1、辐射损伤对小鼠不同组织 VEGF 表达的影响Feb.2008.28(0 实验动物与比较医学 LaboratoryAnimalandComparativeMedicine27辐射损伤对小鼠不同组织 VEGF 表达的影响孙斌 t,杨占山 z,周正宇,金美芳 t(1.苏州大学附属儿童医院,苏州 215003;2.苏州大学放射医学与公共卫生学院,苏州 215123;3.苏州大学医学院实验动物中心,苏州 215007)【摘要目的探讨小鼠肺,胸腺,小肠,脾不同组织受到辐射损伤后血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA 的表达及意义.方法使用不同剂量(O,4,8Gy)的 x 射线照射小鼠,然后取其肺,胸腺,
2、小肠,脾组织.用逆转录多聚酶链反应(RT PcR)法研究照射后 24h 不同组织中的 VEGFmRNA 表达水平.结果经 4,8Gy 射线照射后 24h,肠,肺组织 VEGFmRNA 表达水平与正常对照组相比,无显着差异 P0.05).脾,胸腺组织 VEGFmRNA 表达水平与正常对照组相比,均升高.4Gy 射线照射后 VEGFmRNA 表达水平与其它剂量射线照射组相比显着升高(PO.01).结论不同剂量辐射损伤后脾,胸腺组织 VEGFmRNA 表达增强,肠,肺组织VEGFmRNA 表达变化差异不大,VEGF 可能对免疫系统比对其他组织的辐射防护作用大,这为放射性损伤的治疗提供了理论依据.【关
3、键词血管内皮细胞生长因子;辐射损伤;肺;胸腺;小肠; 脾;VEGFmR.NA【中图分类号R811.5【文献标识码A【文章编号10048448(2008)01002703随着核能,核电和核技术的发展,从事与放射性相关的工作人员不断增加,职业性超剂量照射和事故性辐射损伤时有发生.另外,x 线等放射诊断技术给人类带来了巨大利益的同时也给受检查者造成了一定的辐射损伤.辐射损伤是辐射与物质分子的作用.而且,辐射损伤所致免疫抑制和继发感染常危及生命.我国规定儿童在体检时不应常规做 x 线检查.但在临床上,由于 x 线,CT,MRI 等放射性检查在现代医学中重要的诊断价值,往往难以避免,尤其是在新生儿时期.
4、辐射损伤对患儿的免疫功能造成极大的破坏;此外,恶性病的发病率也会提高.故而,如何预防或尽量减轻因医疗检查带来的辐射损伤,已经成为新生儿医生面临的又一课题.血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowth【收稿日期】2007-08-06【作者简介】孙斌(1969 一),医学博士,副主任医师,研究方向新生儿辐射损伤.factor,VEGF)是血管内皮细胞特异性刺激因子,在炎症反应中可调节多种细胞因子的表达.VEGF 在体内具有多种功能,能特异性地作用于来源于动脉,静脉以及淋巴管的内皮细胞,促进血管内皮细胞增殖加速血管形成增强血管通透性维持血管正常结构和功能.VEGF 以其对血管
5、内皮细胞的高度亲和力和强大的血管生成作用受到广泛关注,在周围血管疾病,肿瘤,糖尿病,创伤修复及组织重建等领域受到广泛研究和初步应用.1 材料与方法1.1 实验动物分组及照射SPF 昆明小鼠 24 只,雌雄不限,体重 2O2g,由苏州大学实验动物中心提供SCXK(苏)200200081.小鼠随机分成 3 组,每组 8 只,将各组小鼠采用 Varian 直线加速器 6MVX 线照射,SSD( 源皮)100cm,剂量分别为 0,4,8Gy,剂量率2Gy/min.分别于照后 24h 处死小鼠取样检测.28 实验动物与比较医学 LaboratoryAnimalandComparativeMedicine
6、Feb.2008.28(1)注:肺,小肠各组间均无显着差异(尸 I0.05);胸腺 ,脾 4Gy 照射组与正常对照组相比,?P0.011.2RT.PCR 法测 VEGF 的 mRNA 表达1,2.1PCR 引物根据引物设计原则,并参照文献,借助引物设计软件 OLIGO6.0,设计 VEGF,及内对照 13-actin 的上,下游引物如下 :内对照3-actin 引物(产物大小 764bp):上游引物 F5.CTGTCCCTGTATGCCTCTG.3:下游引物 R:5.ArGTACGCACGA 眦 C-3,预计扩增片断长度人小 218bp.VEGF 上游引物 F:5一 AGACAATGGG.AT
7、GAAAGG.3:下游引物 R:5.AGATGAGGAAGGGTAAGC.3,预计扩增片断长度大小 554bp.1.2.2 检测方法采用半定量 RT.PCR 法检测各种组织中 VEGFmRNA 的表达.引物由上海生物工程技术有限公司合成.按照试剂盒说明步骤操作.1.2.3 统计学处理采用 SPSS10.0 医学统计软件进行分析处理.所有结果用均数标准差()表示.组间均数比较用 t 检验,组内比较用方差分析.2 结果不同剂量射线照射后 24h,肺及小肠组织VEGFmRNA 表达水平与正常对照组相比略有升高但无统计学差异(0.05)(表 1).而脾,胸腺组织VEGFmRNA 表达水平与正常对照组相
8、比,4Gy 射线照射后显着升高(尸O.01),8Gy 射线照射后无显着差异(PO.O5)(表 1).3 讨论电离辐射造成的辐射损伤是辐射与物质分子的作用,已知 X 射线,Y 射线使物质分子电离或激发,使生物大分子损伤:使核酸大分子解聚,交联,链断裂,碱基破坏,脱氧戊糖变化等.而且,辐射损伤所致免疫抑制和继发感染常危及生命.放射治疗作为恶性肿瘤的一种常规治疗手段,在治疗的同时也不可避免地带来辐射损伤,引起机体免疫功能低下.VEGF 是辐射后血管增殖重要的调节因子,它在促进血管内皮细胞增殖,抗凋亡以及促使受辐射的组织形成新生血管中起到重要作用.体内研究表明,VEGF 和抗凋亡蛋白 Bc1.2 具有
9、协同作刚,使得内皮细胞免于凋亡,抑制 VEGF 受体增加辐射对微血管的破坏,表明 VEGF 对内皮细胞具有辐射防护作用,增加机体对辐射的抗性.然而,在放化疗过程中正常机体受损伤的不仅仅只是造血系统,现在已经清楚地知道淋巴系统的放射敏感性是高的.胸腺是机体的中枢免疫器官之一,淋巴细胞在此发育,分化,成熟,对辐射十分敏感.已有实验证实,0.2Gy 以上的剂量即可诱导剂量依赖性的胸腺细胞凋亡增多,1Gy 可使凋亡发生率增高约 50%rq.本实验观察到,4Gy射线照射后 24h,胸腺组织 VEGFmRNA 表达水平显着升高,VEGF 可能具有保护胸腺免受辐射损伤的功能.脾脏是重要的周围免疫器官,其细胞
10、成分较胸腺复杂,但其有核细胞的辐射反应与胸腺类似【3】.本实验观察到,经不同剂量射线照射后 24h,脾组织 VEGFmRNA 表达水平与正常对照组相比升高明显,VEGF 可能提高脾对抗辐射损伤的功能.肠道是辐射敏感器官之一,尤其是小肠隐窝干细胞对辐射高度敏感.辐射损伤后,肠道黏膜屏障功能减弱甚至消失肠道细菌及细胞分解物进入血循环后引起的菌血症及严重的水电解质平衡失调是重要致死因素【4】.放射性肺损伤是核辐射事故,骨髓移植预处理及胸部肿瘤放疗后常见的并发症,临床一般表现为早期的放射性肺炎和后期的放射性肺纤维化.这种并发症的存在,一定程度上限制了放射治疗的剂量,降低了患者的生活质量【s1.本实验通
11、过观察经不同剂量射线照射后 24h,肠组织及肺组织 VEGFmRNA 的表达水平,发现其与正常对照组无显着差异.可能用 VEGF 来预防肠组织及肺组织的辐射损伤,作用不大.Feb.2008.28(I)实验动物与比较医学 LaboratoryAnimalandComparativeMedine29VEGF 作用机理尚未完全明了,VEGF 可诱导细胞表达丝氨酸酶,尿激酶型纤维蛋白溶酶激活因子(tPA】,组织型纤维蛋白溶酶激活因子(uPA)和 PA抑制因子 I(PAI.1),并可增加 uPA 受体(uPAR)的表达,uPA 及 tPA 可激活纤维蛋白溶酶原成为纤维蛋白溶酶.VEGF 还可增加金属蛋白
12、酶和间质性胶原酶的表达.PA 及胶原酶的降解作用为细胞的迁移及生长创造了有利环境【6,】.VEGF 受体属酪氨酸蛋白激酶受体,受体与VEGF 结合后,受体与含有 SH2 区的底物结合并促使底物磷酸化,包括 PLC.Y,PI.3.K,ras 蛋白等,由其传递有丝分裂信号【8.对于 Flt.1 及 KDR受体在信号传递中的作用尚存在分歧,Ling 等【9研究证明 KDR 受体与 VEGF 结合后可促使其底物磷酸化并传递趋化性及促有丝分裂信号,而 Flt.1 却无此功能,但其能增加 Src 家族磷酸化水平.Barleon等【10】发现 Flt.1 能介导单核细胞迁移 ,而 KDR 却无此功能.辐射作
13、用于细胞,组织时,通过激活丝裂原活性蛋白激酶途径增加 VEGF 的表达,同时,内皮细胞在辐射作用下也会上调 VEGFR.2 的表达.当肺鳞癌细胞系(RERF.LC.AT)受 15GlyX 射线和碳离子辐射后 1624h,VEGFmRNA 较对照组上调2.5 倍,VEGF 蛋白也较对照组明显增高,与传能线密度无关,但是与剂量呈依赖性关系.【参考文献】【l】GengL,DonnkllyE,McMahonG,eta1.Inhtbitionofvascularendothelialgrowthfactorreceptorsignalingleadstoreversaloftumorresistance
14、toradio-therapyJ.CancerRes,200l,61(6):24I3-24I9.【2】牟颖,刘树铮,刘建香,等.x 射线照射小鼠胸腺细胞gadd45 及 Rb 蛋白表达的影响【J】.中华放射学与防护杂志,l998,l8:408.409.【3】海涛,杨岚,田琼,等.血小板第 4 冈予对辐射损伤小鼠免疫功能的保护作用【J】.两北国防医学杂志,2006,27(3):l6l?l63.【4】王欣茹,余祖胤,黄海潇,等.RhIL.11 对中子照射小鼠肠损伤的治疗作用【J】.解放军医学杂志,2005,3O(3):201203.【5】AndoS,NimaK,IshiharaH,eta1.Ind
15、uctionbycarbon-ionirradiationoftheexpressionofvascularendothelialgrowthfactorinlungccinomacells【J 】.IntJRadiatBiol,2000,76(8):II21 一 l127.【6】TenDamGB,StanRV,SweepFC,eta1.AntibodyGD3G7selectedagainstembonicglycosaminoglycansdefineschon?droitinsulfate?Edomainshighlyup?regulatedinovariancancerandinvolv
16、edinvascularendothelialgrowthfactorbindingJ.AmJPathol,2007,78(5):l154 一 l159.【7】YaoJC,WangL,GongW,eta1.AssociationbetweenexpressionoftranscriptionfactorSplandincreasedvascularendothelialgrowthfactorexpression,advancedstage,andpoorsurviva1.npatientswithresectedgasccancerJ.ClinCancerRes,2004,1O(12):4l
17、O9_4l17.【8】BencrertC,JonasS,CramerT,eta1.Transforminggrowthfactorbetalstimulatesvascularendothelialgrowthfactorgenetranscriptioninhumancholangiocellularcarcinomacells【J】CancerRes,2003,63(5):l083?l092.【9】LingY,YangY,LuN,eta1.Endostar,anovelrecombinanthumanndostatin,exertsantiangiogeniceffectviablocki
18、ngVEGF-inducedtyrosinephosphorylationofKDR/FIt?10fendothelialcellsJ.BiochcmBiophysResCommun,2007,361(n:7984.【l0】BarleenB,ReuschP,HarrisAL,a1.SolubleTie2andFitIextracellulardomainsinscramofpatientswithrenalcancerandresponsetoantiangiogenictherapyJ.ClinCancerRes,2001,7(7):1992.1997.TheInfluenceofIradi
19、ateInjuryonVEGFExpressioninDifferentOrganofMiceSUNBin,YANGZhan.san2,ZHOUZhen 一,JINMei?fangfj.TheChildsHospita1.SoochowUniversity,Suzhou215003,China:2.SchoolofRadiationMedicineandPublicHealth,SoochowUniversity,Suzhou215123,China;3.LaboratoryAnimalCenter,SoochowUniversity,Suzhou21500LChina)IAbstract10
20、bjectiveTostudytheexpressionandthemeaningofthevascularendothelialgrowthfactor(VEGF)mRNAinthelung,thymus,intestinesandspleenaftersufferingfromradiativeinjury.(下转第 42 页)42 实验动物与比较学 LaboratoryAnimalandComparativeMedicineFeb.2008.280)的 4 周龄组,8 周龄组小鼠的摄食量和 8 周龄小鼠饮水量差异不显着(P0.05),4 周龄,8 周龄小鼠集尿量和 4 周龄小鼠饮水量差异
21、极显着(P0.001).2.2 集尿怀中杂质情况经 24h 集尿后,国产代谢笼集 4,8 周龄组尿杯中肉眼可见较多杂质,而进口代谢笼均中未见有杂质.2.3 饲料及饮水遗漏情况经 24h 测定后,国产代谢笼内 2 组小鼠每次均可见到遗漏的饲料和饮水,而进口代谢笼内未见到有饲料和饮水遗漏情况.3 讨论实验动物代谢测定的准确性对实验结果的判断非常重要.本实验中,进口代谢笼收集实验小鼠的尿液量平均可达 1.6ml/24h 以上,测得的最多排尿量可达到 2.60ml/24h;显着高于国产代谢笼所表 l 两种代谢笼测得进食量,饮水量,集尿量情况注:进口组与圉:组数据比较:户 I0.00l(上接第 29 页
22、)能收集的尿液量;也高于国外报道【l】的 0.51ml/24h.反映了新式的代谢笼已充分注意其密封性,尽可能减少测试期间尿液的蒸发,较符合小鼠 24h生理正常排尿量.国产代谢笼的集尿瓶中混入了肉眼可见的杂物,其中既有饲料的碎屑,又有与粪便接触后夹带的杂质.这些杂质的存在必将影响尿液的生化指标测定的准确性和不确定性.经 24h 摄食量测定后,在国产代谢笼内普遍存在饲料的碎屑,并有与粪便混合等现象,极难分离.如果收集这样的小鼠粪便,以测定其对饲料营养消化吸收率,则导致测试结果的不准确性,不确定性,误差较人.测定小鼠的饮水量时,通常是把定量后的饮水瓶装上代谢笼;只有在取下饮水瓶后才能测定其中剩水.就
23、在装瓶和取瓶的过程中,因各操作者的手法不一,人为造成或多或少的饮水洒落的现象,导致动物实际饮水量的误差.而代谢/进食.饮水分析系统测定小鼠的代谢时,先将饮水瓶装上笼,然后启动电脑监控程序,显示饮水量;在电脑记录了饮水量,关闭监控程序后,各操作者才取下水瓶.因此,在装瓶和取瓶的过程中,可完全避免导致动物实际饮水量的误差.【参考文献】【1】FoxJG,CohenBJ,LoewFM.LaboratoryAnimalMedicine【M】.London:AcademicPress,Inc.I984.Methods【11emicewereradiatedwithdifferentdosesofXray(
24、0,4,8Gy)andtheexpressionofVEGFmRNAinthelung,thymus,intestinesandthespleenafter24hoursradiationweredetectedbyPT-PCR.ResultsTheexpressionsofVEGFmRNAinintestinesandlungwerefoundtobenosignificantlydifferencefP0.05)withthoseinnormolcontrolgroupsafterradiatedby4and8Gyray.TheexpressionofVEGFmRNAinthespleen
25、andthymusglandwerehigherthanthoseinnormolcontrolgroups.TheexpressionsofVEGFmRNAinthegroupswhichradiatedby4GyweresignificantlyhigherthanothersfP0.01).ConclusionsTheexpressionlevelofVEGFmRNAbecomehigherafterdifferentradiationdoseinthespleenandthymusgland,buthavenosignificantdifferenceintheintestineandlung.nmSVEGFmayhasstrongerradiativeprotectiononinlwlunesystemthan1notherorganizations,whichprovidesatheoraticalbasisfortreatmentofradiativeinjury.IKeywords1VEGF;Radiativeinjury;Lung;Thymusgland;Intestine;Spleen;VEGFmRNA
