1、- 1 -华 南 师 范 大 学 实 验 报 告学生姓名 林 鸿 锦 学 号 20070004002 专 业 综合理科二班 年级、班级 07 级 课程名称 生物化学实验 实验项目 脂肪酸的 氧化 实验类型 验证 设计 综合 试验时间 2008 年 11 月 17 日实验指导老师 陈 文 利 实验评分 一、目的通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定 -氧化作用的方法及其原理。二、原理在肝脏内脂肪酸经 -氧化生成乙酰辅酶 A，两分子乙酰辅酶 A 缩合成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成 -羟丁酸。乙酰乙酸、-羟丁酸和丙酮总称为酮体。本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可
2、用碘仿反应测定。在碱性条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下： COH 2CHOCH2-OCH 32223323 丙 酮脱 羧丁 酸 碘 仿 2NaI3Na 232剩余的碘可用标准 Na2S2O3滴定： aIOSaIHClIl642322根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。三、材料、试剂和仪器（一） 材料新鲜兔肝（二） 试剂1、0.1%淀粉溶液（溶于饱和 NaCl）2、0.5mol/L 丁酸溶液3、20%三氯乙酸溶液4、10%氢氧化钠溶液- 2 -5、10%盐酸6、0.1mol/L 碘溶液7、标准 0.02mol/L 硫代硫酸钠溶液8、1/15m
3、ol/L，pH7.6 磷酸盐缓冲液（三） 器具1、 漏斗2、 碘量瓶3、 试管及试管架4、 移液管（5mL，10mL）5、 碱性滴定管6、 恒温水浴锅四、实验过程（一） 肝匀浆的制备实验室已准备好新鲜的兔肝匀浆以及煮沸过的兔肝匀浆。（二） 酮体的生成取大试管两支，分别编号，按下表操作。 （单位：mL）大试管编号 A B加入新鲜肝匀浆 - 2.0加入预先煮沸肝匀浆 2.0 -加入 pH7.6 磷酸缓冲液 3.0 3.0加入正丁酸溶液 2.0 2.037恒温水浴保温 40min 后分别加入 20%三氯乙酸，摇匀后室温放置 10min。现象及分析溶液呈乳白色，沉淀不明显（煮沸的时候蛋白质已变性） 有
4、大量暗褐色沉淀（与三氯 乙酸反应，蛋白质变性）分别过滤，收集滤液，得无蛋白溶液。加入三氯乙酸前的 B 试管 加入三氯乙酸后（左 A 右 B，A 中部分溶液已在过滤） （三） 酮体的测定取碘量瓶两只，编号后按下表操作。 （单位：mL）碘量瓶编号 A B加入无蛋白溶液 5.0 5.0加入 0.1mol/L 碘液 3.0 3.0加入 10%氢氧化钠溶液 3.0 3.0放置 10min，各瓶溶液均呈浅黄色（碘仿颜色） 。再分别滴加 10%盐酸 3mL，使各瓶溶液中和。- 3 -现象及分析 红棕色较深（碘较多） 红棕色较浅（碘较少）用 0.02mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定至碘量瓶中的溶液呈浅黄色，往瓶
5、中滴加 0.1%淀粉溶液2-3 滴，使瓶中溶液呈蓝色。起始刻度 2.3 7.9终止刻度 15.1 19.8消耗量 12.8 11.9加 HCl 前 加 HCl 后的 A 瓶 加 HCl 后的 B 瓶滴定操作（四） 计算试验中所用肝糜中生成的丙酮量（mmol/L）=（A-B）C1/6肝脏生成的丙酮量（mmol/g）=（A-B）C1/621、式中：A 为滴定 A 样品消耗的 0.02mol/L 硫代硫酸钠溶液的 mL 数；B 为滴定 B 样品消耗的 0.02mol/L 硫代硫酸钠溶液的 mL 数；C 为硫代硫酸钠的浓度（mol/L） 。2、为什么乘以 1/6？由实验原理中提供的化学方程式可得到以下
6、关系式：1 CH3COCH3 3 NaOI 3 I 2 6 Na 2S2O3即生成丙酮量是消耗的硫代硫酸钠的 1/6。3、第二条式子为什么多乘了一个 2？- 4 -过程是这样的：5g 肝脏，加 NaCl 稀释至 10mL取用 2mL，即 1g 肝脏加各种试剂后体积为 10mL取用 5mL，即 0.5g 肝脏。第二条式子要求的是每 g 肝脏生成丙酮量，而第一条式子求出的为 0.5g 肝脏生成的丙酮量，因此要乘以 2。4、代入数据计算，试验中所用肝糜中生成的丙酮量（mmol/L）=（12.8-11.9）0.021/6=0.003；肝脏生成的丙酮量（mmol/g）=0.0032=0.006五、实验讨
7、论（一） 注意事项1、 在低温下制备新鲜的肝糜，以保证酶的活性。2、 加 HCl 溶液后即有 I2 析出，I 2 会升华，所以滴定迅速，滴定的速度是前快后慢，当溶液变浅黄色后，加入指示剂就要慢慢一滴一滴地滴。3、 滴定时淀粉指示剂不能太早加入，只有当被滴定液变浅黄色时加入最好，否则将影响终点的观察和滴定结果。因为如果过早加入淀粉指示剂会使淀粉与碘产生络合物，而显蓝色。影响碘仿反应的颜色观察。从而影响滴定结果。（二） 为什么说制备新鲜的肝匀浆是本实验的关键？因为催化酮体生成的酶主要在肝细胞线粒体内膜上，肝脏是酮体生成的主要场所。（三） 脂肪酸的 -氧化过程脂肪酸的活化 胞浆中的硫激酶催化中短链脂
8、肪酸活化；内质网膜上的酶活化长链脂肪酸，生成脂酰 CoA，进入内质网用于甘油三酯合成； 线粒体膜上的酶活化的长链脂酰 CoA，进入线粒体进入 -氧化。脂酰 CoA 进入线粒体 长链脂肪酰 CoA 和载体肉毒碱脂 酰转移酶 I 反应，生成辅酶 A 和脂酰肉毒碱，后者进入线粒体内膜。位于线粒体内膜内侧的肉毒碱脂酰转移酶又使脂肪酰肉毒碱转化成肉毒碱和脂酰 CoA，肉毒碱重新发挥其载体功能，脂酰 CoA 则进入线粒体基质，成为脂肪酸 -氧化酶系的底物。脂肪酸的 -氧化 脱氢(dehydrogenation) 反应，生成具有反式双键的 ,-烯脂肪酰辅酶 A。加水（hydration)反应，生成具有 L-
9、构型的 -羟脂酰CoA。脱氢反应，生成 酮脂酰 CoA。硫解（thiolysis) 反应，生成乙酰 CoA 和一个少两个碳原子的脂酰 CoA。（四） 脂肪酸 -氧化的生理意义脂肪酸 -氧化是体内脂肪酸分解的主要途径，脂肪酸氧化可以供应机体所需要的大量能量。脂肪酸 -氧化也是脂肪酸的改造过程，机体所需要的脂肪酸链的长短不同，通过 -氧化可将长链脂肪酸改造成长度适宜的脂肪酸，供机体代谢所需。脂肪酸 -氧化过程中生成的乙酰 CoA 是一种十分重要的中间化合物，乙酰 CoA 除能进入三羧酸循环氧化供能外，还是许多重要化合物合成的原料，如酮体、胆固醇和类固醇化合物。（五） 脂 肪 酸 的 特 殊 氧 化
10、 形 式1、丙酸的氧化奇数碳原子脂肪酸，经过 -氧化除生成乙酰 CoA 外还生成一分子丙酰 CoA，某些氨基酸如异亮氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的分解代谢过程中有丙酰 CoA 生成，胆汁酸生成过程中亦产生丙酰 CoA。丙酰 CoA 经过羧化反应和分子内重排，可转变生成琥珀酰 CoA，可进一步- 5 -氧化分解，也可经草酰乙酸异生成糖。2、 -氧 化脂肪酸在微粒体中由加单氧酶和脱羧酶催化生成 -羟脂肪酸或少一个碳原子的脂肪酸的过程称为脂肪酸的 -氧化。长链脂肪酸由加单氧酶催化、由抗坏血酸或四氢叶酸作供氢体在 O2和 Fe2+参与下生成 -羟脂肪酸，这是脑苷脂和硫脂的重要成分，-羟脂肪酸继续氧化脱羧就生成
11、奇数碳原子脂肪酸。-氧化障碍者不能氧化植烷酸(phytanic acid,3,7,11,15-四甲基十六烷酸)。3、-氧化 脂肪酸的 -氧化是在肝微粒体中进行，由加单氧酶催化的。首先是脂肪酸的 碳原子羟化生成 -羧脂肪酸，再经 醛脂肪酸生成 ,-二羧酸，然后在 -端或 -端活化，进入线粒体进入 -氧化，最后生成琥珀酰 CoA。4、 不 饱 和 脂 肪 酸 (unsaturated fatty acid)的 氧 化 体内约有 1/2 以上的脂肪酸是不饱和脂肪酸，食物中也含有不饱和脂肪酸。这些不饱和脂肪酸的双键都是顺式的，它们活化后进入 -氧化时，生成 3-顺烯脂酰 CoA，此时需要顺-3 反-2
12、 异构酶催化使其生成 2-反烯脂酰 CoA 以便进一步反应。2-反烯脂酰 CoA 加水后生成 D-羟脂酰 CoA，需要 -羟脂酰 CoA 差向异构酶催化，使其由 D-构型转变成 L-构型，以便再进行脱氧反应(只有 L-羟脂酰 CoA 才能作为 -羟脂酰 CoA 脱氢酶的底物)。不饱和脂肪酸完全氧化生成 CO2 和 H2O 时提供的 ATP 少于相同碳原子数的饱和脂肪酸。（六） 课外拓展：奶 粉 添 加 脂 肪 酸 可 增 加 婴 儿 智 慧一项新研究显示，在婴儿喝的婴儿奶粉中添加两种脂肪酸可能增加婴儿智慧。研究员研究 56 名喂食婴儿奶粉的孩子，一些孩子的婴儿奶粉内添加两种特殊脂肪酸，另一些孩
13、子没有添加这些脂肪酸，结果喝了有脂肪酸婴儿奶粉的婴儿在记忆力、解决问题能力和学习语言能力等各方面都比没有喝脂肪酸的婴儿高七个百分点。这两种脂肪酸是二十二碳六烯酸和花生四烯酸。事实上人类母奶内都含有这两种脂肪酸，过去对婴儿进行心理测验一再显示吃母奶婴儿比吃牛奶婴儿聪明一些。欧洲有些婴儿 食 品 公 司 早 已 把 这 两 种 脂 肪 酸 掺和 在 婴 儿 奶 粉 里 ， 美 国 还 没 有 食 品 公 司 这 样 做 。波士顿儿童医院加克希克医师说，这个问题在婴儿营养上长久以来引起很大争议，虽然值得进一步研究，可是区别没有多大。【参考文献】1许秀珍，梁山.生物化学与分子生物学实验指导M.广州：暨南大学出版社，2003.98-1012 http:/
