望道学者结题报告.doc

1、 项目编号：05042望道学者结题报告课题名称：Flufenamic acid 对钾通道 IA 的双向调节研究 最终成果形式 （ 报告 论文 其他 ）该成果是否发表（ 是 否 ）成果发表期刊名称 Molecular Pharmacology 项目申请人： 赵正革 学号 0270136 联系电话： 55077579 e-mail:所在院系(专业) ： 生命科学学院 02 级 导 师： 梅 岩 艾 教授 导师单位(部门) ： 生命科学学院 生物物理系 填表日期： 2006 年 5 月 12 日 复旦大学教务处制表 致 谢本试验是在梅岩艾教授的悉心指导下完成的，他严谨治学的作风、丰富的专业知识和对学

2、生无微不至的关心给了我很大的帮助，使我受益良多。在立人实验室学习期间，感谢张文玲博士、焦松、刘琳云、廖磊，曾曦珉、刘征、费晓玮、张曼等师兄师姐们的认真指导和无私的帮助。目 录概要前言材料与方法结果与分析感想概 要本实验以原代培养的大鼠小脑颗粒细胞为模型，应用膜片钳技术中全细胞电流模式记录，Flufenamic acid 对颗粒细胞的电压依赖性瞬时激活钾通道（ IA）的作用。Flufenamic acid（FA）是属于非甾体类抗炎药物（Nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）的一种芬那酸（fenamates）类药物。通过实验发现，FA 对 IA 有

3、双向调节作用，包括胞外高与低浓度的作用完全相反（高时抑制，低时增大） 、胞内与胞外作用相反（胞外抑制，胞内增大） 。胞外高浓度作用的效果比较迅速，胞外低浓度与胞内作用的效果比交换缓慢。胞外与胞内作用通过的途径之间并无影响。FA 能够使得 IA 的通道动力学特性改变，FA 100M 在胞外作用时发现 IA 的激活与失活特性曲线都往右移。最后我们发现把 IA 亚单位 Kv1.1、Kv4.2、Kv4.3 干扰掉以后，没能消除 FA 的胞外抑制作用。前 言在本课题中所研究的药物是属于非甾体类抗炎药物（nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）主要用于抑制非

4、特异性炎症和由炎症等引起的疼痛的治疗。一般认为，NSAIDs 主要是通过抑制环氧化酶活性而抑制了合成炎性物质前列腺素（PGE2）而起到消炎止痛散热的药效。临床和基础研究提示芬那酸（fenamates）类的 NSAIDs 可能对中枢神经系统具有保护作用，并被临床试用于抗早老性痴呆的治疗，但由于其在神经元上的作用机制研究和了解不多，是否只是与 PGE2 的合成酶活性抑制有关，还是有争议的，这样给临床抗早老性痴呆的治疗运用中带来了危机。因此，研究它们对神经元上的作用机制，不仅对老药新用具有临床探讨价值，对神经退行性疾病发生发展机制的认识也有着重要意义。近十年来的研究表明，细胞膜离子通道特别是钾通道开

5、放引发的细胞容量变化，信号蛋白分子的激活参与了神经元凋亡的发生发展。但是凋亡信号是如何引起钾离子通道活动异常的，钾离子通道的异常活动又是如何影响到下游的与凋亡有关的蛋白，细胞膜脂是否设计等等都有待深入研究。我们实验是在大鼠小脑颗粒细胞这一国际同行常用的神经元凋亡模型上的研究证实了，不仅电导比较大的延迟整流钾通道 IK 参与了该神经元的凋亡发生，并且一种瞬时激活的 IA 钾通道也参与了凋亡过程而且 PKC 信号通路激活磷酸化 IA 钾通道蛋白后，可使该电流增大，促进神经元凋亡的发生，SiRNA 实验结果还进一步说明 PKC可能通过对 Kv1.1 亚单位的修饰作用调控 IA 钾通道。此外我们实验室

6、也证实了，颗粒细胞神经元 IA 钾通道 Kv4.2 亚单位可以被钙离子和花生四烯酸调控。另外在对 NSAIDs 的研究过程中已经观测到，Diclofenac acid 具有促进 IA 钾通道开放引发细胞凋亡的作用。这里我简单介绍一下，我在课题中所使用的膜片钳技术。膜片钳技术是在 1978 年由 Neher 和 Sakmann 发明的，即 Patch Clamp Technique。1981 年，Hamil，Neher 等人由对最早的膜片钳方法和电子线路做了较大改进，使此方法基本成熟，成为今天广泛应用的实验技术。膜片钳技术本质上属于电压钳范畴，但电压钳位方法研究的是很多通道并存的相对较大的一段膜

7、区域，而膜片钳可以直接进行单通道的观察。另外，两者区别还在于他们实现膜电位固定的方法不同，以及电位固定的细胞膜面积不同，进而所研究的离子通道数目不同。因此，电压钳只能用于研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动，而膜片钳则可以用来研究小片膜上一个或几个离子通道的电流。膜片钳方法实现膜电位固定的关键步骤是玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高祖密封，其阻抗数值可达 10-100G 欧姆（此密封电阻是指微电极内与细胞外夜之间的电阻） 。由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零。形成高祖密封的里主要有氢键、范得华力、盐键等。此密封不仅电学上几乎绝缘，在机械上也是极牢固的。又由

8、于玻璃微电极尖端管径很小，其下摸面积仅约 1m2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个，或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略。也就是说，电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略。那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定，膜片钳技术及时通过负反馈电子线路，向电极内注入一与离子电流幅度相等、极性相反的电流，保持电极内电位不变，而达到电压钳的目的。注入电极内的电流可测得，从而也就知道了离子电流。这样，便可研究单个离子通道的活动。Patch Clamp 技术中，膜片与微电极顶端开口周缘部分的高阻封

9、接是至关重要的。为此，一方面待测细胞膜表面常用酶处理而呈光滑的外观表面，这两方面的清洁措施保证了负压吸附后的有效高阻封接。除此之外，因单通道记录的离子流在 pA 水平，因而排除外界干扰和尽量压低输入噪声也是极其重要的不可缺措施。根据膜片与电极之间的关系，可将膜片钳记录分为以下几种，低阻封接模式（low resistance seal） ，连接细胞模式（cell attached） ，全细胞记录模式（whole cell recording） ，外侧向外膜片（outside-out patch）和内侧向外膜片（inside-out patch ）模式。材料与方法1颗粒细胞的培养A. 材料：1）出

10、生后 6-8 天的 SD 大鼠。2）五种解剖用液：N1 100ml Krebs 0.3g BSA 0.8ml MgSO4N2 25ml N1 6.25mg TrypsinN3 15ml N1 1.2mg DNase 7.8mg InhibitionN4 21ml N1 4ml N3N5 12.5ml N1 0.1ml 1M MgSO43)终培养液：DMEM 44.5ML胎牛血清 5mlInsulin 5g/mlAntibody 0.5mlKCl 93.2mgGlucose 100mgB. 处理方法：1）细胞培养：采用原代培养法。取实验动物，取出组织，剪成小块，经酶消化成单个细胞，用培养液制成细

11、胞悬液，于 37下培养箱培养，一般 3 小时后细胞开始贴壁。2）准备好解剖用液和终培养液，并分别过滤消毒，N1-N5 个需 5ml.3）取新生大鼠小脑，去脑膜，剪碎后加入 5ml N1 液，瞬时离心后，弃上清夜。4）沉淀中加入 5ml N2 液，消化 5-10 分钟，同时不停轻摇离心管。将 N4 加入N2 中，抑制消化，轻摇离心管，使细胞团均匀分散，瞬时离心后吸除上清夜。5）加入 N3 到离心管中，机械性消化，用 9 号针头进一步进行机械消化。6）加入 N5,1000rpm 离心 5 分钟，弃上清夜，加 5ml 终培养液，充分混匀细胞。7）记数，以 106每毫升的密度接种入培养皿中。培养皿底涂

12、有多聚赖氨酸（涂有多聚赖氨酸的培养皿有利于颗粒细胞的贴附和生长） 。2细胞外液、内液、药物1）细胞外液：NaCl 125mMKCl 1.5mMHEPES 10mMMgCl2 1mMTEA 20mMTTX 0.5M2) 细胞内液：K gluconate 135mMKCl 10mMHEPES 10mMEGTA 10mMCaCl2 1mMMgCl2 1mM3) 药物以 DMSO 为溶剂配成的母液。后面的稀释过程中，保证 DMSO 的浓度小于 0.1%。结果与分析1. DMSO 的影响FA 是一种脂类物质，所以只能溶解在类似于 DMSO 的特殊溶剂中。所以我们做实验之前一定要先排除这种溶剂对钾通达的有

13、可能的影响。它分为胞内与胞外两种情况所观察到的结果表明，两种情况下浓度为 0.1%的时候都毫无影响。(Fig 1)图 A 图 BFig 1. 图 A:胞内放浓度为 0.1%的 DMSO 时的效果图图 B:胞外放浓度为 0.1%的 DMSO 时的效果图2. FA 在胞外作用 （DMSO 浓度均为 0.1%）1) 高浓度 100M给药的方法是重力给药法，Fig 2 中我们可以看到给药以后电流很快的减小说明 FA 在胞外高浓度作用时，它会直接作用于钾通道上面。2) 低浓度 10M 给药方法是一样，Fig 3 种我们可以看到它的效果是非常缓慢的增大。说明低浓度作用时，可能就是通过第二信使参与此过程中。

14、3) 浓度依赖性浓度为 20M 以上时，效果均为抑制作用，并且抑制率都差不多，它们之间没有显著性差异，说明它在胞外抑制作用是没有浓度依赖性的。 （Fig 4）Fig 2. FA 100M 在胞外效果Fig 3. FA 10M 在胞外效果01020304050607080901010.0.20.40.60.81.01.21.41.6IFA /ICTRLFA (uM )Fig 4. 浓度依赖性3. FA 胞内作用通过胞外给药时的结果，我们便可猜测 FA 低浓度时增大作用是否通过胞内的某种途径。下面的结果中我们证实了其想法，胞内给药时无论是高浓度（100M）还是低浓度（10M）电流都会增大。 （Fi

15、g 5）Fig 5. 胞内给药效果4. 胞内胞外同时作用我们确定了胞内胞外作用的基础下，再观察了他们之间的影响。先胞内给药的情况下，在胞外给同样浓度的 FA，发现胞外抑制作用还是会出现，说明这两者之间并无影响。 （Fig 6）图 A图 BFig 6. 胞内胞外给药 图 A：电流图 图 B：示意图5. 通道动力学特性研究 （胞外给药，FA 浓度为 100M）1) 激活Fig 7 中我们可以看到，给药以后激活曲线往右漂移，说明 FA 作用以后通道变得不容易激活。图 A图 BFig 7. 激活曲线图 A：电流曲线 图 B：转成电导以后的曲线2) 失活Fig 8 中我们可以看到，给药以后失活曲线往右漂

16、移，说明 FA 作用以后通道变得不容易失活。图 A图 BFig 8. 失活曲线图 A：电流曲线 图 B：标准化曲线6. 通道亚单位研究IA 钾通道最典型的有三种亚单位，Kv1.1、Kv4.2、 Kv4.3。我们将这些亚单位用 SiRNA 干扰方法来干扰掉它们的表达以后，观察了 FA 胞外阻断作用是否依然存在。结果无论是干扰了哪个亚单位，都还是有跟正常细胞时同样的阻断作用。 （Fig 9）ctrl Kv1. Kv4.2Kv4.30.0.50.10.150.20.250.3Inhibtion (%) SubnitFig 9. 亚单位干扰效果感 想我是来自朝鲜的留学生，现在在生命科学学院读本科，今年

17、即将要毕业了。我在中国的这五年里有很多感想，但对我觉得最深刻的就是这次参加望道学者的经历，通过此次机会我学会了太多太多的东西。当初我是实验室导师的鼓励下参加此学术活动的，我觉得望道学者给我定了一个明确的目标之后，后面我在实验室的科研活动中带来了很大的活力，没有它至今的我不可能有这样的成果，这也许是我科研生涯的一段很好的开始，所以我真的非常感谢复旦大学给了我这样的机会，让我成长了不少。这一年以来我遇到过很多困难，有一次我遭到了前面几个月辛辛苦苦做出来的结果都要废弃，当时我真的感觉心里很恐慌，甚至有过放弃之心。后来我阅读了望道学者前辈们留下的很多经历，才发现自己多么懦弱，然后我在很多师兄师姐，尤其是导师的鼓励和无私的帮助下，重新振作起来进入了新的实验，做出了今天这样的成果。我现在觉得很自豪，不是因为我在本科期间能在国际杂志上面发表一篇文章，而是我在此过程中找回了自我。最后我真的非常感谢望道学者给我了这么好的机会，我会将永远记住这一段美好的经历。