1、,实验八 脂肪酸-氧化作用,一、目的与任务,了解脂肪酸的-氧化作用通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定-氧化作用的方法及其原理,二、实验原理,在肝脏中，脂肪酸经氧化作用生成乙酰辅酶A。2分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成-羟丁酸。乙酰乙酸、-羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。,问题：为什么要生成酮体，其意义是什么？,氧化的生化历程,乙酰CoA,RCH2CH2CO-SCoA,脂酰CoA 脱氢酶,脂酰CoA,-烯脂酰CoA 水化酶,-羟脂酰CoA 脱氢酶,-酮酯酰CoA 硫解酶,RCHOHCH2COScoA,RCOCH2CO-SC
2、oA,RCH=CH-CO-SCoA,+,CH3COSCoA,R-COScoA,乙酰CoA,酮体的生成肝脏,羟甲基戊二酸单酰CoA（HMGCoA）,脂肪酸,硫解酶,2CH3COSCoA,CH3COCH2COSCoA,乙酰乙酰CoA,HMG-CoA合成酶,CH3COSCoA,CoASH,-氧化,CoASH,2NaOH+I2 NaOI + NaI + H2O CH3COCH3+3NaOI CHI3+CH3COONa+2NaOH 剩余的碘用标准硫代硫酸钠溶液滴定：NaOI+NaI+2HCl I2+2NaCl+H2OI2+2Na2S2O3 Na2S4O6+NaI,碘仿,本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的
3、丙酮在碱性条件下，与碘生成碘仿。反应式：,问题：为什么说本实验的关键是制备新鲜的肝糜?,根据滴定对照与滴定样品所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。,三、实验器材,5ml微量滴定管 恒温水浴 吸管 剪刀 50ml 锥形瓶 漏斗 试管及试管架,四、试剂与材料,鲜猪肝：0.5g/ml0.5%淀粉溶液：0.5g淀粉溶解于水中，定容至100ml0.9%氯化钠溶液：0.9g氯化钠溶解于水中，定容至100ml0.5M丁酸溶液：取5ml丁酸溶于100ml0.5M氢氧化钠溶液中15%三氯乙酸溶液：15g三氯乙酸溶解于水中，定容至100ml,10%氢氧化钠：10g氢氧化钠溶解于水中，定
4、容至100ml10%盐酸：10ml浓盐酸稀释至100ml0.2M碘液：25.4gI2+50gKI定容到1000ml，用标准0.05M硫代硫酸钠标定标准0.01M硫代硫酸钠：将已标定的0.05M硫代硫酸钠稀释成0.01M1/15M PH7.6磷酸缓冲液：1/15M Na2HPO4 86.8ml+1/15M NaH2PO4 13.2ml,五、操作步骤,肝糜制备：取肝用0.9%NaCl冲洗污血，用滤纸吸去表面水分。称肝组织5g置研钵中，加少量的0.9%NaCl研成细浆。再加0.9%NaCl到总体积10ml。取2个50ml锥形瓶，各加入3ml 1/15M磷酸盐缓冲液（pH7.6）。其中一个锥形瓶中加2
5、ml正丁酸，另一个锥形瓶中不加正丁酸（对照）。再各加入2ml肝糜。混匀于43恒温水浴内保温1.5小时。,取出锥形瓶，各加入3ml 15%三氯乙酸，混匀，对照瓶内追加2ml正丁酸，混匀，静置15min。分别过滤，滤液收集在2支试管中。 酮体测定：吸取两种滤液各2ml分别放入另2个锥形瓶中，各加3ml 0.1M碘液和3ml 10%NaOH。摇匀，静置10min。加入6ml 10%盐酸中和。 用0.01M标准硫代硫酸钠滴定剩余的碘。滴至浅黄色时，加入3滴0.1%淀粉作指示剂。摇匀，滴至蓝色消失为止。记录所消耗的硫代硫酸钠液的ml数。,问题： 15%三氯乙酸的作用是什么?,肝脏的丙酮含量（mmol/g
6、）=（AB）* CNa2S2O3 * 1/6 *5A：滴定对照所消耗的0.01M硫代硫酸钠溶液的ml数 B：滴定样品所消耗的0.01M硫代硫酸钠溶液的ml数 CNa2S2O3:标准硫代硫酸钠溶液的浓度（M） 1/6：1mol标准硫代硫酸钠相当于丙酮的量,六、结果计算,七.课后研讨题,1、总结本实验操作的关键环节和注意事项。 2、酮体为什么只能在肝外组织进行作用？ 3、什么叫酮体？为什么正常代谢时产生的酮体含量少？在什么情况下血中酮体含量增高，而尿中也能出现酮体？ 4、为什么测定碘仿反应中剩余的碘可以计算出样品中的丙酮的含量？ 5、查阅资料，介绍在哪些情况下会促进脂肪酸的氧化?。 6、查阅资料，介绍酮体检测的方法，参考值及临床意义？,八、汇报要求,以大组为单位课后总结结果，讨论，制作一份ppt，课内讨论汇报。ppt内容包括：实验目的，实验条件的选择，各小组实验结果，计算结果和分析，课后研讨题，实验体会等。,
