1、植物抗菌物病害的遗传工程研究进展随着人类环保意识增强, 对使用抗病品种的要求再度回升,对抗病品种的持久性寄予新希望。开发广谱抗病新资源、 培育持久抗病新品种已成为现代农业的要求。分子遗传学和分子生物学发展为实现这一目标提供了新手段。分子标记技术的广泛使用和分子标记辅助育种体系的建立与日趋完善,将大大缩短培育抗病品种的时间,抗病基因克隆成功以及更多抗病基因的克隆也将使在同一品种内引入多个抗病基因提供了可能。在过去近三十年的时间里,在研究植物/病原互作的生物化学及分子生物学过程中,人们发现了若干与植物防卫反应有关的蛋白因子这些蛋白基因组成了目前通过遗传工程手段开发植物抗菌物病害新资源的物质基础。本
2、文对植物抗菌物病害的遗传工程研究进展做一综述。1 病程相关蛋白病程相关( pathogenesis related, 简称 PR) 蛋白最初在受 TMV 侵染表现过敏性反应的烟草中发现,目前在 20 多个双子叶和单子叶植物中发现了 PR 蛋白。PR 蛋白不仅被植物病原等生物因素所诱导,而且也被某些化学和机械的非生物因素所诱导。PR 蛋白的产生与植物系统获得抗性( systemicacquired resistance, 简称 SAR) 的启动具有相关性,在某些植物中, PR 蛋白诱导表达被看作植物抗病反应的生化指标。根据 PR 蛋白的结构和功能, 可将已发现的PR 蛋白分为 5 大类( PR1
3、5) , 对每一大类蛋白, 又可根据蛋白酸碱度、 定位空间等分为 2 个或多个亚类。第一亚类 PR 蛋白呈碱性, 合成后在细胞液泡内积累,另一亚类 PR 蛋白呈酸性,合成后分泌至胞外。植物抗菌物病害的遗传工程始于 PR 蛋白中的几丁质酶和 1, 3 葡聚糖酶。几丁质酶和 1, 3 葡聚糖酶能水解许多种菌物细胞壁的主要成份( 几丁质和 1, 3 葡聚糖) , 而且分解后产生的寡聚物又是其他抗病反应的有效激发子。近几年研究表明, 几乎每种 PR 蛋白都具有体外抑制菌物生长的作用,只是作用对象不同。转基因植物研究表明, PR 蛋白的某些成员在体内超量表达后均能提高转基因植物对某些菌物的抗性 1, 2
4、, 3, 4, 5, 6, 7, 8。研究发现: 1)除 PR1a 蛋白外 3, 液泡内的碱性 PR 蛋白比胞外的酸性蛋白具有更强的抗菌活性 2; 2)当两个或多个 PR 蛋白在同一植株中共表达时,能提高抗性水平 6, 7, 8。对于大部分菌物病原, 在侵染的初期发生在寄主细胞间。由于抑菌活性强的 PR 蛋白储存在细胞内的液泡中,为了提高 PR 蛋白在抗病中的作用, 需要通过基因工程使胞内的杀菌蛋白分泌至胞外。因此, 根据不同类型菌物病原的寄生特点,研究 PR 蛋白在寄主体内的表达时间、 表达量及定位空间对菌物病原的抑制作用, 对于充分发挥 PR 蛋白的抗病 9 作用具有重要意义。但也应当注意
5、菌物病原也能分泌抑制 1, 3 葡聚糖酶活性的蛋白酶抑制剂 9。2 Thaumatin like 蛋白( TLPs)T haumatinl ike 蛋白( Thaumat inlike proteins,简称 TLPs)指从单子叶和双子叶植物中分离出的一类抗菌物蛋白的总称, 在氨基酸序列上与非洲浆果( Thaumatocuus daniell ii ) 高强度的甜味蛋白具有相似性。TLPs 包括烟草 Osmot in !、 Osmot in 、PR S 、 PRR 、 番茄 NP24、 马铃薯 AP24、 玉米 Zeamat in、 高梁 Sormat in、 燕麦 Avemat in、 小麦
6、 Trimat in 以及从大麦和亚麻种子分离的 Zeamat inlike 蛋白等。其中前 6 个 TLPs 是 PR5 的成员, 由病原侵染诱导产生,而后 6 个 TLPs 在植物中组成型表达,但在成熟种子含量最高。除 PRS 和 PRR 为酸性蛋白外,其他 T LPs 均为碱性蛋白。近几年来, 从几种单子叶植物( 大麦、 小麦和玉米) 发现了酸性的 T LPs, 这些新蛋白的表达与病原侵染(大麦和小麦)或非生物压力( 玉米) 有关。纯化后的各种种子T LPs 表现对不同类型菌物生长的抑制作用。TLPs 蛋白的分子量在 22KDa- 24KDa 之间, 在一级结构上有共同的特征:含有 16
7、 个半胱氨酸, 8 个二硫键,具有稳定的三维结构和强疏水性。TLPs 在抑菌机制上可能有其共同之处, 即通过改变菌物细胞膜的透性使菌物致死。转基因植物研究表明, 表达烟草 Osmotin 蛋白及马铃薯 Osmot inl ike 蛋白的马铃薯植株能延缓 Phytop hthor a inf e stans 的生长 4, 10。玉米 Zeamat inl ike 蛋白( Zeamat inl ike protien, 简称 ZLP)能在昆虫细胞、 拟南芥菜和番茄内表达, 并靠自身的信号肽分泌至细胞外,有趣的是ZLP 在番茄内表达后通过一未知机制被部分水解, 从转基因植物和昆虫中纯化的表达蛋白保持
8、对 Candida albicans( 人类病原) , Thichoderma ree sei (真菌病原) 的抑菌活性及对 Al ter naria solani ( 植物病原) , Neur osp or a cr assa (非病原菌) 的部分抑菌活性 11。有趣的是水解后的 ZLP 蛋白仍有抑菌活性 11。3 核糖体失活蛋白核糖体失活蛋白( ribosome inactivat ion proteins, 简称 RIPs) 主要是从植物种子中发现的一类抑菌蛋白, RIPs 通过对核糖体大亚基 28S RNA 的特异性修饰,使其不能与蛋白合成延长因子结合, 从而阻止蛋白的合成。RIPs
9、并不影响自身的植物核糖体, 而对其他植物的核糖体显示不同程度的特异性修饰,因此, 物核糖体也可能是 RIPs 的作用对象。从检查的 350 种植物中, 发现有 1/ 3 以上的植物产生 RIPs。体外试验表明,大麦 RIP 对 Rhiz octonia solani 的抑菌活性比几丁质酶、 1, 3 葡聚糖酶低,但是大麦 RIP 与这两种水解酶中的任何一种均有协同抑菌活性。在伤诱导启动子驱动下, 大麦RIP 在烟草中表达后, 转基因植物提高了对 R .solani 的抗性 12。4 植物防御素植物防御素( plant defensins) 是近几年从植物组织中( 主要是种子) 分离得到的一类新
10、型抗菌肽,在结构和功能上与来自昆虫和哺乳动物的防御素抗菌肽具有同源性 13。防御素在生物界代表了一类新抗菌蛋白, 昆虫防御素一般由 34 43 个氨基酸组成, 三个二硫键,由病原菌诱导产生,并分泌至淋巴细胞中; 哺乳动物防御素一般由 29 34 个氨基酸组成, 三个二硫键,存在于哺乳动物免疫细胞中; 植物防御素一般由 45 54 个氨基酸组成, 含 4 个二硫键; 三类防御素共同含有二硫键主导的三维结构( 折叠片和 螺旋) ; 植物防御素含三个连续的双向平行的 折叠片和一个 螺旋; 昆虫防御素与植物防御素相比,缺少氨基端的一个 折叠片;哺乳动物防御素没有 螺旋,只有三个连续双向平行的 折叠片。
11、比较来自 7 科 13 种 14 个植物防御素的氨基酸一级结构,可以发现在不同植物防御素中有一些保守的氨基酸,可能与维持植物防御素的三维结构或功能有关( Broekaert et al. , 1995)。植物防御素的抗菌作用主要表现在对菌物生长的抑制作用。除少数外,一般对细菌没有抑制作用,动物和植物细胞也不受植物防御素的影响。根据对菌物生长的抑制作用, 将植物防御素划为三类: 1)# Morphogenic植物防御素:减缓菌丝延伸生长和增加菌丝分支生长, 使菌物畸形; 2) # Nonmorphogenic 植物防御素: 降低菌物菌丝生长, 但不诱导明显的畸形; 3) # 淀粉酶抑制剂型植物防
12、御素: 对菌物生长没有或有很弱的抑制作用, 可能是从抗微生物进化转向抗昆虫害虫的。植物防御素主要在种子中发现,存在于胚乳、 子叶及下胚轴,在这些器官表皮细胞的外层细胞壁中(更准确地讲是在细胞的中间层) 含量尤为丰富。当种子吸水萌发时, 植物防御素立即得到释放,从而有效地保护幼苗免受土传和种传菌物的危害。越来越多的证据表明植物防御素在营养组织中处于稳定和 10 低量表达状态。当接种病原后,无论接种叶还是非接种叶中的植物防御素量迅速增加。表达胡萝卜防御素RsAFP2 的转基因烟草显著地提高了对烟草赤星病( Al ter naria longipes )的抗性 14。从植物防御素在不同器官的表皮定位
13、、 病原诱导表达及转基因植物对叶部病原的抗性三方面分析,表明植物防御素是植物防卫系统的重要组成部分。5 ThoninsT honins 主要指从禾谷类作物胚乳及叶片等器官中分离得到的一类分子量为 5KD 的含硫蛋白 15。Thonins 一般显碱性,含 6- 8 个半胱氨酸,通过 3- 4 个二硫键稳定其三维结构,对菌物和细菌具有一定的毒性。Thonins 是作为一种前原蛋白合成的,分泌至液泡、 蛋白包涵体和细胞壁中。对大麦 T honins 的研究表明, Thonins 能被生物或非生物因子所诱导。在大麦 白粉病菌系统中,在非亲合反应中叶片中的 Thonins 在乳突中积累。对如何利用 T
14、honins 提高转基因植物对菌物病害的抗性值得研究。6 植物保卫素植物保卫素( Phytoalexin)是植物在一系列生物和非生物因子刺激下合成积累的一类具有抗微生物活性的低分子量脂溶性化合物 16。对植物保卫素 30 年的研究, 发现在许多情况下, 植物保卫素的存在与对某个病原的抗性有关。例如,环型八硫( S8)是从可可粉植物中发现的一类对菌物巨毒的新型植物保卫素,在抗 Vert icill ium dahlia 的可可粉基因型中, V. dahl ia 接触的韧皮部薄壁细胞和韧皮部筛管内积累大量的 S8。Resverat rol ( 3, 4%, 5t rihydrox ystilben
15、e) 是葡萄中的一种植物保卫素, 能抑制 Bot ryt is cinerea 生长。落地花生中的 stilbene 合成酶是合成 resverat rol 的关键酶, 在烟草以及大部分其他植物中都缺少这种酶, 表达 st il lbene 合成酶的转基因烟草能合成 resverat rol, 明显抵抗 B. cinerea 的侵染 17。但也应当指出植物保卫素的抗病作用与植物种类有关,表现在对病原扩展的抑制作用, 对病原侵染没有影响, 例如在野生型拟南芥菜中,发现了若干植物保卫素缺失突变体( p ad ) , 但某些突变体并没有影响 RPS 2 基因对 P . syringae 的抗性。7
16、菌物水解酶抑制剂对大部分菌物病原, 侵染能否成功取决于能否突破植物表皮的角质层和表皮细胞的细胞壁。为此, 菌物病原经常分泌多聚半乳糖醛酸内切水解酶,水解寄主细胞壁产生寡聚半乳糖醛酸片段。一般而言, 这些降解产物分子量小( 单体、 二聚体或三聚体) ,很难诱导植物的防卫反应。多聚半乳糖醛酸水解酶抑制蛋白能抑制多聚半乳糖醛酸内切水解酶的活性,提高水解产物的长度, 这些较长的水解产物( 10- 15 单体组成的寡聚体) 能诱导寄主的防卫反应, 并通过减缓菌物病原的生长速度, 使寄主其他的防卫系统得以有效表达 18。例如,组成型表达梨果实多聚半乳糖醛酸水解酶抑制蛋白的转基因番茄提高成熟果实对 B .
17、cinerea 的抗性。8 活泼氧植物对病原的防卫反应包括活泼氧产生。在几种植物/ 病原互作系统中,经常观察到在非亲合反应中,有两次活泼氧爆发; 而在亲合反应中, 则只有一次。迄今在寄主 病原非亲合性互作系统中共发现了四种活泼氧: O2诱导植物细胞壁羟脯氨酸糖蛋白的交联;提高苯息香酸2 羟基化酶的活性,增加 SA 的合成;改变细胞内的氧化还原平衡, 调节植物中与防卫反应有关 mRNA 的稳定性等。近来研究表明在非亲合反应中,H2O2 不仅在局部范围内诱导过敏性反应,而且还可作为扩散信号启动邻近细胞的自我保护机制, 例如谷胱甘肽 S 转移酶( Glutathione St ransferase,
18、 简称 GST)基因表达。H2O2 还可参与水杨酸对 SAR 的诱导过程水杨酸抑制触酶活性, 提高 H2O2 水平;H2O2 反过来又诱导 PR 蛋白的表达等过程。转基因植物研究证明: H2O2 的产生与植物抗病相关。将菌物 Aspergil lus niger 葡萄糖氧化酶( g lucose oxidase, 简称 GO)基因导入马铃薯后, GO 通过氧化葡萄糖释放 H2O2, 测定表明转基因植物叶片和块茎中的 H2O2 水平提高后增强了对软腐病( Erw iniacarotovor a subsp carotovar a)和晚疫病( Phytop hthora inf estans)的抗
19、性 19。9 过敏性反应过敏性反应( Hy persensi t ive response, 简称 HR)指植物受病原侵染后,病原侵染点周围细胞迅速坏死的一种现象。HR 是在植物 病原互作系统中认识到的一种最强的抗病反应, 其表现形式可从单细 11 胞坏死到明显的组织大面积死亡, 主要取决于植物 病原互作系统, 有时也受环境条件的影响 2, 21。HR的发现是与抗病联系在一起的, HR 的抗病作用不仅仅是表现在对病原菌扩展的限制,而且 HR 通过诱导植物的 SAR,能抵抗多种病原的侵染。HR 的产生主要表现在两种情况: 一是由植物的 R 基因和相对应病原的 avr 基因互作诱导产生 22;二是
20、由植物病原细菌在非寄主上诱导产生 23。目前从四种植物病原细菌( E . amylovor a;E . chrysanthemi ; P . sy ringae p v . sy ringae; Pseudomonas solanacear um )中鉴定出了决定植物病原细菌在非寄主上诱导过敏性的蛋白因子。这些蛋白因子均有细菌hrp 基因家族成员编码。对以过敏性反应为特征的抗病途径应给予充分探索。已有直接证据表明无毒基因和抗病基因在同一细胞内表达后诱导细胞死亡,例如在含 N%基因的烟草上,表达 TMV 无毒基因( 外壳蛋白)的 N%烟草的细胞在愈伤组织阶段死亡 24;表达 C. f ulv u
21、m 无毒基因 avr 9 的转基因番茄,与含抗病基因 Cf 9 的番茄杂交,收获的种子萌发 13 天后, 由于两个基因产物的互作产生的过敏性致使幼苗死亡 25。根据番茄与 Cladosporium f ulv um 互作的分子基础研究, de Wit ( 1992) 提出了一个非专化的抗病性双元系统( twocomponent system for nonspecificresistance) 26。这个系统的核心是将 R 基因和互补的病原无毒基因组装于同一细胞中, 使其表达受病原侵染的时空性调节。这一抗病策略具有三方面优点: 1)抗病谱广; 2) 抗病性强; 3)对病原菌的选择压力小。受#
22、非专化的抗病性双元系统的启发,李汝刚提出利用植物病原细菌在非寄主上诱导过敏性反应防治植物病害的基因工程设想 27。这些策略成功的关键是选择合适的启动子,启动子应是病原侵染诱导型启动子。研究表明马铃薯 p rp 11 基因的启动子( 438bp) 表达专一受 P . inf estans 侵染诱导,尤其在启动子中有一 273bp 的片段专化性更强 28。在马铃薯中导入 438bp 的 p rp 11 启动子驱动的 harpin 蛋白基因,能使转基因植株高抗晚疫病 29。过敏性反应的根本特征是病原侵染点周围的细胞或组织坏死。越来越多的研究表明, 细胞坏死的调控将成为植物抗病基因工程的新方向。例如在组成型表达barstar 转基因马铃薯中再导入 273 bp 的 p rp1 启动子片段驱动的细菌核酸酶( barnase) 基因, 能赋予转基因马铃薯抗晚疫病的能力, 在转基因后代中, P. inf estans 在叶片上的产孢率大大降低 30。
