1、第 六 章 分子生物学基本研究法 （下）基因功能研究技术,6. 1 基因表达研究技术 6. 1. 1 转录组学研究转录组 (transcriptome)，广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA (non-coding RNA或siRNA)。现常指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。,基因组转录组蛋白质组（genometranscriptomeproteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终
2、蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。,传统的转录组研究方法主要包括：表达序列标签（expressed sequence tag，EST）测序技术，基因表达系列分析技术（serial analysis of expression，SAGE）和基因芯片技术。EST测序数据是目前数量最多，涉及物种最广的转录组数据，但测序读长较短（每个转录本测定400bp500bp），测序通量小，测序成本较高，而且无法通过测序同时得到基因表达丰度的信息。,SAGE测序法：将不同转录本3端第一个CATG位点下游14 bp长的短标签序列来标识相应的转录本。由于标签序列较短，可以将多个标签串联测序，使SAGE法相
3、对于EST测序在通量上大大提高。但过短的序列标签使得序列唯一性降低，即使改进过的LongSAGE用21 bp标签测序，仍然有约一半的标签无法被准确注释到基因组上。,高通量测序技术(high-throughput sequencing)，又名二代测序（second-generation sequencing）或深度测序(deep sequencing)，可以一次性测序几十万甚至几百万条，是传统测序技术的革命。 利用高通量测序技术对转录组进行测序分析被称为RNA-Seq，对测序得到的大量原始读长（reads）进行过滤、组装以及后续的生物信息学分析。,表 6-1 454和Illumina高通量测序平
4、台比较,454 Illumina 测序原理示意图,454系统采用焦磷酸测序(pyro-sequencing)：按T、A、C、G顺序加入单个dNTP与模板配对，释放一分子焦磷酸(PPi)，在ATP硫酸化酶作用下PPi和腺苷酰硫酸（adenosine-5-phosphosulfate, APS）结合形成ATP，在萤光素酶的催化下产生可见光。454则由于缺少终止反应的元件，相同碱基的连续掺入常会带来“插入缺失”类型的测序错误。,Illumina测序系统采用萤光标记dNTP，其3羟基末端可被化学切割，每个循环反应只允许掺入一个碱基，由激光扫描反应板表面，读出这一轮反应新加的萤光信号，从而判定碱基种类。
5、之后，经过化学切割恢复3端粘性，进行下一轮聚合反应。 随着Illumina的测序反应的进行，已有萤光信号会使新的萤光难以准确分辨，因此该方法的测序读长较短，测序错误主要是碱基替换。,6. 1. 2 RNA的选择性剪接RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。包括：平衡剪接、5选择性剪接、3选择性剪接、外显子遗漏型剪接及相互排斥性剪接。,图6-2 选择性剪切的不同类型,图6-3 RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切,图6-4 果蝇（Drosophila melanogaster）的Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多种
6、可能的mRNA异构体,6. 1. 3 原位杂交技术 原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。,RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。用mRNA的互补链为探针进行杂交。 负对照，mRNA的同义链, 无杂交信号。,荧光原位杂交(fluo
7、rescence in situ hybridization，FISH). 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。,人肌肉糖原磷酸酶基因在11号染色体上的FISH原位杂交结果。,6. 1. 4 基因定点突变(site-directed mutagenesis).通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。,图6-6 寡核苷酸
8、介导的DNA突变技术,目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。,重叠延伸诱变法示意图,图6-8 大引物诱变法示意图,6. 2 基因敲除技术 6. 2. 1 基本原理经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。,基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的
9、片段共同稳定遗传等特点。,基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。,图6-11 用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验,图6-12 正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞,正向选择基因neo通常被插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。负向选择基因HSV-tk则被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。如果细胞中发生了随机重组，负向选择基因就可能被整合到
10、基因组中，导致细胞死亡。,噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种条件型定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。,图6-13 条件型基因敲除策略,6. 2. 2 高等动物基因敲除技术 真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。,图6-14 模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。,显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率
11、比显微注射低，操作使用方便。胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。,图6-17基因捕获法原理 A、未插入基因捕获载体前，需要被敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白质,未知；B、插入基因捕获载体后，靶位点基因转录翻译出带有GUS蛋白区段的融合蛋白，可用组化方法检测。,6. 2. 3 植物基因敲除技术T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。,a.引物设计。LP和RP分别代表插入基
12、因两端的引物，LB是指载体上的引物，目的基因片段900bp。b，PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。,图6-18 植物基因敲除及突变体筛选,6. 3 蛋白质及DNA相互作用技术 6. 3. 1 酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。,真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（bin
13、ding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。,将顺式作用元件与最基本启动子（minimal promoter，Pmin）相连并将报告基因连到Pmin下游，将待测转录因子cDNA与酵母转录激活结构域（transcription-activating domain, AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就激活Pmin启动子，报告基因表达。,图6-19 酵母单杂交的基本原
14、理示意图,图6-20 从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。,6. 3. 2 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）,图6-21 酵母双杂交技术原理示意图,6. 3. 3 体外蛋白质相互作用技术 1、等离子表面共振技术 诱饵蛋白结合于固定在纳米厚度的金属膜上的葡聚糖表面，当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用（图6-22）。,图6-22 离子表面共振技术示意图,2、免疫共沉淀技
15、术(Co-IP) 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，加入可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。,图6-24 免疫共沉淀示意图,3、GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。,图6-27 GST融合蛋白沉降技术流程。,4、 细胞内蛋白质相互作用研究荧光共振能量转 移法（FRET） （1）给体与受体在合适的距离（110 nm）； （2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有重叠（能 量匹配的条件）； （3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（偶极-
16、 偶极耦合作用的条件）。,FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有部分重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。常用的探针有三种：荧光蛋白，传统有机染料和镧系染料。荧光蛋白是一类能发射荧光的天然蛋白或突变体， 主要有绿色（GFP），蓝色（BFP），青色（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。,图6-29荧光共振能量转移法示意图,6. 3. 4 染色质免疫共沉淀（ChIP: Chromatin Immuno Precipitation） 主要实验流程：在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并通过超声或酶处
17、理将其随机切断为一定长度的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应，沉淀该复合体，富集与目的蛋白相结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，获得该蛋白质与DNA相互作用的信息，包括具体的DNA序列特征，位置，结合时间、亲和程度，对基因表达的影响力等。,ChIP不仅可以检测体内转录因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。 定性或定量检测体内转录因子与DNA的动态作用。,6. 3. 5 RNAi（RNA interference, RNA干涉）技术及其应用RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因
18、缺失的表型。RNAi的命名来源于安德鲁法尔。,RNAi作用机制示意图,双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（ssRNA, single-stranded RNA）的降解。 经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成2125个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目标mRNA。,由siRNA中的反义链参与指导合成被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干
19、扰靶基因表达的功能。,6. 4 基因芯片及数据分析基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列（DNA microarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。,6-25 基因芯片技术流程图,基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，确定哪些基因的表达受抑制或激活。,通过两次平行杂交反应，将每个基因的表达水平做成对应散点图，只要绝大多数基因的杂交结果都在45度斜线附近，就说明实验结果是可靠的 。,6. 5 其它分子生物学技术 1、
20、凝胶滞缓实验 凝胶滞缓试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。,在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。,2、 噬菌体展示技术 噬菌体（Bacteriophage）是细菌病毒的总称，源于希腊文“phagos”，意为“吞噬”。噬菌体可在脱离宿主细胞的状态下保
21、持自己的生命，但一旦脱离了宿主细胞，它们就既不能生长也不能复制，因为它们几乎只能利用宿主核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。,噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体。 溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。具有溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。,噬菌体展示技术是将基因表达产物与亲和选择相结合的技术，将编码“诱饵”蛋白（你研究中所发现的任何感兴趣的蛋白质）的DNA
22、片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。该重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，可直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质 。,3、 蛋白质磷酸化分析技术 蛋白激酶催化ATP或GTP的磷酸基团转移到底物蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上，促使底物蛋白发生磷酸化，而蛋白质磷酸酯酶则能催化底物蛋白发生去磷酸化。此外，底物蛋白的组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸残基上也能发生可逆磷酸化。,图6-44 蛋白激酶体外磷酸化活性分析。 泳道1、4和5中的蛋白质具有使蛋白质磷酸化的激酶活性，泳道2、3和6中的蛋白质不能使MBP (my
23、elin basic protein) 磷酸化。,4蛋白质免疫印迹实验（Western blotting）。 是在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定基础上发展起来的一种技术，为检测样品中是否存在蛋白抗原提供了一种可靠的方法。其基本原理是被测蛋白只能与标记的特异性抗体相结合，而这种结合不改变该蛋白在凝胶电泳中的相对分子质量，被用于测定抗原的相对丰度或与其它已知抗原的关系，也是评价新抗体特异性的一种好方法。,图6-46 免疫印迹（Western Blotting）示意图,是检测样品中是否存在蛋白抗原的一种可靠方法。主要步骤： a、蛋白样品的制备； b、SDS-PAGE分离; c、转膜并封闭膜上未反应位点
24、，减少非特异性吸附； d、与相应非标记抗体（一抗）反应； e、洗去多余一抗，加酶促偶联或放射性同位素标记的二抗，显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。,5、抗体制备 由生物有机体的浆细胞合成并分泌的能与抗原分子特异性结合的一组免疫球蛋白被定义为抗体。,由于抗原分子通常是由多个抗原决定簇组成的，由单一抗原决定簇刺激，由一个B淋巴细胞克隆接受该抗原所产生的抗体就被称为单克隆抗体（monoclonal antibody）。由多种抗原决定簇产生的一组含有针对各个抗原决定簇的混合抗体，就被称为多克隆抗体（polyclonal antibody）。,6、 细胞定位及染色技术 蛋白质在组织及细胞内的亚定位
25、，一直是细胞生物学和分子生物学研究的核心问题，因为了解特定蛋白质的定位，才有可能了解其生物学功能。研究细胞定位可采取多种方法，最常用的是荧光蛋白标记和免疫荧光法。,最常用的可能是绿色荧光蛋白（GFP），它由238个氨基酸组成，有两个吸收峰，最大吸收峰在395 nm，另外一个在475 nm，前者由紫外光激发，后者由蓝光激发。发射光也有两个峰值，分别是509 nm和540 nm；呈绿色或黄绿色荧光。,实验中，将绿色荧光蛋白的编码序列与目的基因启动子融合形成嵌合基因，转染植物或动物细胞，由于融合基因与目的基因的表达模式相同（使用相同的表达调控元件），通过荧光显微镜观察GFP在组织或亚细胞中的分布就相应确定了目的蛋白在细胞中的定位。,图6-48野生型拟南芥中WOX5pro: GFP融合基因的表达。,免疫荧光技术是将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内定位的方法。用针对特异蛋白抗原的荧光标记抗体作为分子探针检测细胞或组织内的相应抗原，由于所形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，确定荧光所在细胞或组织，从而对抗原蛋白进行定位。,The End of Chapter 6,
