1、细胞与亚细胞结构的分离Separation of Cells & Organelles 生物学及医学研究一般涉及：整体、器官、组织、细胞、细胞器及分子水平。其中，细胞、细胞器及分子水平的研究，均需分离细胞或细胞器。一、从动物组织游离细胞( 一)步骤( 二)方法1、非酶法2、酶法二、细胞器的游离三、细胞与细胞器的分离( 一)沉降法纯化细胞或细胞器1、差速离心2、密度梯度沉降( 1)速度沉降( 2)等密度沉降平衡( 二)电泳法分离细胞( 三)亲和吸附法分离细胞( 四)根据细胞的生物学特性分离细胞( 五)流式细胞术分离细胞一、从动物组织游离细胞细胞的微环境cell-cell-extracellula
2、r matrix(ECM)细胞连接(如连接蛋白) 细胞粘附(ECM-R 介导)细胞粘合(CAM介导)媒介：二价阳离子(尤其是Ca 2+，如桥粒的中央层)；大分子(如糖蛋白和蛋白聚糖) 不同组织具有不同的细胞间质成分，不同组织中，参与细胞粘合与细胞连接的大分子成分也各不相同，所以，在游离细胞时，不同组织的细胞对不同试剂和不同方法具有不同的敏感性。-游离技术复杂，游离方法多样。 有时，同一种组织可用不同的方法游离出单个细胞，但所获得的细胞在表面性质、激素反应状态及物质和能量代谢上可能各有不同。-应根据实验目的选择游离方法。 游离方法成功-细胞活率与产量均高，并尽可能地保留细胞结构与功能的完整性。注
3、意游离条件：1、游离剂的种类2、游离剂的浓度与作用时间3、缓冲液的成分4、pH5、溶液的渗透压与盐成分6、酶终止剂对不同动物、不同组织或不同年龄的组织，有时游离方法不能通用。( 一)步骤1、用利剪剪碎组织或切成0.30.4mm的薄片，必要时匀浆。-组织块应尽量细小，保证细胞的供氧。2、用游离剂处理，破坏细胞之间及细胞与ECM之间的联系-在组织与游离剂保温前，保持低温以降低氧的消耗；选用适当直径的容器，以便液面的高度适宜，利于组织块的氧供给。( 二)游离细胞的方法1、非酶法-较温和( 1)螯合剂(chelating agent)-常用于游离 上皮组织细胞常用：EDTA-结合Ca 2+，Mg 2+
4、EGTA-结合Ca 2+的能力与EDTA 相似，但在中性或碱性条件 下结合Mg 2+的能力大大小于 EDTA。去除Ca 2+，Mg 2+-EDTA去Ca 2+留Mg 2+-EGTA 常与酶联合使用，如细胞系传代常使用0.02%EDTA+0.25%胰蛋白酶(1:1或2:1)。 EDTA对某些细胞有损害，如可损伤线粒体等。-尽量缩短细胞在无Ca 2+或有EDTA环境中的时间。( 2)甘氨酸(glycine)-可与EDTA联合应用。( 3)糖类(saccharide)-细胞表面的凝集素可识别并结合细胞粘合分子和细胞连接分子的糖链结构，这种作用能被相应的单糖、双糖或寡糖所抑制。（参见下页）( 4)升高
5、pH-改变细胞表面电荷如，胚胎组织，0.5%KOH溶液调至pH9.8，35分钟( 5)机械力游离- 玻璃匀浆器，注射器(6#针头)。注意轻缓，减少膜撕裂。（许多癌组织中癌细胞间细胞连接减少、减弱，容易脱落形成转移灶，可直接用机械力游离。）2、酶法-蛋白水解酶，辅助酶几种酶或酶与非酶试剂联合使用，效果较好。( 1)蛋白水解酶(proteolytic enzyme)粗胰酶(pancreatin)- 混合酶，含胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、RNA酶、脂酶、淀粉酶及磷酸酶。不同批号和来源的产品，其组成成分及各成分的活性变化很大-应根据需要选择不同来源的产品。防止支原体污染 -酸性条件下处理胰
6、酶10%胰酶，pH1，410 数分钟(杀死各种微生物 )过夜(杀死细菌的孢子)调回pH7，-20分装冻存备用。常用浓度 0.01%0.5%温度及时间 37 12分钟至12小时R.T. 时间稍长4 几小时甚至过夜0 慢作用，时间长常用于游离单层培养细胞，作用时间尽可能短，以减少对细胞的损伤。牛血清中含有其抑制剂，可终止反应。结晶胰蛋白酶(trypsin)-作用强烈，适于消化分散较软组织。由于其作用的特异性，限制了其水解能力。Ca2+、Mn 2+并非其活性所必需，但可稳定此酶。可牢固附着在细胞表面，需加牛血清抑制其反应。胶原酶(collagenase)-20多种，常与胰蛋白酶联合使用，适于消化坚硬
7、癌组织中结缔组织的纤维成分。胶原酶灌流肝脏为游离肝细胞的首选方法。最适pH中性。属于金属酶(可能含 Zn2+)，被Ca 2+活化，被 Mg2+抑制。牛血清不能使其灭活，其作用缓和，可用离心淘洗去除酶。商业上提供的胶原酶批号之间常有很大差异，购买时，先试几种不同来源的制品，选择效率高的，再按其批号一次足量购买。Trypsin Collagenase适于消化分散 较软组织 纤维多的组织用量 0.010.5% 0.10.3mg/ml(200u/ml) 消化时间 0.52hr(小块) 112hrPH 89 6.57.0作用强度 强烈 缓和对细胞的影响 时间过长 无大影响有影响血清能否抑制 能 不能Tr
8、ypsin与Collagenase在不同温度下消化小块组织所需时间(hr)A B酶 Trypsin(0.25%) Collagenase(200u/ml) A+B4 2428 1248 24R.T. 16 1224 637 12 412 0.54 1214 1224 12R.T. 12 612 337 0.51 112 0.25 37/R.T. ，Trypsin 长时间 (1hr)消化纤维性组织时，组织块表层细胞可随时从纤维网架中脱落下来，每隔2030分钟需用不锈钢网/ 铜网(2050m)滤过一次，离心收集这些细胞，以免细胞受过度消化而被破坏。 大多数细胞直径10100m 从4取出后滤过一次
9、向消化容器中补足新的Trypsin液离心（弃上清） 37热消化2030分钟已游离下来的细胞溶菌酶(lysozyme)-作用于细胞表面糖蛋白的某些糖苷键。游离小鼠肝细胞活率高（溶菌酶灌流、EDTA灌流）。弹性蛋白酶(elastase)- 最适pH10，pH89活性也较高，pH6失活。如分离鸡胚的心肌细胞。结晶弹性蛋白酶不易溶于水，只含5080%的活性酶。木瓜蛋白酶(papain)-是-SH酶，使用时应加入螯合剂，以防重金属与酶的 -SH结合。23小时内稳定，不必外加蛋白酶抑制剂终止其作用。链霉蛋白酶(pronase)-广谱，Ca 2+对其有保护作用，血清无终止作用。（1）pronase 游离原代
10、培养的人皮肤细胞比 trypsin效果好：皮肤细块无Ca 2+、Mg 2+的盐溶液洗涤0.025%pronase ，37保温（2） pronase游离体外培养的成纤维细胞比 trypsin效果好，后者更适合于游离上皮细胞。（3）用pronase 灌流肝脏，可得到活的Kuffer细 胞和内皮细胞，而肝细胞则被破坏。（4）pronase 也适于游离消化道粘膜细胞（单独 或与collagenase联合使用）（5）pronase 用于游离鸡胚的肌细胞。成纤维细胞在FN上增殖加快在LN 上 增殖减慢上皮细胞在FN上增殖减慢在LN 上 增殖加快原代培养的皮肤，若加大血清浓度(血清中含FN)，则上皮细胞生长
11、不良，而成纤维细胞大量增殖。组织中FN/LN对于维持间质细胞/实质细胞的平衡有一定的作用。FN过多，可在创伤愈合时形成斑痕。( 2)辅助酶(subsidiary enzyme)DNA酶-部分细胞受损，DNA-蛋白质释放出来形成凝胶，凝集细胞。需Mg 2+，可被Ca 2+、 Mg2+共同活化，使用时不能含有螯合剂。透明质酸酶(hyaluronidase)-对热稳 定， 并具广泛的最适pH。可单独使用游离 小肠粘膜细胞。 配制酶溶液-用BSS （平衡盐溶液）或培养液。终止蛋白酶作用的方法：(a)洗涤细胞，清除蛋白酶；(b)加入蛋白质竞争性地与酶结合，常用BSA等；(c)加入蛋白酶抑制剂- 广泛存在
12、于动、植物组织及血清中。* 选择合适的蛋白酶及恰当的与酶搭配的蛋白酶 抑制剂是获得高产率、高活率而减少细胞损伤 的重要环节。防止细胞聚合的方法：(a)从组织游离细胞时，注意离散完全，减少对细胞的损伤；(b)用一定孔径的尼龙纱或铜网过滤，或以一定速度通过某种毛细管；(c)在细胞悬液中加入一定浓度的 DNase或稳定剂。 稳定剂(protective agent)-也叫隔离剂，防止从组织游离下来的单个细胞发生聚合或粘附于瓶壁上，常用Methocel(一种甲基纤维素) 、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、明胶(gelatin)及BSA等。 成功地游离细胞-精心选择游离试剂，注意pH、温度、离子种类和强度、作
13、用时间及辅助试剂。方法的建立必须通过实验来摸索。 不同来源、不同批号的酶制剂可能有差异。二、细胞器的游离通过机械或化学的方法破坏细胞界膜和细胞内膜的连续性-制备组织或细胞匀浆。常用方法：1、Dounce玻璃匀浆器- 手动，适于培养细胞和软组织细胞制备匀浆。2、Potter-Elvehjem匀浆器-电动或手动，适于软组织(如肝)的匀浆。3、叶片刀匀浆器(blader)-电动，适于较坚硬组织(如肌肉、心脏等)的匀浆。4、超声波匀浆器5、用爆发的负压破碎细胞界膜-适于细菌匀浆。三、细胞与细胞器的分离细胞的分离：大小、密度-密度梯度沉降表面电荷-电泳表面特殊成分-亲和吸附细胞器的分离：差速离心密度梯度
14、沉降( 一)沉降法纯化细胞或细胞器1、差速离心(differential centrifugation) 在密度均一的介质中，分别在不同大小离心力场(从小到大) 的作用下沉降而分离。（连续多次离心）由于各种颗粒于离心沉降前在介质中均均匀分布，所以，某些慢沉降颗粒被快沉降颗粒裹到后者的沉淀块中，而使分离不够完全-可重复23次，进一步纯化。（将沉降物制成悬浮液，重新离心）由于连续离心会损伤细胞，所以，只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。细胞器在差速离心中的沉降顺序：核-线粒体-溶酶体与过氧化物酶体-内质网与高尔基体-核蛋白体由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，所以，差速离心分离得到的组
15、分常不只一种，尤其是质膜常与各种细胞器混杂沉降。差速离心可将细胞器初步分离，再进一步通过密度梯度沉降进行分离纯化。分离的细胞器还需经过鉴定。各种细胞器都有其标志物，如溶酶体的标志物为酸性磷酸酶。肝匀浆重力作用下自然下沉，20下沉物 上清(沉渣、整细胞、纤维) 1,000g x 20下沉物 上清(核) 10,000g x 20下沉物（还需进一步分离纯化） 上清(线粒体、溶酶体、过氧化物酶体) 100,500g x 120下沉物 上清(微粒体)0.26%脱氧胆酸钠 105,000g x 20下沉物 上清(上层为内质网，下层为核蛋白体)各种细胞器的主要标志物细胞器 标志酶细胞核 DNA聚合酶、RNA
16、聚合酶线粒体 琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、心脂酶内质网 葡萄糖6磷酸酶、细胞色素P450溶酶体 酸性磷酸酶过氧化物酶体 过氧化氢酶、尿酸氧化酶（类核体，人类及鸟类无）高尔基体 半乳糖基转移酶、唾液酸基转移酶质膜 腺苷酸环化酶2、密度梯度沉降(density sedimentation)用一定的介质在试管中形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部或底部，通过重力或离心力场的作用，使细胞分层分离。分为速度沉降和等密度沉降平衡。( 1)速度沉降(velocity sedimentation)细胞或细胞器在十分平缓的密度梯度介质中，按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。主要
17、用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。介质密度较低，最大密度小于被分离生物颗粒的最小密度。分离亚细胞结构，需加离心力场。在沉降最快的生物颗粒达到管底前停止沉降，并将各部分别收集。低温下进行，保护细胞及亚细胞结构的功能。分离纯化细胞的优点：(a)大多数细胞密度相差不多，而大小差别明显-分离效果较好；(b)介质密度低-不需高速；(c)时间短，外力轻-保持生物材料在结构与功能上的完整性；(d)可在无菌条件下进行全部操作- 分离的细胞可进行培养。( 2)等密度沉降平衡(isopycnic sedimentation)细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力、足够长时间，或沉降或飘浮到与自身密度
18、相等的介质处。适于分离密度不等的颗粒。介质密度较高，其最大密度应大于被分离组分的最大密度。介质梯度要求有较高的陡度，不能太平缓。高速或超速离心，时间也较长- 对细胞不利。 To obtain a good separation of lysosomes from mitochondria, the liver is perfused with a solution containing a small amount of detergent before the tissue is disrupted. The detergent is taken into the cells by endo
19、cytosis and transferred to the lysosomes, making them less dense than they would normally be, thereby affording a“ clean” separation from the mitochondria. 密度梯度沉降法分离细胞常用的介质必须符合的条件：能产生一定陡度的密度梯度，且密度高时粘度不高；pH中性或易调为中性；浓度不同时渗透压的变化不大（sucrose只能用于分离细胞器）；对细胞无毒。常用的有清蛋白、Ficoll（polysucrose，速度沉降或重力沉降）、Percoll等。
20、Ficoll广泛用于速度沉降分离细胞，对于分离不能耐受离心力的细胞特别有价值（重力沉降）。 Percoll为PVP硅胶，广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒；既适于少量细胞的分离，又适于区带大批量分离细胞；可分离死、活细胞，30%Percoll 一般可截住死细胞。UV有较强吸收，不宜用光谱法分析其中的样品。为防止细胞粘附于管壁，可使用聚碳酸酯试管。 密度梯度沉降法分离细胞的操作原则： 密度梯度介质的制备介质梯度可连续或不连续。连续梯度 梯度形成器离心不连续梯度的自然扩散不连续梯度等密度沉降时，应在管底铺置一定厚度的高密度介质作为垫，以防细胞沉底。用不连续用不连续梯度介质分离细胞时所得纯度和
21、分辨率一般不如连续梯度者好。2）装样样品的体积、浓度和装样方式因细胞种类和所用的分离方法而异。速度沉降样品装在梯度的顶部体积尽量小细胞浓度不可过高（否则细胞聚合）8mlPercoll梯度 ，样品1ml， 5010 6个细胞/ml对于大多数哺乳动物细胞悬液，3510 7个细胞/ml等密度沉降（漂浮）平衡（预先制成梯度介质）样品可装在梯度的顶上使之向下沉降，也可至于梯度的底下使之向上漂浮。离心制成介质梯度可将细胞与介质混悬。3）收集样品分带分离后，立即将管内内容物分部收集，并检测各部分中细胞或细胞器的种类和数量。样品的收集可从管底进行在离心管的穿一适当大小的孔，借天然的重力或蠕动泵时管内内容物缓缓
22、流出，分部收集。样品的收集可从管顶进行在离心管口加盖，并插入一细长管至离心管底，压入密度大于介质最高密度的液体将分离后的内容物从顶端的出口依次驱出，分部收集。( 二)电泳法分离细胞细胞表面带正负电荷，在一定pH环境下，细胞表面带净电荷，在外加电场中向一定方向泳动。具有不同表面电荷的细胞器也可通过电泳达到分离。( 三)亲和吸附法分离细胞亲和吸附是一种特异性吸附反应。吸附剂被共价交联到直径较大、珠粒范围较窄的琼脂糖凝胶上，当细胞混悬液通过柱内珠粒时，与吸附剂结合的细胞被留在凝胶床上，而不与吸附剂作用的细胞则穿过凝胶柱流出，然后，用适当的去吸附剂将被吸附的细胞洗脱下来。 根据吸附剂的类型和细胞与吸附
23、剂作用的性质，亲和吸附可分为三大类：1、抗原-抗体( 吸附剂)细胞表面存在多种抗原。无相应抗原的细胞-很快流过吸附柱(高活率，高回收率)有相应抗原的细胞-抗原与抗体结合力强，且难以得到足量的抗原用于洗脱(回收率不高) 适合从细胞悬液中去除某种细胞。如，从骨髓细胞中去除白血病细胞，使用白血病细胞特有的抗原的抗体作为吸附剂。2、糖蛋白-凝集素(吸附剂 )细胞表面存在着多种糖蛋白，其糖链结构因细胞种类、分化阶段及功能状态而异，因此，可用此法分离不同种类、不同分化阶段或不同功能状态的细胞。糖基与凝集素的结合可逆性大，此法可得到高活率、高产量的特定细胞，方便、重复性好。常用单糖、双糖或寡糖作为去吸附剂，
24、经济易得，对细胞无损伤。避免凝集素与细胞接触时间超过30分钟，否则用相关的糖不能使细胞与凝集素脱离，此外，也易发生非特异性结合或内吞，刺激有丝分裂或引起编程性死亡。特异识别 去吸附剂花生凝集素(PNA) D-Gal D-Gal大豆凝集素(SBA) GalNAc GalNAc蜗牛凝集素(HPA) GalNAc GalNAc麦胚凝集素(WGA) GlcNAc GlcNAc 生物化学与分子生物学实验常用数据手册吴冠芸、潘华珍主编，科学出版社，1999年第一版P220，“ 常用外源凝聚素的糖特异性”测定血中 PNA+淋巴细胞的百分率可作为白血病预后的指标：外周血中PNA +淋巴细胞百分率正常人 12%
25、急性淋巴性白血病、 20%半数髓性白血病慢性白血病、 少有增高急性白血病缓解期PNA还可用于分离牛的T淋巴细胞(PNA +)和B淋巴细胞(PNA -)。3、受体-配体( 吸附剂)常用过量的配体或竞争性抑制剂作为洗脱剂。如，可将激素、神经递质或其它配体结合于Sepharose 6MB上，用于分离具有相应受体的细胞。细胞混悬液 -银环蛇毒素-Shepharose 6MB 柱被结合的细胞（具有乙酰胆碱受体的神经细胞） 直接穿过的细胞竞争性抑制剂或机械处理无效Trypsin释放出的神经细胞（表面蛋白受损）短期培养神经细胞恢复表面成分，重新形成乙酰胆碱受体，恢复对电的刺激。* 神经细胞纯度10倍，非神经
26、元细胞5%（四）根据细胞的生物学特性分离细胞如巨噬细胞可粘着于铺有LN的、甚至裸露的玻璃或塑料表面，而其它血细胞则不能。腹水液铺有LN的培养瓶，保温一定时间巨噬细胞粘着（五）流式细胞术分离细胞用偶联了荧光染料的特异性抗体标记一定的细胞，并使细胞悬液以微滴细流的形式通过激光束，带荧光标记的细胞获得的电荷与不带荧光标记的细胞获得的电荷不同，然后通过强大电场将带电不同的细胞分别拣出到不同的容器中，从而达到高精度的分离。 思考题1、用螯合剂、胰蛋白酶及胶原酶分离细胞的原理分别是什么？DNA酶和透明质酸酶在细胞分离中的作用分别是什么？2、终止蛋白酶作用的方法有哪几种？3、防止细胞聚合的方法有哪些？4、差速离心和密度梯度沉降的原理分别是什么？5、比较速度沉降和等密度沉降平衡的异同点。6、密度梯度沉降法分离细胞常用的介质必须符合的条件有哪些？7、亲和吸附法分离细胞的原理是什么？可分为哪几类？同：属密度梯度沉降，在一定密度梯度的介质中分层分离组分。异 速度沉降 等密度沉降平衡1 密度梯度十分平缓 密度梯度有较高的陡度2 适于分离密度相近、 适于分离密度不等的组分，大小不等的细胞或 对细胞不利细胞器，常用于分离细胞3 重力或离心力场作用下 需足够大离心力场(分离亚细胞结构需加离心力场)4 介质密度较低 较高5 收集时，组分所处密度层与组分自身密度不一定相等 相等
