1、第五部分 食品微生物检测基础,第一章 食品分析概论 第二章 微生物检测程序 第三章 菌落总数的测定 第四章 霉菌和酵母菌的计数 第五章 大肠菌群的测定 第六章 实验室生物安全基本知识,第一章 食品分析概论,微生物是一群形体非常微小，肉眼看不到或很难看清它的个体的生物。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想象一下每毫升腐败的牛奶中约有50亿个细菌，或者讲毎夸脱牛奶中细菌总数约为5千万，也就是一滴牛奶含有5千万细菌。,第一节 食品微生物简介,微生物种类多，分布广，有些微生物起着有益的作用，有些微生物起着有害的作用。微生物对于食品来说关系尤为密切，很多微生物可应用于食品制造，如制
2、酒、醋、面包、泡菜以及制造菌体蛋白等。但是，有些微生物能引起食物变质败坏，即引起食品气味和组织结构发生不良变化；少数微生物能产生毒素，引起食物中毒或引起人、动植物病害。,微生物除了具有其他生物共同具有的特性，如遗传性和变异性以外，还具有以下一些特性： 个体微小，结构简单。 分布广，种类多。 繁殖快，数量大。 易于变异，适应力强。 易于培养，代谢活力强。,第二节 食品微生物检测所涉及的类群,食品微生物检测所涉及的类群（按有无细胞结构分）：,第三节 食品微生物检测的意义和任务,食品是人类赖以生存所必需的物质之一，提供安全卫生、营养丰富的食品，是保证人类生存和身体健康的基本要求。食品在生产、加工、储
3、备、运输和销售等各个环节都可能受到环境中各种因素的影响和污染，微生物污染尤为常见。因此对食品微生物的检验至关重要。,通过对食品微生物的检验，能够对食品被污染的程度作出评价，为其卫生管理提供科学依据。对微生物的检验结果是衡量食品卫生质量的主要指标之一。微生物的检测不仅利于保障人民身体健康，而且对扩大世界贸易与对外交流具有重大的政治和经济意义。,第二章 微生物检测程序,第一节 样品的采集,采样必须在无菌操作下进行，所有与样品接触的用具（探子、铲子、匙、采样器、试管等）都应经过灭菌。采样时应根据样品的种类如袋、瓶和罐装的，应取完整未开封的包装；若样品很大，应用无菌采样器采样；若样品是固体粉末，应边取
4、边混合；是液体，应振摇混匀后取样；若是冷冻食品，采样后应保持在冷冻状态（可放在冰内、冰箱内保存），非冷冻食品需在05下保存。样品采好后应贴上标签，写明品名、来源、数量、采样地点、采样人及采样时间。总之，定型包装及散装均采样250g,样品采好后送到微生物实验室检验，最好不要超过三小时。 微生物检验室接到送检申请单，应立即登记，填写实验序号，并按检验要求，立即将样品放在冰箱中，积极准备条件进行检验。 各食品卫生微生物检验室必须备有专用冰箱存放样品。一般阳性样品在报告发,第二节 样品的微生物检验,出后3天（特殊情况可适当延长）方能处理样品。进口食品的阳性样品，需保存6个月后方能处理，以便复验和再次证
5、明。阴性样品可及时处理。 检验完后，检验人员应及时填写报告单，签名后，送主管人员核实签字，加盖单位印章，以示生效,第三章 菌落总数的测定,定义：食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、PH、需氧性质等），所得1mL(g)检样中所含菌落的总数。本方法规定培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧的菌落总数。 菌落总数主要是作为食品被污染程度的标志。,冰箱： 04 恒温培养箱：361 恒温水浴锅：461 均质器或灭菌乳钵 药物架盘天平：0 500g，精确至0.5g 放大镜 4 灭菌吸管：1mL、10mL 灭菌锥形瓶：500mL 灭菌培
6、养皿：直径90mm 灭菌试管、玻璃珠、刀、剪子、镊子等,第一节 设备和材料,检样稀释及培养,第二节 检验程序,以无菌操作将检样25g（mL）剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分震荡或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000r/min10000r/min速度处理1 2min，做成1:10的均匀稀释液。,用1.0mL灭菌吸管吸取上述1:10稀释液1.0mL，沿管壁徐徐注入含有9.0mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。另
7、取1.0mL灭菌吸管，按以上操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1.0mL灭菌吸管。,根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1.0mL稀释液于灭菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。 稀释液移入培养皿后应及时将凉至46营养琼脂培养基（可放置与461 水浴保温）注入培养皿约15mL，并转动培养皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾倒入加有1.0mL灭菌生理盐水或其他稀,释液的灭菌培养皿内作空白对照。 待琼脂凝固后，翻转平板，置361培养箱内培养48h2h。水产品301培养箱内培养72h3h。 如果
8、样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按上述培养。,361 482h,菌落计数的方法,做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示。,菌落计数,选取菌落数在30 300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板
9、作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布有很均匀，即可计算半个平板后乘以2代表一个平板。 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。,菌落总数的计算方法1.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜的技术范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数的结果。（见下表例）,2.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜技术范围内，按如下公式计算。（见下表例）N=C/(n10.1n2)d 式中：N样品中菌落数；C平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n1第一个适宜稀释度的平板数；n2第二个适宜稀释度的平板
10、数；d稀释因子（第一稀释度）。,示例：,N=C/(n10.1n2)d=(232+244+33+35)/(2+0.12) 10-2=544/0.022=24727 最后数据经“四舍五入”后表示。,3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。（见下表例）,4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。（见下表例）,5.若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。（见下表例）,6.若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中
11、一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。（见下表例）,菌落数的报告,菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采取两位有效数字报告。 大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 称重取样以CFU/g为单位，液体体积为CFU/mL。,培养基及试剂的制备,平板计数琼脂（PCA）培养基 胰蛋白胨5.0g；酵母浸膏2.5g； 葡萄糖1.0g；
12、琼脂15.0g； 蒸馏水 1000mL PH7.00.2 制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节PH。分装试管或锥形瓶，121高压灭菌15min。,磷酸盐缓冲液：按GB/T4789.282003中3.22规定。 生理盐水 氯化钠 8.5g；蒸馏水 1000mL 制法：氯化钠溶解后，分装，高压灭菌。 75%乙醇,第四章 霉菌和酵母菌的计数,霉菌和酵母菌广泛分布于自然界，也可作为食品中正常菌相的一部分。但在某些情况下，各类食品由于遭受霉菌和酵母菌的污染，常常发生霉变，使食品失去色、香、味；有些霉菌的有毒代谢产物引起各种急性和慢性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致癌性。因此霉菌和酵母菌也可作
13、为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母菌计数来判定食品被污染的程度。,第一节 检验方法,霉菌和酵母菌计数,检样稀释度及培养 以无菌操作将检验25g(mL)剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分震荡或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置于均质器中以8000r/min10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。,用1.0mL灭菌吸管吸取上述1:10稀释液1.0mL，沿管壁徐徐注入含有9.0mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做
14、成1:100的稀释液。另取1.0mL灭菌吸管，按以上操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1.0mL灭菌吸管。,根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择3个合适的稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，吸取1.0mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度作两个平皿。 稀释液移入平皿后，应立即将凉至45左右的培养基约15mL注入平皿中，并转动平皿使混合均匀。待琼脂凝固后，翻转平板，置2528培养箱中，3天后开始观察，并观察培养5天。,菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 霉菌和酵母
15、菌计数报告 选取菌落数在10150之间的平板作为霉菌和酵母菌计数的标准。同稀释度的2各平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克或每毫升检样中所含霉菌和酵母菌数，以cfu/g(mL)表示。,实验分析及结果判定,样品处理和稀释 严格按照标准样品处理和稀释的方法进行操作。 培养基的选择马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA） 培养基上生长良好。用PDA做平板计数时，必须加入抗菌素以抑制细菌。,孟加拉红培养基 该培养基的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌的计数。高盐察氏培养基 粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效
16、果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛菌科菌种的作用。,倾注平板 每个样品应做3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平板。培养基熔化后冷却至45，立即倾注并转动混匀。培养基凝固后，把平皿反过来放培养箱培养，培养温度为2528。培养3天后开始观察菌落生长情况，共培养5天观察记录结果。,第二节 检验程序,检样粮食 块状食品 粉状食品 液状食品 糊状食品 称取25g，加225mL无菌水 吸取25mL，加225mL无菌水做成几个适当倍数的稀释液 选择3个适宜稀释度，各以1mL的量加入灭菌平皿内 每皿内加入适量培养液2528 5天菌落计数报告,营养基的制备,马铃薯-葡萄糖-琼脂 马铃薯 300g；氯霉
17、素 0.1g；葡萄糖 20g； 蒸馏水 1000mL；琼脂20g 制法：将马铃薯去皮切块，加1000mL蒸馏水，煮沸1020min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1000mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装，121高压灭菌20min。,孟加拉红琼脂 蛋白胨 5g；琼脂 20g；葡萄糖 5g；氯霉素 0.1g 0.3g/L孟加拉红溶液 100mL；磷酸二氢钾 10g； 七水硫酸镁 1g；蒸馏水 1000mL 制法：上述各成分加入水溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121高压灭菌20min。,高盐察氏培养基 硝酸钠 2g；氯化
18、钠 60g；磷酸二氢钾 1g； 蔗糖 30g；七水硫酸镁 0.5g；琼脂 20g； 氯化钾 0.5g；硫酸亚铁 0.01g； 蒸馏水 加至1000mL 制法：加热溶解、分装后， 115高压灭菌30min。必要时，可酌量增加琼脂。 用途：分离霉菌用。,第五章 大肠菌群的测定,大肠菌群是作为粪便污染指示菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来判断食品有否被粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了食品被粪便污染的程度，粪便内除一般正常的细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在，因而以此作为粪便污染指标，来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。,大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用
19、于食品卫生工作中，大肠菌群并非细菌学分类命名，而是细菌卫生领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。定义：在36条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的好氧和兼性厌氧的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。该菌群包括肠杆菌科的埃希氏菌属、柠檬酸细菌属肠杆菌属和克雷伯菌属。,第一节 检验方法,检验稀释,以无菌操作将检验25g(mL)剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分震荡或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置于均质器中以8000r/min10000r/min的速度处理12
20、min，做成1:10的均匀稀释液。 样品均液的pH值应在6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节。,用1.0mL灭菌吸管吸取上述1:10稀释液1.0mL，沿管壁徐徐注入含有9.0mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1:100的稀释液。另取1.0mL灭菌吸管，按以上操作方法，做10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即换用1支1.0mL灭菌吸管。 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择3个稀释度，每个稀释度接3管。从制备样品均液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。,初发酵试验,每个样品选择3
21、个适宜的连续稀释度的样品均液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤)，361培养242h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至482h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。,复发酵试验,用接种环从所有482h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中， 361培养482h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。,报告,根据证实为大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌
22、群的最可能数。 大肠菌群MPN检索表见教材165页。,第二节 检验程序,检 样选择三个适宜的稀释度接种LST肉汤管482h，361不产气 产 气 大肠菌群阴性 BGLB肉汤361； 482h报告 不产气 产气大肠菌群阴性 大肠菌群阳性报告 报告,在乳糖发酵试验中，经常可以看到在发酵倒管内有极细小的气泡。一般来说，产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但随样品种类而有不同，小于小米粒大小的气泡，亦有阳性检出（约为3050%）。另外，有时可以遇到在初发酵时产酸无气，但复发酵时却有气体产生。所以对产酸但为产气的如糖发酵管如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上升，即可考虑可能有气体产生，应做进一
23、步观察。,实验分析及结果判定,培养基的制备, 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 胰蛋白胨或胰酪胨20.0g；氯化钠5.0g 磷酸氢二钾2.75g；磷酸二氢钾2.75g 月桂基磺酸钠0.1g；蒸馏水1000mL pH6.80.2 制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，校正PH值，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，高压灭菌12115min。, 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 蛋白胨10g；乳糖 10g； 牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 200.0mL； 0.1%煌绿水溶液 13.3mL； 蒸馏水1000mL； pH 7.20.1 制法：将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉
24、溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，pH7.0-7.5）用蒸馏水稀释到975mL，调节pH至7.4，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL，121高压灭菌15min。,第六章 实验室生物安全基本知识,第一节 微生物实验室玻璃器皿的准备,微生物实验室常用玻璃器皿，主要包括试管、培养皿、三角瓶、吸管、载玻片、盖玻片等，都要经过洗涤清洁处理，至少无灰尘、油垢和无机盐等杂质后，才能保证获得正确的实验结果。有的器皿在清洁后，还要用一定方法包装，经过灭菌方能使用。,洗涤, 新玻璃器皿的洗涤 新的玻璃
25、器皿含有游离碱，应用2%盐酸溶液浸泡过夜，再用水洗干净；必要时先用水冲洗后浸泡于铬酸钾洗液中，再用水冲洗。, 使用过的玻璃器皿的洗涤 先将器皿中的琼脂刮去，如果培养基已经干涸，可放在肥皂水中煮沸，是琼脂溶化后趁热倒出，然后用清水洗涤，并用毛刷或海绵擦洗内壁，以除去粘在壁上的污垢。洗净的玻璃器皿其壁上不出现水珠或局部不沾水滴。,载玻片和盖玻片的洗涤 新载玻片和盖玻片先在2%的盐酸中浸1h，然后用自来水冲洗，必要时可在重铬酸钾洗涤液中浸泡几个小时或在稀重铬酸钾洗涤液中煮沸半小时，然后取出用水冲洗。用过的载玻片上如沾有油脂，先用皱纹纸擦去，然后放入5%的肥皂水中煮沸10min或在酒精碱溶液中浸泡30
26、min后再用自来水冲洗。洗后的载玻片再在稀的重铬酸钾洗液内浸2h，取出，用自来水冲洗到无色为止，最后用蒸馏水冲洗数次，烘干或浸于95%的酒精中备用。供细菌鞭毛染色用的载玻片，尤须保证洁净无伤痕。其洗涤方法是先用无渣粒的洗涤剂溶液煮沸，冷后用清水冲洗，再放入浓洗液中浸泡24h，取出后用清水冲洗，再用蒸馏水洗净，沥干，浸于95%的酒精中备用。,灭菌前的准备,为了防止空气中的杂菌对灭过菌的培养基或器皿再次污染，必须在盛有培养基的器皿口上塞上棉塞。培养用的器皿以及其他用具都应包扎后灭菌。, 制作棉塞 制作棉塞用的棉花，用市售的普通棉花即可，不宜用脱脂棉。因为脱脂棉容易吸收水而导致污染。棉塞应按器皿口径
27、大小制作，其长度就试管而言，一般长约45厘米。常用的制作方法有：取适量棉花铺成长方形，纵向松松卷起来再对折后塞入管口；或将棉花铺成方形，于其中央衬以小块棉花，用左手拇指为中心制成棉芯，再由外侧棉花包入做成棉塞。棉塞制成后，将其2/3塞入容器内，1/3露在容器外，要求松紧适当，紧贴管壁不留缝隙。以手提棉塞试管不滑落为度。, 包扎器皿 微生物分析用的培养皿和吸管等应事先包装后在灭菌。吸管应在管口约0.5厘米以下的地方塞入少许长约1.5厘米的棉花，以防止菌液吸入口中或口中细菌吹入管内。棉花的松紧程度以吹气时通气顺畅而不致下滑为准。然后，将吸管尖端放在45厘米宽的长条纸的一端约与纸成45度角，折叠纸条
28、，包住吸管尖端，然后将吸管卷入纸条内，末端剩余纸条折叠打结，待灭菌。培养皿可按8或10套为一叠用纸包装，或装在特制的铝制筒内灭菌。,灭菌 玻璃器皿经干热或温热灭菌后备用。,第一节 微生物培养基的制备,微生物培养基的制备程序,称取营养成分加热溶化调整PH值煮沸无菌检验灭菌分装过滤,配制,根据所培养的微生物对营养元素的要求选择适当的配方。,确定所需培养基的用量后，按配方称取药品和其它原料（一般用1/100感量的天平即可），逐一加入水中加热溶解。,最好先加无机药品，后加有机药品。难溶解的物质可先分别溶解后再加入。,易受高温破坏的药品应单独配制，采用过滤灭菌，临用前加入培养基中。,若制备固体或半固体培
29、养基，则需加入琼脂（固体培养基加1.82.0%的琼脂，半固体培养基加0.81.0%的琼脂），加热至琼脂融化，并补足蒸发失去的水分。琼脂加入后宜开锅搅拌，以防糊防溢。,调整PH值,各种培养基因成分不同，配制以后其酸度不一样。 由于不同种类的微生物对培养基酸度的要求不同，因此，在配置培养基时应根据欲培养的微生物对酸度的要求待配方中各成分全部溶解后，测试并调整培养基的PH值。,常用的方法如下： 试纸法 用PH试纸检测。用0.1NNaOH或乳酸调节培养基的酸碱度。 酸度计法 用酸或碱调节培养基酸度后，用酸度计侧其PH值 对要求保持在中性以上的培养基，可加入CaCO3或其它缓冲物质，不必再测试培养基中的
30、PH值。,对酸性培养基（PH5），灭菌前不可加入酸调节，须在灭菌后临用时加入或先将酸加入培养皿中，然后注入融化的培养基，以免在高温和酸性条件下琼脂水解而导致琼脂软化或完全失去凝固力。,过滤,液体培养基用滤纸过滤，固体及半固体培养基用纱布夹药棉过滤，以制备清亮的培养基。,分装,通过漏斗或虹吸管分装于三角瓶、试管或其它容器中。分装时严防培养基粘附在瓶口或管口，以避免培养基贮存或使用时的污染。,灭菌,用高压蒸汽灭菌器灭菌。,制作琼脂斜面,欲制作琼脂斜面，则在培养基灭菌后，趁热将试管成30斜置于木棒上，而斜面总长度以不超过试管长度的1/3为宜，凝固后保存备用。,第三节 消毒与灭菌,干热灭菌,火焰灭菌
31、主要用于实验室接种针、接种环、试管口和玻璃棒等的灭菌。 干热灭菌 用干热空气灭菌的方法。常用的设备室电热干燥箱。其法是先将洗净并晾干的玻璃器皿用包装纸包装好，置于干燥箱中（注意需灭菌的物品不要靠箱壁附近，不要过挤）。打开电源,开关，调节升温旋钮，使其缓慢升温至6070时，开动鼓风开关，鼓风510min，以促使器皿上及干燥箱空间的水汽排除。继续转动升温旋钮，使温度升至160170，维持2h。控制温度的方法室当箱内温度升至160 时，应将温度调节旋钮缓慢的反方现转动，当干燥箱上的指示灯红灯熄灭，绿灯亮时，在缓慢的来回转动温度调节旋钮，使红灯刚亮，绿灯刚灭处为止。这样，可继续升温约510，即可将温度
32、控制在165170。红灯是加热升温的信号，绿灯时切断加热电源的信号。灭菌时间到了以后，将温度调节旋钮按反时针方向转动至“0”点。关闭电源开关，待其冷却至50以下，方可取出灭菌器皿。绝对不可在高温时打开箱门。另外，干热灭菌时。定要专人看管，切勿同时干其他事情，以免发生事故。,湿热灭菌法,煮沸消毒 此法是将液体材料加热煮沸至近100，维持1020min。可以杀死所有细菌的繁殖体，但不能杀死全部芽孢。此法多应用于实验室小件器械的临时消毒，也可用于少量试验用果汁、饮料的消毒。但不适用于生产使用。饮料生产中的化糖过程，实际上起了对糖液的消毒灭菌作用。,流通蒸汽灭菌 此法室利用流通蒸汽灭菌器或蒸笼进行的一
33、种灭菌方法。要求每天蒸煮一次，每次30min，连续三天，所以又称为间隙灭菌。因此蒸煮一次30min，只能杀死微生物的繁殖体、真菌的孢子和细菌的部分芽孢，而不能杀死所有的芽孢。当把第一次蒸煮后的物品放置室温下时，物品上残存的芽孢即可萌发，变成繁殖体，繁殖体对热力的抵抗力远远弱于芽孢的抵抗力。因此，当第二次蒸煮时，又可杀死芽孢形成的繁殖体。这样进行三次，即可达到完全灭菌的目的。此法主要是用于实验室一些不耐高热的培养基及其它液体材料，也适用于水果罐头的灭菌。在用此法做水果罐头灭菌时，其加热方式可改为水浴，并可根据实际情况改用不同的温度和不同的时间。但必须连续两次以上。,巴氏消毒 此法主要用于葡萄酒、
34、啤酒及牛奶的消毒。其特点室可以杀死食品中常见的病原菌及其它微生物的繁殖体，而又不损失食品中的营养物质。如消毒牛奶常用6163加热30min，或7072 加热15min，然后迅速冷却。 近年来巴氏消毒法也有所改进，如超高温瞬时杀菌装置处理鲜牛乳的超高温巴氏消毒法。利用此装置使鲜牛奶成薄层状态，通过热交换式的金属板或管道而使其温度迅速上升而不低于132 经12秒钟，迅速冷却，既能达到消毒目的。使鲜牛乳在常温下的保存期延长达半年；而鲜乳的成分（尤其是维生素A与C）破坏较少。,加压蒸汽灭菌法 在一个大气压下，蒸汽的温度只能达到100，当加压时，随压力的增高温度也上升到100以上，根据这一原理设计了高压
35、灭菌罐。这是一个密闭的耐高压高温的金属容器，具有严密的盖，容器内的蒸汽不能漏出。由于连续加热，蒸汽不断增加，因而灭菌器内的压力逐渐增大，同时也使容器内的温度随压力而升高。 使用高压灭菌器进行灭菌时，当压力上升到2或3磅/英寸2时，须缓缓打开气门，排除器内的冷空气，然后再关上气门，使器内的压力再度升高。按规定要求进行灭菌。若冷空气排不干,净时，则压力虽达规定数字，而其内温度却实际不足，会影响灭菌的效果。 各种培养基、溶液、玻璃器皿、金属器械、工作服等均可用高压灭菌器灭菌。通常用15磅/英寸2的压力，在121.3温度下经1520min，即可杀死所有微生物及其芽孢，达到灭菌的目的。被灭菌物品的容量过
36、大时，可相应的延长灭菌时间。,第四节 无菌操作原则,防止病原微生物扩散,实验室中宜着工作衣帽，如沾有可传染的材料，应立即脱下浸于消毒液中过夜或高压灭菌处理后在进行洗涤。 严格无菌操作，接种针、接种环在使用前后都必须火焰灼烧。,实验室中应保持安静，不得高声喧哗，并应轻纺足步。 工作完毕后应先用消毒药水、再用清水洗手。,安全清洁,工作前，地面和桌面应保持清洁。 沾有病原微生物的器材，应置于指定地点。废弃物品应用5%苯酚浸泡。 微生物培养物绝对不能携带出实验室。实验室中应绝对禁食。 实验室结束后，应对实验室整理、清洁后离开。如有菌液污染桌面或其他地方时，可用5%石碳酸液覆盖其上半小时后擦去。,谢谢！ 祝各位愉快！,
