1、清远容大生物工程有限公司地址：广东省清远市生物医药城 邮编：511510 电话：（0763）3551933 传真：（0763）3551777 服务专线：（0763）3551966 网址： E-mail：猪球虫与球虫病研究进展蔡建平、谢明权、覃宗华（广东省农业科学院兽医研究所，广东 广州 510640）猪球虫病是由猪等孢球虫（Isospara suis）和某些艾美耳属(Eimeria)球虫寄生于哺乳期及新近断奶的仔猪小肠上皮细胞所引起的以腹泻为主要临床症状的原虫病，在成年猪群，虽有球虫寄生，但一般不引起临床表现，多呈带虫现象，而成为本病的传染原，尤其是母猪带虫，常引起一窝仔猪同时或先后发病，或引
2、起死亡，引起较大的经济损失。近年来，该病在欧、美、澳、东南亚国家和地区流行严重，引起兽医寄生虫学者的充分关注，在病原学、流行病学、免疫学等方面取得了不少进展。1 病原生物学1.1 猪球虫的种类猪球虫最早报道于 1878 年，由 Zurn 和 Rivalta 首先发现，但未作具体的描述和分类命名 1。Douwes（1921）也曾描述过从猪粪便中分离的肠球虫，但未予命名；次年该氏描述并命名了猪的蒂氏艾美耳球虫(E.debliecki) 1。自此之后寄生虫工作者先后报道并命名了 15 种艾美耳球虫和 2 种等孢球虫(pelllerdy,1974) 1，但其中至少有 5 种艾美耳球虫和 1 种等孢球虫
3、的有效性值得怀疑，仍有待研究 2。目前根据不同国家和地区猪球虫病的流行病学调查结果，大多数学者比较认可猪球虫的有效种计有艾美耳属 8 种和等孢属 1 种，即粗糙艾美耳球虫 (E.scabra)，光滑艾美耳球虫(E.polita)，极细艾美耳球虫(E.perminuta)，蒂氏艾美耳球虫 (E.debliecki)，猪艾美耳球虫（E.suis） ，种猪艾美耳球虫(E.porci) 、有刺艾美耳球虫（E.spinosa） ，新蒂氏艾美耳球虫(E.neodebliecki)和猪等孢球虫(I.suis) 2。据 Snith 称，在欧洲，上述猪球虫中比较常见的是 I. suis 、E.debliecki
4、 、E.scabra 3。而据 Daugschies 等对大多数文献报道的分析，上述各种球虫除 E.neodebliecki 外，在欧洲都很普遍，尤其是I.suis，常在种猪场的仔猪群中引起疾病流行 4；但 Koudela 等在捷克的调查认为，E.neodebliecki 这一虫种广泛存在，且有较强致病力，可引起临床型腹泻 5。由于猪艾美耳球虫生活史的潜隐期和孢子化时间较长，种内形态变异较大，等孢属和艾美耳属的非孢子化卵囊形态种间差异不大等特点，出现这些差异并不奇怪。1.2 猪球虫的生活史迄今为止，在猪球虫中，仅只有 I. suis 、E.debliecki 、E.scabra 、E.spin
5、osa 和 E.neodebliecki 5 种的生活史得到实验研究，对其它 4 种艾美耳球虫的生活史过程还不详细了解。一般而言，猪艾美耳球虫的潜隐期多在 10-14日间，排卵囊持续期（明显期）也长达 6-10 日。在 2.5%重铬酸钾溶液中于25孢子化时一般也需 10 天以上 1。据调查，从新鲜猪粪便中分离的 7 种艾美耳球虫卵囊（未发现 E.neodebliecki）在 1.25%的重铬酸钾溶液中于 30通氧孵化，12 天时有 97%的卵囊完成孢子化。但猪等孢球虫的潜隐期较短，为 4-6 天，明显期为 3-13 天，卵囊的体外孢子化时间为 3-5 天。现以 E.neodebliecki 的
6、生活史为例说明猪艾美耳球虫的生活史 5。清远容大生物工程有限公司地址：广东省清远市生物医药城 邮编：511510 电话：（0763）3551933 传真：（0763）3551777 服务专线：（0763）3551966 网址： E-mail：E.neodebliecki 的卵囊为椭圆形或卵圆形，卵囊壁双层，无色，外层光滑，无微孔。孢子化卵囊大小为 19.8X15.2（17-24X14-18）m ，无卵囊残体，有极粒。孢子囊长卵圆形，有明显的斯氏体和孢子囊残体，孢子囊大小为13.1X6.1(12-14X5-7) m。在 2.5%重铬酸钾中于 25孢子化需时 10-12 天，而在 20时则需 16
7、 天才能完成孢子化。其内生性发育是距回盲口 50-300cm 处的中后段空肠肠绒毛上皮细胞内进行的。口服感染 E.neodebliecki 25X104 孢子化卵囊后 5 天时，首先在后段空肠的组织切片中，于肠隐窝处的肠细胞内出现未成熟的单核裂殖体，呈球形，位于宿主细胞核上方的顶端胞质中，大小为 1.5-3 m，每个细胞内可达 5 个裂殖体，至第 7 天时，可见到球形的成熟裂殖体，沿周边分布有 10-18 个核，至第 8 天裂殖体增殖至最大，含 12-20 个新月形的裂殖子，此时刮取肠粘膜涂片进行显微镜检查，可见到大小为 8.1X1.0-1.5 m 的裂殖子。至第 9 天，开始出现未成熟的大配
8、子体(3-5 m)，第 10 天时，裂殖生殖仍在进行，但已有合子形成，此时的组织切片上可见到 8%的未成熟的裂殖体，13%的未成熟的大配子体，59%的成熟大配子体，16%的正在发育的小配子体和4%卵囊。在 HE 染色切片上，成熟大配子的特征是胞质中含水量多量嗜伊红颗粒。在成熟的小配子体中小配子呈现周边分布，中央有一 8-10 m 大小的残体。11-12 天时仍有少量有性期虫体，至 14 天时在肠切片上再也未见内生性各阶段虫体。感染后 10 天时，粪便中可查到卵囊，排卵囊持续期 6-8 天，排卵囊高峰期为感染后第 10 天（48 06521 789 OPG）和 11 天（34 44532 026
9、 OPG） 。临床症状显示期为第 8-11 天。尽管在这一研究中只发现一代裂殖体，但所见到的裂殖体很可能是第二代裂殖体，因为感染后第 5-6 天时球形单核的裂殖体大量出现，表明此之前应存在第一代裂殖生殖，只不过由于数量较少，而在组织节片或粘膜涂片上未能发现而已。1.3 猪球虫分类的一些进展猪球虫的分类也主要是依据卵囊的形态大小及结构、潜隐期和孢子化时间、寄生部位等特性来进行。但这种分类方法对研究者的个人经验及技能有很大依赖，且猪艾美耳球虫和等胞球虫及各种艾美耳球虫间的未孢子化卵囊差异很小，需进行较长时间的孢子化后才能进行分类，使猪艾美耳球虫的分类比较困难，近年来，借助于计算机辅助的数值分类法和
10、以 PCR 法为基础的分子生物学分类法已开始用于猪球虫的流行病学调查，取得一定进展。根据已报道的猪的 7 种艾美耳球虫（不包括 E.neodebliecki）卵囊形态特征，Daugschie 等 6将卵囊色泽和卵囊形态数值化，在色泽因子（cf）中，设定卵囊壁无色者数值为-1。黄色者为 1，褐色者为 5，黑褐色为 8；在形状因子（sf）中将亚球形，球形，椭圆形或圆形设为-1，卵圆形或不对称形设为 1，以德国莱卡公司的计算机辅助图像分析系统用莱卡显微镜 1000 倍下测定卵囊和孢子囊的长、宽值，首先根据卵囊壁外层的光滑度及有无微孔存在将混合种卵囊分为 3组后，再根据卵囊长度（lo）形状因子（sf）
11、色泽因子（cf）孢子囊长度（ls） 、孢子囊宽度（ws） 、孢子囊形状指数（SP=ls/ws） ，用 Excel7.0 和 WindowsSPSS软件进行分析和数值分类，以 u 检验法进行统计处理（种间差民显著的 p 值应小于 0.05） ，并与传统的分类方法进行比较。结果表明，用该法 nengl 对该次调查中粪便中存在的所有 7 种艾美耳球虫卵囊进行准确分类。根据数据库中卵囊壁外层的光滑度将猪粪便中的混合卵囊分成的 3 组中，第 1 组卵囊壁粗糙，包清远容大生物工程有限公司地址：广东省清远市生物医药城 邮编：511510 电话：（0763）3551933 传真：（0763）3551777 服
12、务专线：（0763）3551966 网址： E-mail：括 E.perminuta、E.polita、E.scabra 3 种再依据 lo 、 sf 和 cf 等参数进行数值分类，可将这 3 种球虫准确分类至种。E.perminuta 总能准确分类（ 100%） ，而对E.polita 和 E.scabra 则有 1%-3%的错误分类率。第 2 组卵囊具有黄色或褐色粗糙卵囊壁并带有明显针刺样构造，此时不需要其它参数，可直接分类至单一种E.spinosa，第 3 组卵囊的壁光滑,包括 E.debliecki、E.suis、E.porci ，需先行孢子化后再根据 sf、cf 、lo 和孢子囊形状
13、指数进行数值分类，结果 100%的E.debliecki 可准确分类，E.suis 和 E.porci 的准确率也达 93%。在这一分类方法的实际应用中，对这 7 种球虫子的准确率总体达到 98.9%。稍后 Plite 等又在此基础上进行了改进，使整个分类过程实现半自动化，达到了方便、快速、准确，用少量卵囊即可进行球虫种流行病学调查的目的 6。这种以形态为基础，借助于计算机技术进行的数值分类方法，虽然可避免传统分类方法的一些缺陷，但仍较为费时，需拍摄许多幅单卵囊的照片，且对光滑型卵囊的球虫子种需用先行孢子化，其实用性受到一定限制。近来，Ruttkowski7等根据球虫 18s rDNA 序列中
14、高度保守区序列设计了两个引物（AP1 和 19）进行 PCR 扩增，结果在所研究的 3 种球虫（E.polita、E.porci、E.scabra ）扩增出长度分别为 1 318 bp（前两种）和 1 316 bp（后者）的 DNA 片段，三者间的相互差异仅为 2%，与 I. suis 的相应扩增产物分别有 87%（E.polita ）和 86%（E.scabra 和 E.porci）相吻合。经对扩增关产物测序，发现其种间序列变异主要在 680-770bp 和 1 070-1 100bp 之间，以此间序列为基础分别构建成了 E.polita、E.porci 、E.scabra 和 I. sui
15、s 的特异性正向引物（20-23bp） ，PCR 扩增后，在 E.porci 形成 330bp 的扩增产物，而在其它 3 种则产生 560bp 的产物。在针对这 4 种球虫特异性引物中，除 E.scabra 和 SCAB-1 与 E.porci 有交叉反应外，其余引物者都有是种特异性的，能根据从猪粪便中的新鲜卵囊（无需孢子化）所提取的 DNA 将球虫方便地鉴定至种。理论上计算，仅需 250 个艾美耳球虫子卵囊和 25 个等孢球虫卵囊即可进行准确分类；且该法可用于对卵囊或孢子囊结构已有损伤或长时间保存的陈旧性卵囊进行精确分类。而在猪等孢球虫子，同样以 18s rDNA 的 PCR 产物进行多态性
16、分析和聚类分析后发现，有斯氏体或无斯氏体的不同种等孢球虫差异较大，在无斯氏体的等孢球虫 18s rDNA 与肉孢子虫科成员间同源性更大一些，而有斯氏体者则与艾美耳科由源性较大，因此有人建议在系统分类上，I. suis（无斯氏体）应归于肉孢子虫科（Sarcocystidae ） 18。2 致病性和流行病学1.1 猪艾美耳球虫过去，一般认为 I.suis 的致病力较强，常可引起哺乳仔猪的严重腹泻，而艾美耳球虫的致病菌力较弱。但近年来的流行病学调查和试验研究都表明，猪的艾美耳球虫病实际上普遍存在，即使是在亚临床状态，其损失也可能是很大的。猪的数种艾美耳球虫（如 E.polita、E.scabra、E
17、.debliecki、E.suis、E.spinosa和 E.neodebliecki 都可在乳猪和断奶后仔猪引起发热、腹泻、体重降低、食欲下降等症状 5 ,9,10,11,12,13,14。以 25X104E.neodebliecki 孢子化卵囊接种 18 只 30 日龄仔猪，结果在感染后 8-11 天间出现严重腹泻，粪便呈现粘液状带泡沫，褐色或绿色，常粘附于会阴部，12 天时粪便呈现糊状，并在 13-14 天时逐渐恢复至正常。在 8-11 天时剖检实验猪有明显的肉眼病变，表现为在中后段空肠有卡它性清远容大生物工程有限公司地址：广东省清远市生物医药城 邮编：511510 电话：（0763）3
18、551933 传真：（0763）3551777 服务专线：（0763）3551966 网址： E-mail：或局灶伪膜性炎症，粘膜表面有斑点状出血和纤维性坏死斑块，肠系膜淋巴结水肿性增大；显微镜下可见肠绒毛萎缩，肠上皮细胞灶性坏死，在绒毛顶端有纤维素性坏死物，并可在上皮细胞内见到大量成熟的裂殖体，裂殖子等内生性阶段虫体。猪的艾美耳球虫病一般发生断奶前后的仔猪。但对其流行病学的研究仍很少。2.2 猪等孢球虫I.suis 是引起猪球虫病的主要病源，且常为原发性，发生于产房内的哺乳期或新断奶的仔猪。在世界各国，其发生率约占仔猪腹泻性疾病中的 15%20%16。据欧洲国家的流行病学调查有 83%100
19、%的猪场有 I.suis 感染 17，在美国每年导致的经济损失高达 1 亿美元以上。I.suis 主要寄生于猪小肠，偶可寄生于盲肠及结肠，其中以空肠或肠尤为常见，以 5X104 卵囊试验接种 1-3 日龄仔猪可引起严重腹泻，接种 7X1043X105 卵囊则引起仔猪死亡。腹泻以糊状粪便开始，2-3 天后转为水样，常呈现黄色或灰白色但无血便，有强烈的酸奶味。以 2X10 5 感染 3 日龄仔猪后 2-4 天开始发生腹泻，并一直持续至感染后 10 或11 天；4.5 天时即在粪便中出现卵囊，第 7 天时为排卵囊高峰；在整个病程中分别于 5-7 天和 12 天时出现两次排卵囊高峰，说明有一次循环感染
20、出现。显微镜下可见肠绒毛萎缩、融合、肠隐窝增生，并有坏死性肠炎的病理表现，在肠上皮细胞内可见到双核形并以内出芽生殖的型裂殖体和多核的型裂殖体 18。仔猪出生后可立刻感染 I.suis。由于猪等孢球虫生活史短暂， 5-7 日龄时仔猪生活环境中即有大量卵囊，因而等孢球虫病常发生于 7-14 日龄的乳猪 18。但新近的调查表明更大日龄的仔猪也可发生。Sayd 等证实 10-19 日龄仔猪的 I.suis检出率更高；哺乳期仔猪和常规断奶后的仔猪卵囊检出率也无明显差异 19。在一次更大范围的调查中 20，Meyer 发现在大型机械化养猪场，3-4 周龄的仔猪感染最高。在历时一年的连续采样检查中发现 5
21、个种猪场（母猪群 155-238 只）的 264 窝仔猪（按总产仔猪窝数的 10%抽样）中总体累加感染率为 53.8%（在不同的猪场分别为 20%-81.5%） ，至哺乳末期，腹泻病发生率最高，可占采样窝数的 66.3%，有 63.4%的腹泻仔猪粪检等孢球虫卵囊阳性粪检阳性的猪有 78.2%发生临床型球虫病；夏季（66.3%）和秋季（61.0%）的发生率明显高于冬季（37.9% ）和春季（47.9%） ，且常与致病性大肠杆菌和兰氏类圆线虫（Strongyloides ransomi）混合感染。不同的断奶方式对断奶仔猪的 I.suis 感染率似有影响，早期断奶的仔猪在断奶后 6-7 周育成期间
22、3 次采样检查，感染率从 37.5%下降至 20.2%再至 4.1%，与此同时腹泻发生率则从 36.5%降至 11.0%再至 3.3%；而常规断奶的仔猪则从 17.2%上升至 21.9%再稍降至 21.0%，腹泻发生率则分别为 34.4%、33.0%和 5.7%。有自动除粪系统的仔猪栏中仔猪感染率较低，网孔型地板栏舍内仔猪的感染率明显小于平实型地板栏舍的仔猪。产房污染是仔猪感染的主要来源，并可造成在同一产房内的一窝窝仔猪的连续感染 21,22。极少量的残存卵囊即足以导致这种连续感染 22，一窝仔猪中只要一只感染，很快引起全窝仔猪同群感染，较短的潜隐期和孢子化时间及仔猪栏内较高的温度（可达 35
23、） ，使 I.suis 生活史很易完成，可能是感染在同窝仔猪间迅速扩散的主要因素。但大多数研究认为母猪带虫对其仔猪等孢球虫病发生的流行病学意义不大。3 免疫对猪球虫病的免疫机理研究还非常少。但一些临床表现说明仔猪能对球虫清远容大生物工程有限公司地址：广东省清远市生物医药城 邮编：511510 电话：（0763）3551933 传真：（0763）3551777 服务专线：（0763）3551966 网址： E-mail：感染产生免疫力。Sturt 等实验证明仔猪试验或自然感染 I.suis 后对再感染有很强的抵抗力，不但无临床症状，且很少甚至无卵囊排出；一日龄仔猪口服4X105 孢子化卵囊后出现
24、水样腹泻，甚至引起死亡；但给 19 日龄仔猪同样剂量的卵囊则只引起轻微临床表现，说明仔猪对 I.suis 感染有年龄免疫现象。仔猪出生后 3-4 周内，肠相关淋巴组织的结构和功能是逐渐发育成熟的，随着年龄的增长，肠道局部抗球虫免疫的特异性细胞介导免疫反应的细胞和体液因子逐渐发挥作用，且非特异性免疫因子可能比特异性免疫因子有更重要的作用。4 诊断和防治猪球虫病发生于哺乳期和断奶前后，正是仔猪腹泻病的好发年龄，有多种病理或生理因素可引起仔猪腹泻。因此对仔猪球虫病的诊断比较困难，仅从粪检中查获卵囊或进行克粪便卵囊计数是不够的，必须辅以剖检，在小肠上皮细胞中查见艾美耳球虫或等到孢球虫的内生性阶段虫体及
25、相应的病理变化才可确诊。目前还未见有能用于猪球虫诊断的免疫学方法报道。猪球虫卵囊的粪便检查以饱和盐水（d=1.20g/ml）漂浮法较好，饱和硫酸锌（d=1.29g/ml ）饱和蔗糖（ d=1.29g/ml） 、饱和氯化锌 +蔗糖（d=1.30g/ml）由于比重较大，对球虫卵囊的检出率反而有明显影响。猪球虫病的治疗较为困难，还应以预防为主，鸡用的大多数抗球虫药无明显效果。氨丙啉、莫能霉素、呋喃唑酮等经试验证明无预防和治疗作用。磺胺类药物可用于治疗或预防球虫病，但喂服困难，患病仔猪常不愿采食或饮用含治疗药物的饲料、饮水，以高浓度磺胺类药物配成糊状物涂于母猪乳头，可能异致仔猪因异味而不愿吮乳，效果并不理想。据报道 5%的三嗪酮悬液（商品名为百球清）对仔猪球虫病有极好的治疗预防效果。按 20mg/kg 体重（相当于0.4ml/kg）或 1 ml/头仔猪剂量于 3-5 日龄一次口服可完全预防球虫病的发生，增重明显；由于该药对猪球虫内生性发育各阶段虫体均有效，以此剂量进行治疗也同样有效。该药安全性好，5 倍剂量仔猪也能完全耐受，且与补铁剂（口服或非肠道给药） 、恩诺沙星、庆大霉素 、硫酸抗敌素，增效磺胺等无任何相互干扰，也不影响仔猪免疫力的产生，在生产中已得到广泛应用。猪的饲料中添加盐霉素，对猪球虫有预防作用。
