1、西北农林科技大学大学生创新创业训练计划项目创新训练项目申请书项目级别 国家级 项目名称 Lis1 在神经元迁移过程中的作用及分子机制研究 项目负责人 戴玉川 学院、年级、专业 生命科学学院 2010 级 生物工程专业 联系电话 18700809314 电子邮件 填表日期 2010 年 4 月 5 日 西北农林科技大学教务处制表项目编号2一、基本情况项目名称 Lis1 在神经元迁移过程中的作用及分子机制研究项目来源 陕西省“百人计划”资助项目子项目负 责 人 戴玉川 性别 男 年龄 21 学号 2010013468所在学院 生命科学学院 专业 生物工程联系电话 18700809314 电子邮箱
2、 指导教师 赵善廷 性别 男 年龄 48研究方向 神经生物学 职称 教授联系电话 18700975432 电子邮箱 姓名 学号 学院 专业 项目分工王彤 2010013635 生命科学学院 生物技术 质粒构建王艺璟 2010013618 生命科学学院 生物技术 实验动物购买与饲养付悦 2010013488 生命科学学院 生物工程 细胞转染戴玉川 2010013468 生命科学学院 生物工程 项目其他工作项目成员获奖者 奖励、成果名称 颁发单位及时间戴玉川 校三好学生 西北农林科技大学，2011 年戴玉川 优秀学生干部 西北农林科技大学，2011 年戴玉川 专业一等奖学金西北农林科技大学生命科学
3、学院2010、2011 年王艺璟 优秀学生干部 西北农林科技大学，2011 年王艺璟 专业三等奖学金西北农林科技大学生命科学学院，2011 年项目组人员获奖及成果情况王彤 专业三等奖学金西北农林科技大学生命科学学院，2010 年3二、立论依据1.项目的研究意义（限 200 字）大脑发育机制的研究是当今生物学和医学研究领域的热点之一。Lis1 是参与神经元迁移过程的一个重要调节因子，它在大脑皮质发育过程中有很高水平的表达，但是对于 Lis1 调控神经元迁移的机制仍不清楚。 通过对 Lis1 的研究可以使人们能够深入了解大脑中未成熟神经元的迁移及大脑发育的分子机制，不仅可以提供神经元发育的理论基础
4、，还有助于了解某些遗传疾病的分子机制，并为临床疾病监测提供前期判断。2.国内外研究现状分析并附主要参考文献（限 1000 字）神经元迁移障碍会导致脑皮层畸形从而引发脑部发育上的严重后果，包括癫痫、智力缺陷 1。大脑发育过程中神经元迁移受多种因素调控，其中 Lis1 是参与神经元迁移过程的一个重要调节因子 2，其基因的突变会引起神经元迁移异常和无脑回畸形 3。通过研究在胚胎发育不同时期转基因小鼠发现，Lis1 单倍体突变的小鼠表现为大脑皮层和海马体的分层缺陷，而其纯合子突变会造成胚胎致死 4。Lis1 在胚胎神经元中高效表达，因此推测在单倍体突变小鼠中神经元迁移障碍 5。在对不同发育时期的小鼠进
5、行研究的过程中发现，神经上皮干细胞的分裂增殖以及保证细胞均匀分裂不能缺少 Lis1 的存在，其保证了有丝分裂纺锤体正确地导向，使得神经上皮干细胞对称地分裂 6。但是它在神经上皮干细胞发育过程中的具体机制尚不清楚 7。Lis1 可以调节轴突内的微管运输，影响有丝分裂的正常进行，还可通过直接与细胞骨架作用而影响神经迁移，且通过影响有丝分裂来减少迁移神经元的数目 8。由此预测 Lis1 可通过引导分子马达动力蛋白（Dynein ）到细胞膜两边的表面而行使前述功能 9。有学者发现活体老鼠大脑组织中神经元干细胞的亚细胞行为细节。在大脑发育过程中，神经前体细胞沿着放射状神经胶质纤维迁移到新皮层。无脑回的致
6、病基因 Lis1 的 RNA 干扰（RNAinterference ，RNAi）抑制了活体脑组织切片中神经元体细胞的移动而非神经前体细胞的过程延长 10。【参考文献】1Liu Judy S. Molecular Genetics of Neuronal Migration Disorders. CURRENT NEUROLOGY AND NEUROSCIENCE REPORTS. 2011.11(2),171-1782余爽,徐群渊.胚胎皮层神经元的迁移及其相关分子机制.基础医学与临床.2005.8.25(8),684-6913Tiziano Pramparo, Yong Ha Youn, Je
7、ssica Yingling, Shinji Hirotsune, Anthony Wynshaw-Boris. Novel Embryonic Neuronal Migration and Proliferation Defects in Dcx Mutant Mice Are Exacerbated by Lis1 Reduction. The Journal of Neuroscience. 2010. 30(8)， 3002-30124Koizumi, H., N. Yamaguchi, M. Hattori, T.O. Ishikawa, J. Aoki, M.M. Taketo,
8、K. Inoue, and H. Arai. Targeted disruption of intracellular type I platelet activating factor-acetylhydrolase catalytic subunits causes severe impairment in spermatogenesis. J. Biol. Chem. 2003. 278,12489-124945Moore Katherine D.,Chen Renee, Cilluffo Marianne 等. Lis1 reduction causes tangential migr
9、atory errors in mouse spinal cord. JOURNAL OF COMPARATIVE NEUROLOGY. 2012. 520(6),1198-12116Cardoso, C., Leventer, R.J., Dowling, J.J.等. Clinical and molecular basis of classical lissencephaly: Mutations in the LIS1 gene (PAFAH1B1).HUMAN MUTATION.2002.19(1),4-157Jessica Yingling,Yong Ha Youn,Dawn Da
10、rling, Kazuhito Toyo-oka, Tiziano Pramparo, Shinji Hirotsune ,Anthony Wynshaw-Boris.Neuroepithelial Stem Cell Proliferation Requires LIS1 for Precise Spindle Orientation and Symmetric Division .CELL. January,2008.132(3),474-4868刘丽蓉，朱学良. “与细胞运动性相关的 NudelLis1dynein 通路功能及调节”研究进展. CHINESE BULLETIN OF LI
11、FE SCIENCES. 2006.18(4)9Tsai,Jin-Wu, Bremner,K Helen, Vallee,Richard B. Dual subcellular roles for LIS1 and dynein in radial neuronal migration in live brain tissue. Nature Neuroscience. 2007.10(8),970-97910活体脑组织神经元辐射型迁移过程中 LIS1 和动力蛋白的双重亚细胞作用.中华神经医学杂志.2008.1,962R-CH2-CH-CH2Cl CH3OH +CH3-N-CH2-CH2-N-
12、CH3CH3 R-CH2-CH-CH2-N+-CH2-CH2-N+-CH2-CH-CH2-RCH3OHCH3CH3CH3OH 2Cl-4三、研究方案1. 研究目标（限 200 字）本课题的目的是拟将载体构建、细胞转染等分子生物学技术，子宫内电击转染、免疫组化、激光共聚焦显微镜等形态学技术相结合，研究和分析 Lis1 野型、Lis1 干扰型以及不同 Lis1 点突变对神经元迁移的作用和影响，对阐明神经元迁移的机理和大脑发育的分子机制提供理论基础和实验数据。2.研究内容（限 400 字）(1)质粒构建利用相关技术克隆 Lis1 野型、干扰型以及突变型，并将其构建至 pCAG-MCS 载体上并设计对
13、照组。(2)Lis1 表达量对细胞形态、细胞骨架及粘附分子的影响将构建好的 Lis1 载体转染至细胞中，在体外观察和研究 Lis1 表达量对细胞形态、骨架和粘附分子的影响。(3)Lis1 超表达和 RNA 干扰 Lis1 蛋白表达对神经元迁移的影响将表达野型的 Lis1 和含有沉默 Lis1 的质粒载体分别与表达 GFP 的质粒共转染到胚胎小鼠大脑新生的神经元中并观察和分析被转染后迁移神经元的形态结构特点。将以上结果与相应空载体质粒转染对照组进行对比，分析 Lis1 表达量对神经元迁移的影响。(4)Lis1 突变体构型对神经元迁移的影响将突变体质粒与表达 GFP 的质粒通过子宫内电击转染技术共
14、转染到胚胎小鼠大脑新生神经元中，运用与上述 3 中的相同策略研究和分析 Lis1 不同位置点突变对神经元迁移的影响。3.拟解决的关键问题（限 200 字）(1)将表达各种 Lis1 的质粒（野型、干扰型、突变型）转染细胞系应用 RT-PCR 和 WB 研究它们是否表达相应的蛋白质，应用免疫组化 观察和研究它们对细胞的形态、细胞骨架及粘附分子分布的影响。(2)Lis1 表达量以及干扰型及突变型对神经元迁移的影响，包括形态变化造成的影响、迁移方向。64. 拟采取的研究方法及技术路线（限 800 字）（1）研究方法：本课题将主要应用 RT-PCR 技术构建 Lis1 野型、干扰型及点突变质粒载体，然
15、后将质粒转染到细胞系中，应用 RT-PCR、Western blotting 和免疫组化技术检测 Lis1 的表达量及细胞形态，细胞骨架分子的变化，然后进行子宫内电击转染、荧光免疫组化、激光共聚焦显微镜，观察和研究 Lis1 的表达量及其点突变对神经元迁移和大脑发育的影响。（2）技术路线图：75实验方案（限 500 字）(1)质粒的构建：利用分子生物学技术将野型及突变型的 Lis1 序列插入到 pCAG-MCS 质粒中并构建含有引起 Lis1 mRNA 降解的小 RNA 序列的质粒载体，用于抑制神经元中 Lis1 的表达。(2) 细胞培养及转染将 CHO 细胞接种于含 10%胎牛血清的 DME
16、M 培养液（含 100 IU/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素） ，在 37、5%CO 2 的条件下培养，每 2-3 天换液 1 次。实验分为 3 组：对照组、空载体组和目的组。(3) RT-PCR和Western blotting：我们将重组质粒转染细胞，提取细胞总 RNA 和总蛋白，检测目的基因以及相关基因的 mRNA 和蛋白表达。(4) 细胞免疫组化染色：将转染后的细胞使用 4%甲醛溶液固定，然后加入一抗、二抗，最后使用 DAPI 进行胞核染色。染色结束后在激光共聚焦显微镜下观察，对结果进行分析和测量。(5) 子宫内电击转染：取孕期为 14.5 天的孕鼠，用电转仪进行电击，将质
17、粒转染到胎鼠大脑壁靠近侧脑室的室带内新产生的神经元中。(6) 荧光免疫组化染色和激光共聚焦显微镜观察和拍照：从每个实验组中选择部分被转染的大脑分别于转染后 3 天和 5 天取脑用 4%甲醛固定，琼脂包埋，震荡切片机切片，进行荧光免疫组化染色，然后用激光共聚焦显微镜观察拍照。(7) 结果分析：运用分析软件和相关方法对实验结果进行分析。6具备的知识基础（限 150 字）(1)本课题组成员都经过生物化学、分子生物学等专业课程的系统学习，对于实验中的各个步骤的理论基本掌握，并能够熟练掌握生物信息学相关软件进行分析；(2)本课题组成员已经参与了生物化学、动物学、微生物学等实验课程的基础理论和简单操作的相
18、关训练，基本能够自主的设计并进行实验操作；(3)本课题组成员利用空闲时间查找大量文献，对实验中的一些问题进行深入探讨，并且对于实验中的相关操作问题已运用相关专业软件进行初步分析和处理，进一步降低实验中可能出现的问题。7.设备条件（限 150 字）本组同学可以使用实验室具有进行生命科学领域高水平研究所需的先进仪器设备，例如：美国 BTX 公司 ECM830 电穿孔仪，德国Zeiss 公司生产的结构照明显微镜和 Nikon 公司生产的 SP 激光共聚焦显微镜，超纯水系统，手工振动式切片机，低温高速离心机，普通PCR 仪，全自动高压灭菌器，超低温冰箱和 CO2 培养箱等。8.本项目的创新之处（限 2
19、00 字）本课题的独到之处是将分子生物学、子宫内点击转染和活体动态观察等先进技术方法相结合，达到分子与结构相结合，体内与体外相结合，动态与静态相结合，全面而细致地来研究 Lis 1 及其不同位点点突变对大脑发育过程中神经元迁移的影响，阐明大脑发育与神经元迁移的分子机制。 89. 项目研究年度计划2012年载体构建;5-6 月细胞培养及质粒转染：7-8 月RT-PCR 和 WB 分析：9-10 月细胞免疫组化分析：11-12 月2013年子宫内点击转染：1-3 月免疫组化染色：4-6 月结果分析：7-9 月论文写作：9-11 月10.项目成果 (1)取得 Lis1 野型、干扰型和突变型的质粒。(
20、2)探究出 Lis1 在神经迁移及其形态塑成过程中的具体作用机制，包括表达量及作用程度，论文写作进行详细阐释。(3)争取在相关专业期刊中发表文章。9四、经费预算支 出 科 目 金 额（元） 计 算 根 据 及 理 由合计 18，000 按照学校要求1.科研业务费 2，000测试、计算、分析 1，000 激光共聚焦照相费用能源动力 700 活细胞动态观察能源消耗文献、信息传播费 300 文献资料以及查新费用2.实验材料费 14，000药品购置费 1,000 抗生素，培养基等试剂 11，000 目的抗体，标签抗体等原材料 2，000 小鼠，鸡胚等试验原材料3其他支出 1，500动物培养费 1，500 小鼠饲养垫料、饲料等7六、审批情况：指导教师对项目的评价及承诺： 签字：年 月 日学院推荐意见：分管领导签字： （公章）年 月 日学校评审组意见：建议项目经费： 元 组长签字： 年 月 日教务处意见：批准项目经费： 元 负责人签字： （公章）年 月 日
