1、转基因小麦研究进展及前景1转基因小麦研究进展及前景摘 要：自第一株转基因小麦报道以来，小麦转基因育种研究发展迅速，通过转基因技术实现的小麦遗传转化弥补了经典小麦育种的不足，突破了可利用基因库的限制，取得了可喜的进展。简要介绍了基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法等基因转化方法在小麦遗传转化中的应用，讨论了转基因技术在获得抗除草剂、抗病虫、抗逆、改良品质和雄性不育转基因小麦植株等方面的应用现状及其存在的主要问题与对策。关键词：小麦；转基因；分子育种；进展采用远缘杂交技术将小麦野生近缘物种中的有益外源基因导入小麦栽培品种，对其抗性、品质、产量的提高发挥了重要作用。但由于双亲亲缘关系较远造成杂交不结
2、实、杂种不育、杂种后代长期分离、预见性差，使该技术在小麦遗传改良上的应用受到一定限制。植物转基因技术被证明是进行外源基因定向转移独特而有力的手段，一定程度上补充或改进了传统的育种方法。通过植物遗传转化技术，可以按照需要，将有遗传信息的 DNA 片段即目的基因进行人工重组，在离体条件下转入宿主细胞进行复制、表达，定向改造植物，可以打破基因流的界限，而且大大缩短育种周期。小麦是举世公认的最难转化的重要农作物之一，且转基因研究起步较晚，经过许多学者十几年的不懈努力，取得了长足的进展。目前，几乎所有的作物都开展了转基因研究，育种目标涉及到高产、优质、高效、兼抗性及多用途等诸多方面，一批抗逆性（如抗病、
3、抗虫、抗除草剂）转基因作物已进入商品化生产阶段。美国研制成功的世界第一例抗草甘磷除草剂转基因小麦已经通过安全性试验；抗草胺膦转基因小麦、抗咪唑啉酮转基因小麦、高蛋白转基因小麦、抗虫和耐镇草宁除草剂转基因小麦、抗蚜虫转基因小麦、抗小麦黄花叶病毒转基因小麦，以及抗白粉病、赤霉病和黄矮病的转基因小麦正在田间释放1,2；高分子量谷蛋白亚基转基因小麦 3、转 Trx-S 基因抗穗发芽小麦新品系已进入中试阶段 4。近年来，中国在小麦转基因方面也取得了初步的进展，并获得了一批具有抗病虫、抗逆境及改善品质的转基因小麦新材料，部分品系已经进入环境释放阶段。本文概述了小麦转基因研究常用遗传转化技术及其在小麦遗传改
4、良中的应用，讨论了存在的主要问题及采取的应对措施。1 小麦转基因技术小麦转基因技术是指用人工方法将外源基因或 DNA 导入小麦细胞，使之稳定地整合、表达并遗传的综合技术。小麦转基因技术可根据转化目的基因否需要通过组织培养再生植株分为两大类，第一类需要通过组织培养，常用的方法有农杆菌介导法、基转基因小麦研究进展及前景2因枪介导法、花粉管通道法等；第二类不需要通过组织培养，如 PEG 法、电激法等。在小麦遗传改良中应用最广泛的是第一类方法。1.1 花粉管通道法中国学者周光宇 1974 年提出的 DNA 片段杂交假说是花粉管通道法的理论基础，他于 1983 年建立了花粉管通道法，该技术利用植物授粉后
5、花粉萌发形成的花粉管，将外源 DNA 送入胚囊中尚不具备正常细胞壁的合子。利用该法进行基因转移的工作主要集中在中国。1992 年，周文麟等通过花粉管法将 C4作物的 DNA 导入小麦，获得了具有 C4作物若干性状的转“ 基因”后代 5。随后，曾君祉等利用该法将带有 GUS 基因的pBI121 质粒导入小山 3 号，获得 5 株转基因植株，转化率为 4.7%6。阎新甫等将抗白粉病的大麦 DNA 导入花 76，既获得了符合遗传规律的稳定抗病后代，还明确了抗白粉病基因由一对显性基因控制 7。Ziberstein A 等将质粒 DNA 涂于授粉的柱头，提高了转化频率，并完成后代分析和分子鉴定 8。成卓
6、敏等将大麦黄矮病毒 GPV 株系的外壳蛋白基因导入小麦品种，获得了抗黄矮病毒 GPV 的转基因小麦株系 9。曾君祉等对通过花粉管通道法获得的转基因小麦植株后代遗传表现及转化机理进行了探讨，证明导入的外源基因可以在小麦转基因植株后代中连续遗传，其遗传规律与农杆菌、基因枪法等所得结果相似，其转化机理类似于原生质体转化 10。于洪欣等把抗虫基因 CPTI 导入小麦，获得了 5 株转基因植株，发现去柱头滴加法的转化效果较好 11；牟红梅等将慈菇蛋白酶抑制剂 API 基因导入小麦，获得了 0.29%转化率，并对转化后代进行遗传学分析 12。张茂银等将新疆大赖草 DNA 导入花培 761，获得了不同于原受
7、体特性的新个体 13；刘志方等将带有 NPT-、GUS、AFP基因的 pGV 质粒通过花粉管途径转化小麦，得到 T1 和 T2 代转基因植株，并指出授粉后 40min-4h 形成花粉管通道，是滴加外源质粒的最佳时期 13。刘学春等将栽培一粒、中间偃麦草、蔟毛麦等 DNA 导入小麦，引起了 D2 代性状的广泛变异 14。花粉管通道法避免了组织培养与植株再生过程，减少了基因型的影响，不需要昂贵的仪器设备，转化成本较低，操作简便，是转化小麦外源基因的一种简便方法。但是，花粉管通道法的转化率较低，随机性强，转化后获得的群体大，后期检测困难。此外，人们对花粉管通道法整合外源基因的机理还不清楚，需要对后代
8、中出现的碱基甲基化、基因沉默以及拷贝数量对表达水平的影响等问题开展深入的研究。1.2 基因枪法基因枪法又称微粒轰击法，它利用火药、高压放电或高压气体将吸附了外源 DNA 的金粉或钨粉高速射入受体细胞或组织而实现遗传转化。该法由美国 Cornell 大学Sanford 提出，Sanford 等最早研制出火药式基因枪，后来，Sanford 等又设计了气动式基因枪。1992 年，Vasil 等以胚性愈伤组织为外植体，利用该法获得了用 Gus 和bar 基因转化的转基因小麦，开创了转基因小麦研究的先河 15。随后，该研究组用未转基因小麦研究进展及前景3成熟胚及其生成的初生愈伤组织为外植体，极大地缩短了
9、获得转基因植株的时间，同时将基因型扩大到 3 个。Weeks、Becker 等分别以未成熟胚和幼胚盾片为外植体，通过基因枪法获得了转基因抗除草剂小麦，后者还建立了较完整的转化体系 16。Nahra 等以分离的盾片为转化受体，用基因枪法成功地将外源基因导入小麦 17。肖兴国等以小麦幼胚和花药愈伤组织为受体，利用基因枪法进行了小麦转化实验研究 18。徐琼芳等以未成熟胚诱导的愈伤组织为材料，通过基因枪法获得了 0.49%的转化率 19。庞俊兰等利用基因枪共转化法，将小麦土传花叶病毒外壳蛋白基因 CWMV-CP1 和 Bar 基因导入扬麦 158，获得了 0.99%的转化率 20。基因枪法的转化受体广
10、泛，可以是胚性悬浮细胞、愈伤组织、未成熟胚等，以幼胚组织为最好 21。用“ 手持式”基因枪轰击小麦胚顶端分生组织、营养体顶端分生组织和花序分生组织，均可获得外源基因瞬时表达和转基因植株 22。此外，基因枪法可以实现多基因转化 23。目前，90%以上的转基因小麦是通过基因枪法获得 19。与此同时，基因枪法也存在转化率较低，以及转化成本较高，嵌合体不易排除等缺点。进一步优化基因枪转化小麦的体系，选择和应用最佳参数是进一步提高基因枪法转化频率的关键。1.3 农杆菌介导法自 1983 年第一株以农杆菌介导的转基因烟草问世以来，农杆菌法很快就成为双子叶植物基因转导的主要方法。截止 20 世纪 90 年代
11、初，人们一直认为禾谷类作物不在农杆菌的宿主范围之内，利用农杆菌介导转化单子叶植物不大可能。小麦更是如此。Moony等最早尝试根癌农杆菌对小麦的转化，但是并没有转基因植株的再生 24。随后，Chen Ming 等以未成熟胚、预培养的未成熟胚和胚性愈伤组织为材料，建立起农杆菌介导的小麦快速转化体系 25。接着，夏光敏、叶兴国等分别利用农杆菌介导法获得了转基因植株，并经分子检测和遗传分析证明外源基因能够稳定表达和遗传 26，27 ，王永勤等对影响小麦农杆菌转化的因素作了系统研究，为进一步应用该方法奠定了基础 28，黄益洪等利用含有 Bar 基因和 Gus 基因的 Mini-Ti 质粒对 6 种农杆菌
12、介导小麦转化进行研究，部分植株实现了外源基因的成功转化 29，叶兴国等利用农杆菌介导法获得导入几丁质酶和 -1,3- 葡萄糖酶双价基因的转基因植株 30。农杆菌介导法操作简便，成本低，可以转移较大的 DNA 片段，其基因插入的低拷贝性，有利于克服基因失活。农杆菌介导法不需要原生质体培养再生的过程，不同组织均可作为其转化受体。此外，基因枪法与农杆菌法相结合的“Agrolistic”法，碳化硅纤维辅助的农杆菌法，超声波辅助的农杆菌法，以及农杆菌法与病毒相结合的“Agroinfection”法等都不同程度地提高了农杆菌介导的转化率。1.4 其他直接转化法其它直接法，如显微注射法、激光微束穿刺法、PE
13、G 介导法、脂质体介导法和电激转基因小麦研究进展及前景4法等对小麦的转化近乎无效。同时转化受体材料都是原生质体，对基因型依赖性很大，而且理想状态原生质体受体和再生植株的获得很困难。Serik 等(1996)年用硅碳纤维结合旋涡处理将 DNA 转入小麦成熟胚细胞，从这些处理胚诱导产生的愈伤组织包含可以表达的 GUS 基因 31。由于小麦成熟胚材料来源十分方便，故此实验的成功将意义重大。2 转基因技术在小麦遗传改良中的研究进展小麦转基因技术的发展和应用解决了远缘杂交的诸多不利因素，使有益的外源基因能够导入小麦，如改善品质、抗除草剂、抗病虫、抗逆性等，实现了常规育种无法实现的遗传重组。2.1 抗除草
14、剂转基因小麦研究Vasil 等将除草剂抗性基因（ Bar）导入小麦品种，获得世界上第一株抗除草剂转基因小麦 15。Becker、Ortiz 等分别将 GUS/Bar 基因导入小麦品种，获得抗除草剂转基因植株 16,32。柯遐义等利用电激法获得转基因抗除草剂植株 33。Sivauni、赵虹等分别获得抗除草剂转基因植株 11。张媛媛等将抗除草剂 bar 基因导入 3 个小麦品种，获得抗除草剂转基因植株 34。2.2 抗病虫转基因小麦研究小麦病虫害是造成小麦减产和品质下降的重要原因。近年来,小麦抗病虫基因工程的研究在提高小麦抗病虫上展现出良好的应用前景。将几丁质酶基因 35、KP4 基因 36等导入
15、小麦提高其对真菌性病害的抗性。将 WYMV - Nib8 、BYDV - GPV、PAV + GPV 等基因转化到小麦中,获得抗黄矮病毒的转基因小麦 37- 39。一些学者将抗白粉病基因40、天花粉基因 41、哺乳动物的免防御素(NP -1)42基因导入小麦,并获得转基因植株。此外,小麦的抗虫转化研究中也有很多成功的报道, Stoger 等 43将抗蚜虫的雪花莲凝集素( GNA) 基因和乙醇酸氧化酶基因( GOS) 导入小麦,获得抗虫植株;于洪欣等44、牟红梅 45分别将 Cp TI 和 API 基因导入小麦,提高小麦对鳞翅目、鞘翅目等害虫的抗性。将苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因(Bt)转入小
16、麦中,获得抗虫植株 46,大大提高了小麦的产量。最近，康乐等将黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因导入扬麦 10 号、鲁麦22 和鲁麦 23，获得抗白粉病转基因植株 47。2.3 改良品质的转基因小麦研究我国小麦品质的遗传改良工作还很薄弱，面粉品质性状普遍较差，主要是因为缺少特定优良亚基而造成的面筋质量差。利用遗传转化技术将编码高分子谷蛋白亚基(HMW - GS) 基因导入小麦，从而改善小麦的烘烤品质性状。Blechl 等在小麦谷蛋白的高分子量亚基（HMW-GS）启动子的调控下，首次把含有麦谷蛋白亚基基因的质粒导入小麦品种，获得可表达的杂种麦谷蛋白亚基 48。Altpeter 等也获得了子粒 HWM 蛋白
17、含量增加的转基因小麦 49。姬生栋等将大豆 DNA 转入豫麦 69，获得了蛋白质含量转基因小麦研究进展及前景5较对照提高 26%的新材料 50。吴丽芳等将两个大豆品种全 DNA 分别导入皖 9210 和扬麦 5 号，获得了子粒蛋白质含量明显高于受体的单株 2 个，分别达 20.46%和 25.35%51。唐凤兰等将控制 HMW 谷蛋白亚基 5 与 10 基因导入小麦栽培品种，获得了导入有 HMW-GS 基因的转基因植株 11。王广金等将麦谷蛋白 HMW-GS1Dx 和 1Dy10 基因导入新克旱9 号，筛选出高产优质的转基因品系 11。张晓东等把优质高分子量麦谷蛋白亚基基因导入小麦品种，获得品
18、质优良的转基因植株 52。施农农等将优质高分子量 1Dx5+1Dy10 亚基基因导入 3 个鄂恩号小麦品种，获得了转基因植株 53。孟超敏将自己构建的高赖氨酸基因导入栽培小麦品种，获得了赖氨酸含量提高 10%以上的小麦株系 4 个 54。尹钧等开展了硫氧还蛋白反义基因的遗传转化，获得了转 Trx-S 基因抗穗发芽的小麦新品系 4。2.4 转抗逆基因的小麦研究美国斯坦福大学把仙人掌基因导入小麦，获得了抗旱耐瘠的转基因小麦新品种 55。刘志生等获得了导入芦苇草 DNA 的抗盐转基因小麦新品系 56。黄承彦等将长穗冰草DNA 导入济南 18，获得抗旱耐盐的转基因小麦新品系 57，郭北海等将山菠菜甜菜
19、碱醛脱氢酶（BADH）基因导入小麦品种，得到 BADH 超量表达的转基因植株 58。Laurie 等将编码钾离子转运蛋白的 HKT1 基因导入小麦，获得耐盐的转基因植株 59。冀俊丽等首创负压花粉管法，并将耐盐基因 HVA1 转入小麦 60。张艳敏等获得了对水分和盐分耐受能力有不同程度提高的转基因小麦后代 61。薛哲勇等将抗盐基因 Na+/K+ 反向转运 AtNHX1 基因导入小麦，并证实外源基因已经整合到小麦的基因组 62。刘录祥等获得了逆境诱导转录因子 DREBIA 转基因小麦 63。 Patnaik 等将大麦的 HVA1 基因转入小麦，获得了水分利用率得到提高的小麦后代 64。奚亚军等利
20、用农杆菌浸根法把叶片衰老抑制基因 PASGA12-IPT 导入西农 1376 和西农 269，获得了导入 PSAG12-IPT 的转基因小麦植株 65。2.5 雄性不育转基因小麦研究杂种优势利用在小麦生产中发挥着重大作用，但传统的雄性不育系是利用自然界中的野生材料通过多代遗传育种选择得到的。采用遗传转化方法创造小麦雄性不育系将为杂种优势利用提供新途径。1997 年 De Block 首先开展转基因技术在小麦雄性不育方面的研究，并利用花药特性异性启动子驱动 Barnase 基因构建雄性不育基因体系66。傅荣昭等 67利用基因枪将人工雄性不育基因 TA29- Barnase 导入小麦栽培品种，经
21、Southern 杂交分析表明该基因已经整合到小麦的基因组中，转化率达 1.8 %。李艳红等利用基因枪将雄性不育基因导入农大 3330 和农大 146，获得转基因小麦植株 68。杨景成等将外源 DNA 导入到普通小麦，获得 1 株雄性不育变异株 69。3 转基因小麦存在的问题尽管转基因小麦的研究今年来进展很快，但与双子叶植物相比，甚至与同为谷物转基因小麦研究进展及前景6的水稻和玉米相比，任然有较大的差距。最明显的差距是，转基因双子叶作物已经有几十个种类的 120 多个品种已经用于生产实践或已经被批准进入大田试验，转基因水稻和玉米有若干品种也已经用于生产实践，而转基因小麦基本上还处在建立和优化转
22、基因体系阶段。造成这种差异的主要原因或小麦转基因方面存在如下的问题。 3.1 转化频率低、受体材料单一化在小麦育种中，通过常规的方法将外源有益基因转育到生产上推广的优良品种中，造成人力物力浪费，且育种年限较长。而小麦转基因技术的研究起步相对较晚，仍处于转基因体系建立阶段，植株再生率低，基因型依赖性很强，这可能是小麦遗传转化研究滞后的关键所在。目前世界上转基因小麦只是集中在少数几个基因型，而这些基因型有的在生产上已经被淘汰或在生产实践中的应用很有限。同时小麦遗传转化基本上以幼胚、盾片、幼穗及其愈伤组织作为转化受体，取材受到季节性限制。成熟胚虽容易获得，但其诱导的愈伤组织分化能力差，再生频率低。基
23、于以上因素，不妨建立小麦丛生芽转化再生系统，这样可以避开组织培养的困难，增加转化植株再生频率。3.2 缺乏理想的表达载体和筛选标记转基因研究中，对表达系统的研究是实验成功的基础。广泛应用于转基因植物中组成型表达外源基因的启动子 CaMV35S 比水稻 Actin1 表达率低十几倍 70。为了增强小麦中基因表达的水平，使用双 35S 启动子序列来增强转化效率。单子叶植物启动子p Emu 是由切割的玉米 Adh1 启动子重新组合形成的，含有多拷贝玉米 Adh1 基因的anaerobic 反应元件，它启动外源基因在转基因小麦中的表达强度比 CaMV35S 至少高10 倍 71。在农杆菌介导转化中，加
24、入内含子后，转移基因只在转化植物组织中表达，在农杆菌中不表达，因内含子被插入报告基因的转录单位中，这样可以排除农杆菌污染带来的阳性反应作用。小麦转基因研究的发展很大程度上受制于选择体系的建立。在以往的研究中，多数以新霉素磷酸转移酶基因(NPT )为选择标记 72，35 。该基因的表型使转化后的植物组织具有很强的卡那霉素内源抗性 72，59 ，而且抗生素抗性基因的存在和组成表达对转化体的选择很难控制，而对植物本身并无益处，因此引起公众的争议和关注。随着研究的不断深入，人们更倾向于使用来自 St reptomyces hygroscopiens 的 bar 基因作为选择标记,该基因编码的 Phos
25、phinothricin acetylt ransferase (PAT)，对除草剂Basta 和 Bialaphos 具有抗性，可以使这些物质失活，在国内外研究中已经得到许多抗除草剂的小麦转基因植株 73，72 。除草剂抗性基因的使用具有一定优越性，可以产生具有农业用途的转基因植物，避免了任何不必要的选择标记基因存在。Zhou 等 73分别以 CP4 、Gox 基因作为选择标记进行小麦遗传转化，以草甘膦(Roundup 的活性成分) 作为选择剂，其基因产物可降解为无毒的物质。但是在向小麦中导入除草剂抗性基因时也应十分小心，以免产生具有除草剂抗性的杂草。所以在小麦遗传转化中高效表达转基因小麦研
26、究进展及前景7载体的构建，应集各部分优势元件为一体，包括在小麦中能高效表达的启动子，有益而可靠目的基因，提高表达效率的内含子，无副作用的选择标记基因或非选择标记的基因如 PMI 基因 71，报告基因如 anthocyanin74等。33 缺乏有重要应用价值的目标基因经十多年的研究，小麦遗传转化取得了很大进展，获得了一批转基因植株。但大多数工作还仅仅局限于转基因基础研究阶段，真正有利于农业生产的重要目的基因转化研究报道很少。因此今后小麦转基因研究工作，除建立高效遗传转化体系外，还应致力于获得可靠的有知识产权的目的基因，如改善品质的调控淀粉含量的基因、种子胚乳蛋白基因(高分子量谷蛋白亚基基因，HM
27、W - GS)、抗病虫、雄性不育的诱导基因、恢复育性以产生杂种种子的相关基因等。分子改良最大限制因素可能是有农业利用价值的重要基因的分离，所以鉴别、分离、克隆有益重要基因非常关键。34 转基因小麦的抗病虫能力的丧失因为抗病虫的变异是生物本身具有的生存能力，许多报道 44，46 指出抗病虫植株的抗性能力会逐渐下降，所以育种学家只有不断地培育新的抗性品种来抵抗病虫的适应性变异。为了克服这一缺点，应对同一品种导入多个抗性基因，或进行抗性品种轮换种植，以避免抗性基因的单一化。35 转基因沉默现象真正意义上的转化包括外源基因的导入、整合与稳定表达。但若想得到稳定整合表达的植株并不容易，原因很多：可能由于
28、外源基因导入后缺乏整合过程；或是发生了整合但不稳定，随细胞分裂、世代交替而使整合片段趋于消失；也可能是整合位点不适合外源基因的表达；还有可能受到真核基因组的一些修饰后，降低或失去了表达活性。外源基因受到的修饰之一就是真核基因组对原核起源的 DNA 片段的甲基化修饰，这是一个比较复杂的问题，甲基化可以发生在植物生长发育的任何阶段 75。况且小麦为六倍体植物，基因组大而复杂，所以在进行遗传转化时，更要注意去甲基化和表达调控研究，避免基因沉默现象的发生。4 转基因小麦的前景作物转基因育种和常规育种相比具有明显的发展优势，因为它不仅极大地拓宽了育种的基因来源（如动物、植物、微生物和人工合成） ，而且可
29、以实现高效精确的遗传改良，更为重要的是抗病虫等转基因育种的发展将有效减轻农田的环境污染。由于可用于小麦转基因育种的功能基因，特别是控制小麦重要性状的功能基因还非常有限，这是限制小麦转基因育种发展的主要因素。比如抗虫转基因育种中，目前可以利用的主要是 Bt 基因、蛋白酶抑制剂基因和外源凝集素基因等非常有限的几种；改善品质的基因目前仍主要局限于高分子量谷蛋白亚基基因等有限的范围内等。所以，未来关于小麦功能基因的深入研究和开发将仍是研究的重点，特别是那些与高产、优转基因小麦研究进展及前景8质、抗逆性、株型、高光效密切相关的基因将是研究的热点。小麦是中国的重要粮食作物之一，其转基因研究无疑有非常重要的
30、意义。随着人口和耕地矛盾的日益突出，粮食安全形势更加严峻，同时，水资源短缺、土壤和环境污染以及病虫草害加剧使得创育集高产、抗病虫、水肥高效利用于一体的小麦新品种已是当务之急，转基因技术为利用丰富多样的基因库进行小麦遗传改良开辟了一条有效途径。随着新的有益基因和切接酶的不断发现、小麦遗传转化技术和转化体系日臻完善，转基因小麦安全评估体系地进一步科学和客观，以及更多国家政府和广大民众对转基因小麦认识的转变。不久的将来，集高产、优质、高效、多抗等特性于一体的小麦新品种将培育成功并应用于大田生产。转基因小麦研究进展及前景9参考文献：, 而来进展很快, 但与1 Anderson O D,Blechl A
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