1、 上海交通大学博士学位论文克百威农药毒理及胶体金标记免疫测定技术研究姓名：周培申请学位级别：博士专业：环境科学与工程指导教师：陆贻通20040801上海交通大学博士学位论文摘 要克百威农药毒理及胶体金标记免疫测定技术研究摘要以氨基甲酸酯类农药克百威及其代谢产物为研究对象采用试验 小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验微核试验和单细胞凝胶电泳进通过对农药分子改造细胞杂交瘤技术和胶体金标记免疫分析等进行了克百威农行了克百威农药及其代谢产物毒理研究合成人工免疫抗原药残留快测定技术研究旨在通过研究系统观察克百威农药及其代谢产物的生物遗传毒效有望在农药毒理学研究尤其是将胶体金免疫标记应 并研究创立该农药残留快速
2、监控检测技术方面有所创新 在农药残留快速检测技术析测试技术应用于农药残留检测上有所突破经试验 小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验表明层研究结果如下其阳性对照组与克百威各剂量试验组畸变率比较有显著性差异阴性对照组与克百威各剂量试验组畸变率比较无显著性差异 而试验结果为阴性 因此可以得出结论小鼠骨髓瘤克百威农药没有明显的致突变作用微核试验和单细胞凝胶电泳 试验表明克百威本体及其最主要的代谢终产物呋喃酚对小鼠骨髓嗜多染红细胞的I上海交通大学博士学位论文摘 要微核效应与溶剂对照组比较无明显差异两种物质对 的损伤也均不显著 提示其对生物机体的遗传毒损伤作用不明显羟基呋喃丹对 细胞产生遗传损伤且随着染毒剂量的
3、增加同时显示其有明微核率和 损伤程度显的 损伤效应也随之上升体外但其致微核效应不明显接转化为毒性极小的酚类而致试验 酮基呋喃丹对细胞有严重的损伤作用酮基呋喃丹直是由于在体内代谢酶存在时在特定情况下形成的代谢产物亚硝基呋喃丹对小鼠骨髓微核的产生极为显著 试验 损伤也最为严重以呋喃酚为合成原料 在通光气的条件下 以冷法细胞热法合成苯和 产物经气质并用活性酯法与载体蛋并呋喃基氯甲酸酯 得率分别达获得了目标半抗原核磁共振和红外光谱表征白进行偶联制备获得人工免疫抗原采用杂交瘤技术 将合成的 免疫小鼠筛选取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞在 下进行融合 经效价检测和有限稀释法克隆化传代培养特异性单克隆抗体的杂交瘤
4、细胞株获得了一株制备的腹水效价达并经蛋白含量测定能稳定分泌 采用辛酸硫酸铵沉淀法型均属纯化单克隆抗体其免疫球蛋白类II上海交通大学博士学位论文摘 要用柠檬酸三钠还原法制备 羊抗鼠工艺参数选择性研究纳米金颗粒 并进行抗体标记 与并进行相关试制等相关试剂固化在硝酸纤维素膜上初步建立了胶体金快速免疫检测技术体系出克百威胶体金免疫层析快速检测试纸条该试纸条稳定性好 操作简单针对建立的胶体金标记免疫检测方法浓度克百威标准样品进行 的比较分析测了个添加克百威农药的蔬菜样品和测定的结果比较 胶体金标记免疫速测法的相对敏感性为其最小检出量为快速 结果灵敏直观将实验室添加的个不同另实与间接竞测定结果完全吻合个对
5、照蔬菜样品争相对特异性为本研究的创新点两者的符合率为采用 SCGE 体外短效 试验及其机制2根据理想免疫抗原应具备的分子结构条件征进行分子改造 以呋喃酚为合成原料术最终获得了克百威特异性免疫抗原技术 成功获得特异性的单克隆研究受试物的潜在慢性分子毒理效应结合克百威的结构特热法和活性酯法等以冷法 技经小鼠免疫并通过杂交瘤抗体 首次尝试将纳米胶体金标记免疫测定技术应用于农药残留检测并获得了成功 对于小分子农药实现胶体金免疫快速检测提供了一个富有参考价值的方法体系以本研究结果申报的两个发明专利获得了公开III上海交通大学博士学位论文摘 要论文在跟踪和了解国内外农药毒理及其残留检测技术的前沿动态的基础
6、上 从解决生态环境污染问题出发提出了毒理学研究和环境检测以环境问题的发现 毒理研究作为本研究论文的指导思想 并采用多学科交是两个不可分割的整体的观点和解决问题的手段 环境监控叉 取得了一些有创意的成果对充实发展农药环境毒理学研究以及进一步科学用价值合理地研制新农药及保障农产品安全有较深的科学意义及实关键词 克百威 毒理 单细胞凝胶电泳人工免疫抗原单克隆抗体胶体金标记免疫测定IVSTUDY ON THE TOXICOLOGY AND DETECTIONTECHNIQUE OF COLLOIDAL GOLDL-BASEDIMMUNOASSAY FOR N-METHYLCARBAMATEPESTIC
7、IDE CARBOFURANABSTRACTIn this paper, the toxicology and detection technique of colloidalgold-based immunoassay were carried out for n-methylcarbamatepesticide-carbofuran by the Ames test, chromosome aberration test,micronucleus test, single cell gel electrophoresis assay, artificialsynthesization of
8、 immunity antigen,hybridoma technique and colloidalgold-based immunoassay .The aim of this study was to observe the bio-gene toxicology effectsof carbofuran and its main metabolites and develop a rapid, simple andqualitative detection method which was based on the principle of thehighly specificity
9、of immunochemical reactions between antigens andantibodies. The results are showed as follows:The experiment results of Ames test and chromosome aberration testshowed that the carbofuran has not potential mutagenesis compared withthe negative control.The micronucleus test and SCGE was carried out fo
10、r carbofuran andits final metablites carbofuran phenol. The micronucleus frequency ofanimals treated with carbofuran and carbofuran phenol were notsignificantly different with negative control by the MN test and there wasno difference between carbofuran, carbofuran phenol treated groups withnegative
11、 control. It is clear that two compounds were not consided astoxic.In the MN test, the 3-hydroxycarbofuran was significantly differentcompared to negative control, and that the SCGE result showed that the3-hydroxycarbofuran has obvious DNA damnification. The rate of PCEmicronucleus and DNA damnifica
12、tion increased with the inject dose. Inthe SCGE, the 3-ketocarbofuran has serious DNA damnification whilethe micronucleus effect is not significantly. The nitrosocarbofuran areconsidered as having mutation to chromosome and potential mutagenesis.The carbofuran phenol, raw material was used to synthe
13、size theBNFH by the cool and heat way both under phosgene is ingress. The rateOF product were 90.5% and 88.1%,respectively. After structurevalidation by use of GS-MS, nucleoprotein,infrared spectrum, theproduction was united with BSA in order to obtain the artificialimmune-antigen.Immunization test
14、of BALB/C mice with the conjugates(BNFH-BSA)was carried out by intraperitoneal route. Spleen cells of immune micewere fused with SP2/0 murine meloma cells by PEG4000, and after HATscreening, ELISA for teters and cloning, a hybridoma cell line(5E2)secreting anti-BFNH McAbs was obtained. The hybridoma
15、 was preparedascites of the mice, and the titers of the McAbs in the ascites ranged from10-610-7.Nano colloidal gold particles were prepared and labeled toanti-carbofuran Mab (monoclonal antibody). This conjugate wasdispensed on the conjugated pad of a porous glass fiber. Ovalbumin(OVA)-carbofuran a
16、nd goat anti-mouse IgG were dispensed on thenitrocellulose (NC) membrane and served as the test line and control line,respectively. The carbofuran-containing sample migrated to the NCmembrane and reacted with anti-carbofuran Mab labeled with thecolloidal gold. The mixture diffused along the membrane
17、 and passedthrough the OVA-carbofuran in the test line via capillary action. Themore analyte present in the sample, the more effectively it will competewith the carbofuran immobilized on the test line for binding to the limitedamount of antibody labeled with colloidal gold. An adequate amount ofcarb
18、ofuran could prevent attachment of the colored conjugate to the testline. The presence or absence of color band on the test line could indicatea negative or positive result, respectively. While the water samples spikedwith carbofuran were measured , the limit line of detection was at orabove 0.25mg/
19、L for carbofuran. The major advantages of the one stepstrip test are that the detection time needed is less than 10 minutes and allthe reagents are included in the test device.The rate of agreement was94.55% after this method was compared with ELISA.The specific studies done in this paper may be gen
20、eralized as follows:1. The SCGE test was used to research the carbofuran gene toxicbased on the molecular toxicology.2. On base of condition of perfect molecular structure of immuneantigen, the BNFH-BSA was synthesized by the cool and heat wayboth under phosgene is ingress. The special McAbs to BNFH
21、 wasobtained by hybridoma technique.3. It seems to be the first time that nono colloidal gold-basedimmunoassay was applied into the determination of pesticideresidue for the first time. It is a method system with reference valuefor detection to small molecular pesticice. Two invention patentwere ope
22、ned.This paper was carried run after the trends of pesticide toxicologyand determination technique for pesticide residue. There were twoimportant aspects as the guidance of the whole research work, the one isthe discover of environment problem, the another is the resolve ofenvironment problem. Some
23、originality results have been obtained byintercross of several subjects.Key words carbofuran, toxicology, Ames test, chromosomeaberration test, micronucleus test, single cell gel electrophoresis assay,monoclonal antibody, colloidal gold-based immunoassay上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明进行研究工作所取得的成果包含任何其他个人或集体已经
24、发表或撰写过所呈交的学位论文除文中已经注明引用的内容外的作品成果均已在文中以明确方式标明是本人在导师的指导下独立本论文不对本文的研究本人完全意做出重要贡献的个人和集体识到本声明的法律结果由本人承担学位论文作者签名日期 年 月 日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版论文被查阅和借阅 本人授权上海交通大学可以将本学位论可以采用影印使用学位论文的规定同允许文的全部或缩印或扫描等复制部分内容编入有关数据库进行检索手段保存和汇编本学位论文保密 在 年解密后适用本授权书 本学位论文属于不保密 请在以上方框内打学位论文作
25、者签名指导教师签名日期 年 月 日日期 年 月 日上海交通大学博士学位论文术语和略语表术语和略语表缩略语英文全称 中文全称单细胞凝胶电泳 克百威牛血清白蛋白卵清蛋白卵清蛋白与克百威交联物牛血清白蛋白与克百威交联物单克隆抗体酶联免疫吸附试验胸腺嘧啶核苷十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳聚乙二醇 免疫球蛋白 磷酸盐缓冲液吐温的磷酸盐胎牛血清 含 羟乙基哌嗪磺酸 三羟基甲基氨基甲烷紫外光谱上海交通大学博士学位论文术语和略语表每分钟转数小鼠骨髓嗜多染红细胞慧星试验上海交通大学博士学位论文第一章 文献综述第一章文献综述现代毒理学毒理学 是研究外源物对生物体毒作用性质和机理以及对机体发生它已从单纯研究毒物的
26、学科毒作用的严重程度和频率进行定量评价的科学展成为一门现代的综合性的学科早期人类接触的外源性毒物飞速发主要是动物和植物中的天然毒素其后是一些化学从而使毒理学研药物 世纪年代以来大量人工合成化学物进入人类生存环境究范围不断扩大随着现代医学物理学 生物学及合成化学等学科的迅猛发展及相互交叉 从而在毒理学基础上形成了一个综合性边缘性和应用性很强的新兴学科现代毒理学现代毒理学已从传统的研究外源物对生物体的有害影响来研究和发展分子生物及当代生命科学多个领域发展到用毒物作为工具且从不仅参与自然毒素的鉴定和药品开发进而发展到识别评价和控制环境索这些毒物对人类健康和环境的危害食品 化妆品 饲料等外源性毒物医学
27、 卫生学以及探环境科现代毒理学与药理学学和生态学交叉渗透等分支学科衍生形成了药物毒理学工业毒理学环境毒理学和生态毒理学现代毒理学的发展呈现以下特点第一 研究内容不断向纵深方向深入 寂静的春天 的出版年以来 反映停 事件的发生和 使毒理学发生了一个新的飞跃发育毒毒理学研理学 环境毒理学 分析毒理学和遗传毒理学等都以前所未有的速度发展衍生了细胞毒理学和分子毒理学等分支究已深入至细胞和分子水平1上海交通大学博士学位论文第一章 文献综述第二 现代毒理学研究在宏观管理和立法方面的作用日趋突出危险度评定开始不仅开始直接成为现代毒理学研究的一个主要内容美国食品和药品管理局参与和进行毒理学研究而且开始在公共卫
28、生政策和法令的制定过程中用实验毒理学年 美国环境保护总局 提出了生态危险度资料作为其立法的科学依据评定的框架第三并于年作为指导原则毒理学研究引起了各国的高度重视试行 正式颁布 在此领域的学术队伍不断壮大相互间的学术交流不断发展人类已经充分认识到在人口膨胀 资源短缺和生态环境恶化现代毒理学研究在可持续发展中起着一个重要角色和作的沉重压力和严峻挑战面前用 环境毒理学与分子毒理学研究进展环境毒理学与分子毒理学环境毒理学是研究环境污染物特别是化学污染物对生物机体的损害作用及其作研究的化学物质主要是人类在生产和生活过程中 可能接触的外源化日用化学品 各种环境污以往毒理学研究主要以整体动物试验和人体观察相
29、结合用机理的科学合物包括农用化学品工业化学品 药物 食物添加剂染物及霉菌毒素等在相当一段时期内这仍然是重要和必要的手段随着分子生物学的理论和方法应用于毒理逐渐使外源性化学物的毒性评价方法发展到体外细胞 分子水平的毒性测某些复杂的整体试验将逐步为体外试验或构效学的研究试与人体志愿者试验相结合的新模式关系数学模式所代替目前用于环境污染物的毒性试验系统将被基因工程的动物和细原需要数月给药和评价胞所代替 传统的发病率和死亡率终点将被生化指标所替代的毒性研究将在几小时内完成美国国家环境卫生科学研究所这为污染物的毒理机制研究创造了深入研究的条件于年启动环境基因组计划 它标志着人们将在更高层次上对环境和基因
30、相互作用以及对人类健康的影响进行系统全面的研究毒理学研究真正实现了从整体和器官水平向细胞和分子水平的飞跃 2上海交通大学博士学位论文第一章 文献综述分子毒理学是从分子水平上研究外源化合物与生物机体相互作用的一门学科一方面 它要探讨众多的外源化合物对生物机体组织的各种分子特别是生物大分子另一方面的作用机制 从而阐明外源化合物的分子结构与其毒效应之间的相互关系则要从分子水平上表述生物体对外源化合物的效应通常是指核酸所谓 生物大分子其结构和功能集中表现在遗和蛋白质传基因上 一方面涉及有关基因本身的运动规律复制 转录 遗传密码的受体和多种翻译和基因的表达另一方面则涉及到基因表达的多种产物包括酶生物因子
31、能的负面影响的结构与功能分子毒理学正是要研究外源化合物对生物大分子结构和功从而从本质上阐明毒性的机制环境污染物的分子毒理机制研究现状年月 美国著名的科学专栏评论家 在 杂志发表了同年我国也成立了测序及毒理学进入分子水平的专论中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会基因重组 核酸杂交一系列突变检测手段也已被我国毒理学工作者广泛地应用到外源化合物和环境致癌物引起的 损害 基因突变 加合物形成 基因多态 癌基因和抑癌基因等检测中目前环境污染物的分子毒理机制研究主要集中于以下几个方面 毒物代谢酶研究对于毒物代谢酶的研究在我国起步较晚年的第届学术交流会上国内毒理学界已开始了体内代谢外源物质有关酶的基因多态性
32、研究国家自然科学基金委毒物与基因多态性研究 的多项课题相应的变异等位基因接连员会和卫生部科学研究基金也分别资助了有关现在一系列重要的人类外源化学物代谢酶基因相继被克隆被发现并推测其与表型上代谢多态性及可能的环境风险程度相关联近年来研究最多的是细胞色素参与广泛的内源和外源化合物的合成与代谢癌物的代谢活化以及其基因多态性与癌的关系等问题备受关注酶系 其对药物的疗效 对化学致研究较多的有3上海交通大学博士学位论文第一章 文献综述和 亚型 一般认为细胞色素酶系与人类癌症的关系十分密切大多数化学致癌物均需经代谢活化才能成为终致癌物发挥致癌作用如多环芳烃 黄曲霉素 芳胺 亚硝胺等 有研究表明某些 亚型与肺
33、癌敏感性相关在小鼠实验中也得到证实人外周血淋巴细胞内 水平与人群肺癌发病率呈正相关 环境毒物对损伤和修复的作用化学物的遗传毒性效应是以些因素作用下 的结构和功能发生改变的损伤的立体构象发生明显变化作为靶分子造成的损伤 损伤是指在某阻碍 的复制与转录多种环境因素可引起如紫外线和电离辐射可使两个相邻的嘧啶相互交联形成嘧啶二聚体从而使 阻断受损部位的复制和转录 许多外源或内源化学物和物理因素能诱导活性氧生成主要包括链断裂与碱基修饰两大类活性氧可对例如可迅速与产生许多不同类型的损害核酸反应形成许多不同类型的碱基修饰产物见且数量最多已经发现某些致癌物所引起的其中以羟基鸟嘌呤形成与肿瘤发生相关最常另一方自
34、由面攻击 分子中核糖也造成链断裂其位点可能在核糖的和上 基攻击胸腺嘧啶碱基造成的损害经修复酶切除也产生类似的单链断裂镍化合物可在细胞周期中持续时间往往不能被复制酶识别 从而造多数研究者认为砷对细胞修复有关的 连接酶和引起较长蛋白质 氨基酸交联 这是一种较难修复的损害在 复制过程中 这段与蛋白质交联的成某些重要基因如肿瘤抑制基因的丧失损伤的修复功能有抑制作用乃至引起肿瘤且认为是通过抑制与连接酶达到的而也有认为是通过砷诱导现亚砷酸钠对 和甲基甲烷磺酸酯诱发的加合物是亲电性化合物及其代谢产物和生物体内的化学损伤的最普遍形式蛋白质交联完成的最近研究也发细胞 链断裂的再修复有抑制作用形成的共价结合产发生
35、共价结物合合是 有些化合物可以直接在生物体内而更多的则需要代谢活化后与作用目前认为外源化合物与发生共价结可导致某些化学诱变的特异性位点的基因突变而 的错误配对可以诱发 突变与致癌作用 许多的环境毒物参与形成加合物 外源性的如多环芳烃 芳胺 亚4上海交通大学博士学位论文第一章 文献综述硝胺芳烃霉菌毒素加合物农药等 其形成的加合物具有多种形态链间和链内交联等如烷化 加合物 多环环化加合物 加合物的形成及持久性取决于生物体暴露于化学物的浓度及时间化学物的吸收 代谢以及生物体对 损伤的修复能力生物体对加合物是生物体暴露于反映了化合物与致癌物的有效剂量及致癌物在体内产生的有效作用的综合表现的作用与致癌物
36、作用直接相关 因此可以用来评价和预测化学物的潜在致癌性外对鱼的 加合物研究较多 结果表明水生生物尤其是鱼由于对致癌物敏感可以直接指示水环境中存在的致癌物 是一种理想的用来进行致癌物检测和筛选的模国而且式系统 生物体都具有强大的修复机制 在正常生理条件下绝大多数的损伤在外源化合物造成的复制前就被修复以保证基因组的完整和遗传性状的稳定性不能正确修复损伤的损伤 能及时正确修复的不会造成基因突变一旦进入半保修复能力有缺陷时留复制过程 极易发生碱基配对错误很多的环境物质攻击修复而发生基因突变断裂的酶细胞尤甚 然而 从而降低其修复能力减少修复保真度 使基因突变增多环境毒物对细胞信息传递过程的影响细胞内信息
37、传递系统的基本结构主要由特异性的膜受体 二酰基甘油蛋白 一系列第二信使如 及蛋白激酶等组成近年来两种气如甾体激素类态第二信使和的传递系统也基本明了可直接进入细胞内而与细胞内受体结合此外某些细胞外信息然后进入细胞核改变基因的表达各种环境毒物可在细胞信息传递途径的各个环节起作用如二恶英可结合到 受体使其活化与转录因子表达出现改变受体转运蛋白 形成异二聚体使某些蛋白 如其中有些蛋白与毒物的活性有关近年来引起人们普遍关注的所谓 环境激素 如多氯联苯 等可通过模拟内源性激素而与这些激素的受体结合造成内分泌失调农药和引起氧化应激的毒物影响机体的生长发育和生殖机能甚至诱发肿瘤 许多重金可通过与 等第二信使作
38、用而影响细属 5上海交通大学博士学位论文第一章 文献综述胞信息传递 许多环境毒物可以诱发癌症的发生其本身就是细胞信号传递过膜结合蛋白 胞浆蛋白丝氨酸而对癌症的发生过程的研究表明程中的组成部分 如各种受体苏氨酸激酶等 环境毒物影响许多的原癌基因 非受体蛋白酪氨酸激酶这些基因的表达从而使细胞的信号传递过程发生紊乱产生癌症 环境毒物对免疫功能的影响有些微量元素化合物可作用于机体的免疫系统影响免疫功能如果引起的免疫反应强度属于正常范围机能障碍反应又称变态反应一般情况下机体能恢复内在平衡不引起明显的组织损伤和造成异常的免疫反应 称超敏有的可直接作用于免如果免疫反应强度和后果超过正常生理范畴有的可引起机体
39、体液或细胞免疫反应降低疫系统的细胞引起细胞毒性有免疫毒性 砷化合物在较高浓度下能抑制人血淋巴细胞的有丝分裂能引起细胞毒性变态反应 还可引起肾细胞及其蛋白质的改变造成过敏性肾病综合征导致皮肤病发生 对镉的免疫毒性机制研究有较多报道许多环境因素如紫外线 矽 砷 镉的化合物都具甚至引起细胞引起免疫复合死亡物型或血管炎型变态反应无机的和有机的砷化合物还可引起迟发型变态反应不论是体外或体内实验均观察到镉高剂量组的巨噬细胞吞噬功能抑制加入消炎痛后得到恢复 增加现象也可因加入消炎 痛而受并发现体外实验镉低剂量引起吞噬细胞分泌到抑制 环境因素联合作用对免疫系统影响的机制研究亦开始涉及我国毒理研究已注意物理因素
40、与化学因素和化明显升高的到多因素的联合作用学因素之间的联合作用协同作用可能是研究范围包括物理因素与物理因素如提出与氯化镉联合作用引起淋巴细胞激素效应 的结果 硒对氯化汞免疫毒性的拮抗作用 可能与其对联合作用的研究不单纯是研究环境因自由基的直接清除作用和提高抗氧化活性有关素之间的相互作用还应研究一些因素对免疫抑制效应的防护作用化学致癌机制近年来肿瘤基础研究的最重要进制的阐明 在化学致癌机制上展是癌基因和抑癌基因的发现及其作用机统一了基因学派的体细胞突变学说和基因外学派的基6上海交通大学博士学位论文第一章 文献综述因表达与调控学说最近对化学致癌的新认识主要有细胞凋亡相关基因和肿瘤易感基因化学致癌是
41、多基因共同参与的过程多种癌基因 抑癌基因 抑癌基因的作用是通过整合细胞对各种危急状况的反应亡几个不同途径而维持基因组的稳定性控制细胞周期关卡和启动细胞凋起抑制肿瘤的作用 多重肿瘤抑制基因基因的发现 确定端粒酶激活与肿瘤发生的关系甲基化 脱甲基化对癌基因抑癌基因转录活化的影响分子生物学技术在毒理学研究中的应用毒理芯片技术毒理芯片技术是建立在基因技术和学技术 微阵列技术应用于确定未知外源化合物的毒理效应微阵列技术的基础发展起来的分子生物将 首先要构建模型化合物的毒理效应数据库通过对某种化合物的分析确定其使机体暴露时开放或关闭的基因模式型系统下根据同一类毒物会引起具有共同毒性标记的基因表达变化将未知
42、毒物引起的基因表达与数据库中的数据相对比匹配在同一模就能获得未知毒物的作用机理条基因的表达毒理芯片技术最大的优点体现在规模效应上它可以同时分析上万而毒理芯片传统的毒理学只能发现机体经历化学暴露后发生了什么可以阐明这个结果是如何发生的借助毒理芯片收集生活在特定毒理环境下生物体的基因表达特性从而对毒性环境作出合理评估此外 该技术灵敏度高 同时也减芯片制作过程优待优少了检测对动物的依赖然而毒理芯片的应用尚处于起步阶段化 其检测分析 数据解释的统一标准有待确定 美国国家环境健康研究所毒理芯片研究小组拟计划将该技术用于测定暴露于人类的天然和合成化合物及化学混合物的相对安全性 毒理芯片分析出的数据认识但目
43、前该技术尚未成熟这些数据用于确定毒物危害性大小可能会彻底改变人们对外源化合物损害生物机体机制的存在着误释基因表达数据的可能 因此不能盲目地将此外 划分毒性反应需要检测多少基因 基因表7上海交通大学博士学位论文第一章 文献综述达与剂量诱导毒性之间的关系毒性反应指标与毒性间的关系等问题还有待解决 差异显示技术差异显示技术使在转录水平上研究基因表达差异的方法它通过一系列的锚定引的进行分组反转录 用比较正常的和异常的物与随机引物组合方法扩增把不同种细胞如正常和转化细胞出扩增结果 用序列凝胶电泳法显示带从而找出差异表达的基因 该技术最大的优点表现在能使细胞的每一条均有扩增的机会并能同时进行多组间样本的分
44、析比较故可同时检测并展示所有基因的差异表达和差减杂交所无法比拟的理后转化的人胚细胞这是差异杂交栗建林基因表达差异带基因片段表达受抑制 尹学均等对恶性转化细胞同正常细胞之间基因的差鲁凤明等用差异显示技术寻找经氧化镍处并通过基因测序同源性比较发现基因组的异表达状况进行比较染物 如关于发现两种细胞在基因表达方面存在明显差异其他环境污粉尘诱导的肺纤维化及癌变的基因差异显示的国家自然科学基金课题亦正在研究中单细胞凝胶电泳技术单细胞凝胶电泳又称彗星电泳是一种有核单细胞分子量很大损伤的快速检测方法超螺旋结构附着在核基质中该技术的原理是基于有核细胞的用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上在细胞裂解液作用下细胞膜蛋白
45、质及其它成分进入凝胶 继而扩散到裂解液中并留在原位 如果细胞未受经荧光染色后呈现圆形的荧光团双链解螺旋且碱变性为单核膜及其它生物唯独损伤膜破坏核使细胞内的仍保持缠绕的环区附着在剩余的核骨架上因其分子量大停留在核基质中电泳中核尾现象无拖若细胞受损 在碱性电泳液中 先是链单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中极迁移 形成拖尾 细胞核 受损愈重在电泳时断链或碎片离开核产生的断链或碱易变性断片就愈多向阳其断8上海交通大学博士学位论文第一章 文献综述链或断片也就愈小在电场作用下迁移的量多 迁移的距离长表现为尾长增加和尾部荧光强度增强因此 通过测定 迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞 损伤程度
46、该方法灵敏 简便 快速 低耗 重复性好 目前已被广泛应用于体内或者体外各种有核细胞经受试物诱导的损伤和修复的研究深圳卫生防疫站的毒理实验室对单细胞凝胶电泳技术进行改良蛋白质交联的检测方法 在此基础上观察了甲醛建立蛋白质交联和 镉 镍和顺铂对人外周血淋巴细胞蛋白质交联和化碳和粉尘联合作用对机体细胞蛋白质交联 陈胜 冯加德等运用该技术进行了高温一氧的损伤 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术是年代发展起来的一种基本原理是将 探针用生物素纤维切片上序列在染色体或高灵敏和特异行以及分辨率高的染色体和基因分析技术毛地黄毒苷等荧光染料标记然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或再用与荧光素分子纤维上的定位偶联的
47、单克隆抗体与探针分子特异结合来检测该方法实验周期短 检测灵敏度高 并且由于它可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的探针 再用不同的荧光素分子检测不同的探针分子因此可以在荧光显微镜下在同一张切片上同时观察几种曹佳等将该技术和探针的定位 直接得到它们的相关位置和顺序抗着丝粒抗体间接免疫荧光染色技术结合 研究了邵建华等丙烯酰胺 环氧丙酯等物质诱导小鼠成纤维细胞微核和着丝粒组成比例用两种不同染色体特异性探针研究发现苯的代谢物能诱发人淋巴细胞多倍体形成 穿梭质粒穿梭质粒是一类既可在哺乳动物细胞中复制型质粒其原理是将携带又可在细菌细胞内增殖的特殊复合基因的穿梭质粒 转染受致突变剂处理的含有哺乳细胞 复制后再转化宿主菌于含 和的琼脂平板上进行筛选9上海交通大学博士学位论文第一章 文献综述突变靶基因的克隆受诱变剂作用失活而呈白色正常菌落为蓝色 穿梭质粒已被广泛环境诱变剂等引起的基因突变也被广泛应用
