系：XH+02 一 X+H+O；产生羟自由基的模型为 Fenton 反应：H：02+Fe 一 Fe+2OH。对照组用磷酸盐缓冲溶液，试验组为不同浓度的脂联素。在顺磁共振波谱仪(electronparamagnetie resonance，EPR，JESREl X 型，JEOL)的谐振腔内进行测试。
9、测定条件：X 波段，室温，modulationfrequency 100 kHz， Se 84s，podash;OH 和 DMPOOOH，其峰值与体系中产生的氧自由基浓度呈正比，用公式 Slt=(H。一 Hx)Ho100计算脂联素对自由基消除的百分率(SR) ，H。为对照组电子自旋共振信号平均峰值，Hx 为试验组峰高平均值。6 统计学处理数据用均数标准差(is)表示，以 t 检验进行显著性检验。结 果1 脂联素对 H：o：引起细胞凋亡的影响 H：0，能明显促进HUVECs 的细胞凋亡，与对照组比较，凋亡细胞数增加约25(Conrol 伪 H：0：，P001，n=5)，用 APN 30 mgIJ 预处理细胞后，能明显抑制 H。0：引起的细胞凋亡作用(H202 伪APINI+H202，P001，巧=5)，见图 1。2 脂联素对脂质过氧化物 1VIDA 含量的影响 200 1 吨 molL H202 孵育 HUVECs 6 h 后，显著加剧细胞膜脂质过氧化反应，IVIDA 含量明显增加。脂联素 30 msL 预孵 l h 对 H：O ：所致MDA 增加有明显的抑制作用，见表 l。
