1、大鼠颌突外胚间充质细胞向骨骼肌细胞诱导分化和三维培养观察牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2006,16(6)?307?大鼠颌突外胚间充质细胞向骨骼肌细胞诱导分化和三维培养观察姚远,聂鑫,金岩,(1.市口腔医院,广东珠海 519000;2.第四军医大学口腔医学院组织病理教研室 ,陕西西安 710032;3.第四军医大学组织工程研发中心,陕西西安 710032)摘要目的:探讨体外诱导外胚间充质细胞向骨骼肌细胞分化的潜能,利用分化细胞构建组织工程骨骼肌模型.方法:取妊娠 l0.5d 胎鼠颌突外胚间充质细胞,纯化后分别在含1,5,l0mL/L 体积浓度二甲基亚砜的 DMEM/F
2、,培养基中培养.相差显微镜下观察细胞的形态变化,成肌相关因子免疫组化鉴定细胞性质,将诱导后的细胞种植于胶原膜,并于培养 3,6d 后用光镜,扫描电镜观察细胞的生长情况.结果:培养 3d 后,外胚间充质细胞形态出现成肌样细胞变化,细胞变得大而扁平,培养 5d 后细胞出现管样结构.免疫组化鉴定显示:添Jn-甲基亚砜后,大部分细胞出现成肌相关因子的表达,其中 5mI/L 实验组效果最好,约 75%的细胞转化为骨骼肌细胞.对照细胞形态未见明显改变,免疫组化鉴定未能诱导分化出骨骼肌细胞.种植于 BAM 膜后,细胞生长良好,并可形成复层结构.结论:二甲基亚砜可诱导外胚间充质细胞向骨骼肌细胞分化 ,最佳浓度
3、为 5mL/L;在 BAM 膜上分化细胞生长状态良好,说明该生物可降解膜是构建组织工程骨骼肌的适合材料.关键词 外胚间充质细胞 ;骨骼肌细胞;组织工程;二甲基亚砜中图分类号R780.2文献标识码A 文章编号10052593(2006)06030704牙体牙髓牙周病学杂志,2006,16(6):307DifferentiationofectomesenchymalcellsoffetalratmandibularprocesstoskeletonmusclecellsbyDMSOandobservedinthree.dimensionconditionYAOYuan,NIEXin,JINYan(
4、ZhuhaiOralHospital,Zhuhai519000,China)AbstractAIM:Toinvestigatetheabilityofdimethylsulphoxide(DMSO)oninducingtheectomesenchymalcellstoskeletonmusclecellsandusingthesecelltoconstructthethreedimensionmode1.METHODS:DifferentconcentrationsofDMSOwereaddedtothethirdpassagesofectomesenchymalcells.Themorpho
5、logyWasobservedbyphasecontrastmicroscopy.ImmunohistochemistryWasusedtoidentifythecharacteristicsofcells.ThethreedimensionmodelWasconstructedwithcollagen.RESULTS:ThereweregreatchangesinthemorphologyofthecellstreatedbyDMSO.Thecellschangedfromfibroblastliketobigandflat.Afterculturefor5days,appearedtube
6、structure.AftertreatedwithDMSO,thesampleswerestudiedbyimmunohistochemistry.About75%cellsinthe5ml/Lexperimentalgroupbeganexpressionmusclerelativefactorswhichmeansthesecelltransformintoskeletontype.DifferentiatedcellsimplantedintoBAMmembranecouldformmuhilayerstructure.CONCLUSION:Theectomesenchymalcell
7、scouldbedifferentiatedtoskeletonmusclecellsbyDMSO,andthecollagenmembraneweretheidealmaterialsinconstructionoftissueengineeringskeletonmuscle.Keywordsectomesenchymalcell;skeletonmusclecell;tissueengineering;DMSOChineseJournalofConservativeDentistry,2006,16(6):307收稿日期:2006 一 o43O;修回日期:2006-0516基金项目:珠海
8、市科技计划项目(珠科 200237 号)作者简介:姚远(1963 一), 男 ,汉族,浙江人.本科,副主任医师通讯作者:金岩,神经嵴是哺乳动物胚胎发育早期的瞬时性结构,神经嵴细胞在胚胎发育的特定时期可向不同部位迁移,随后在不同的组织出现分化,称为外胚间1 憾 q*jChh:Jf.nIlit)2:X)6I(j宄质 I 胞【lHi(111l?iiihymdH*,:)H 前帕研究-I 经it!实:II 腔部组织特有的心砷纾嵴细胞.1_I 甜化为冲经无和 HJ 经脞匝细胞.啦色素封胞,讣甜皆妤泌细玎乜软骨细胞或附 JJLi 胞等 .r 一是诈条件制.刊仆 JPi.i,7允 1 最驯胞诱肆舒化的研究 j
9、_鼋少啦删究 f1.HI 二坫亚 6 垃功导外慨i 宽质 fllIH 乜什化妇目怖Efill胞.f 刊川维埔非挑水构建 J 惴小 L 型山 li川讣胚州屯质 I 细胞修复目织缺删究摊供 r 理沱考号材料和方法II 材料I】M.M(骶糖)I,培捧胎十I_f 【rl)lIIILqAdl1J 九 II 峨 J!c 纤维钏胞 k 千fI?兀:)III 衄 471化榆删酞制蠢(IIkf】.足);成 JLILIj 蔑川 J,-l1flJLflllIJ戚誊,ipiii,【蜥生 I!lil-坡r【球豢 ll】l_,I,iil 抗(十德);JM 琦苹 JLI 大学组织擞 l【_制吾的牛真心【lJ 卅睫腰脱l2
10、方法I!IKM 的培乖采川进赶的卟 J1fhj 觅厩删也廿离硬体外增扯水 JjLif 成 1.驰毕 I2dsI1fIR.,闸籍什,啦 mjJILrlk淮巾剥离鼠体视艟仔离 m 腑的 l 下突.障约 IIll1%l大小的纵块25#I 帧酶消化 10cii.将细盱世液世 7sm 胞筛.离心就海 J】I)MM/I 培荐牲培捧 30mhi.更换埔捧油土脒圳恺,n 培养澉巾 J 川I【】i-IuF 嚏l(.-lj,n,以 t 讣 Jl 觅质卸 I 姐晌舒化越隔 2tI 拽澉坪倚删_地肜化传 3代衔 Jt1l!l:Ms 向骨特肌如咆的跨导分化乍 K 外们 3 代外 ILT】觅厩钏 ,2Ixxl】靠蜚 l1
11、 嘶 fJf 匕 l 讴新接种,I) KM/I?培养浓_l_人岔 1,5I【) 】I 体积冰噬的 .坫帆.隔 tJ 搀液 I 救缚扑 I 置显馓镜帆寮细胞的;【l1 侈志竖化埘l 毪封上求添 nf_lf 持续诱 5,1ul_供饱癌-Hl 技一种 ft!tI.13 兄疆蛆化拯删将游 5.10rl 的胞ili 化杆种十 5 帐破H.改 li 将,匠 J 地 11【】 细地用多聚雌定10mit1.Ill/片 I 精土陈氧化物黼.JJII八成 IULFI 关闭l】.【川胞.脱素“iLin 肌凝蛋 F1nty,in 皿肌球紊 It1)-xhhiilI.机 41 孵疗傲,JJ八抗 37I4 阶肯 r.il
12、I_B 丝物孵行30min.八.鲺联壮噱 fIII)包 25li燕 f】;水终 t 反啦,苏木隶复一 .-帷王 J剐咆浆 r1 吖 】棕黄色托的细胞隹细胞l24 组织工程骨骼肌的拘连盟观将鹕 23 代 Msc 姒 II【rt 细咆/ri71 的晰度接到 lAM 的厦 IfiI 被八培养咔-.17t 杀件下培养珥 2?J 更换 I 暾培捧将济肆HE外 0hj 允厨 JJ,fir1 汜后,刊- 仙丁有定窀淬的 BAM 脞)t 镜观察 fill;融呐 EKlR 眦墒芥 5tl_组织 I 崔 H 前,【片行为份.一附HJ 观察细Jn膜 l.的 i 瞍 Jf抛.将啦H多糍 EFI 嘲定,IIh1 包,|
13、 0 壮匿 Ul,中樽腔封:另份川川捕【蟪观臻细 l 地叭 Ml 的贴煺 l 地 1 垃变化牛乎 J 片 JIl 洗涤5IiI,/I 戊前峨缓冲液定.榔艘眦酣瞅戊晡换 I 而 垛.髓胯舰寮州2 结果21M 细胞及分化后的生长形态LI 柳 I,I?f,I培养澉 iqKlI!J 卟 IFf以钏 J 飚 n 有 l 胞 n 一 H.1f 杠 1 小.州刮勾旋涡状,.僚憎.柯!一 4t 挺起.胞伴满.性,浆比人 f1 年 II 埔柞 31.711j 胞 1l 戚肌细胞的t 仔 fE.列 J 或俊 IF-.此叫帅细眦滑动l!椭嗣 J.f=二卸 f 魁 li 血川 J世的 J 氆变Il 卅 2)培芥 5I
14、.扪胞拉近铺满 “婿 f_管排 llm 锻,圳艳 l 铷魍之 1.fI1 融即 J 越管圳胞此时胞内有数敬 I1胞性象串殊样排州?l 地_L1 电i 肄帕仆问充脏细胞 K 各 I(I11.Io悼 q 舶J学帛 cI:hiI1lf 圳 rvIIiiI26Ic2雎 J 矗 J 眦壤导培捧打 jc1世雌意赴似【崛.呲观舟 I 胃 1 饨20)22 免疫组化检测结果卦胞皑崆化坫粜,卜:tJI=采 I 秀均外问鹰细 f【 世抗l,槊也 m,抗 myiu_J_ln讹巴山处哩 5j 肟,小旧寓啦川胤-,-T1 硬 nl_】的,v尢 l 州 10 一 JJi,I510ml/I 址婀精出.!I.-的丧选州绌艋
15、,不- 址 0 组帆匈转求圈-州 l】州mv-,III 表达.JI5lr 处州 0 纠表述最商约 75/cJiYitl 盯世乜川 JjI1R】3 叫 mI 屯田圳恒瞬叶 lu 约 75%细胞包|】|-川是迅记难比 x!矗 I 舒化川克艟I 胞龟疫蚍他螺建站 f 串)Jt,l 帆 itI)枉_ln 毫2M 膊负载 lM 细胞的观察蕊导 1,15C接种十 II,kM 啦_.很恍出蛐贴附,L 托,1 胞活“ 折光 ri=强 .3 一 IJ 情锄合成单_l_l 二 5tj 后 HE 包见 M 绌咆枉BA硅质多方向生 l胞体较大.胞.幢嘭,形态较敢 fI4)描 I 镜下 .EMSCtEBA的 I 匾生
16、K 良好.排刮较饼舒域现复瞄生长咆体u 太呈=_= 衄刚岫 K 多迎平状突艇丰富 ,分突 =1 瓦生接受纵成同.1,圳地疗绷胞边缘见面盎州黎胞惟形成突起半同附于 BA堆质 Jl514nqil.11 开融 nM 帕幔筝K,细胞均一恻竹髓 4罔 541jqir,J 凫临 If 胞 MM 帕辑质牛 K 良,排州鞋密j蚍牛 1c,M3 讨论胎头:形成世程?_I_冲经营 r 副台之.神经嵴的细胞 J-r 向而部的中胚逊仃广泛地 j 工髂,Ii;成外胚闸允匝细胞可以世一步 l【戍牙啦质细胞牙龃卸 f 眦,成钳删,肌绷胞,冲髭元等多十瞎系世行分化.造为组织工腔研圮提供 r 新的种子细咆来 q1 撼蛆砒址茸附
17、儿细眦分化成熟的矬活导弃 lJ 我 J 绽现添 f.II培养 Irl9 细脏j丰州骨髂肌细胞 H0 形盎比 .1 地明细胞 l 术出现舒化现蒙而添一甲琏砸 m 细胞开始响骨状排州 m 象.细胞胞之互川融,形成【骨细胞 nr 等世址实二壤,【E 佩 Jn 秀坤胚胎十细胞甘瞄【扪胞分化.什出现成肌垂 Ij 的表达.违与代_J 的实骑申 H 似实验实:什为骨船肌的秃导剥.娃住 f 奉祝洙应勾 5ml/i.J 浓理蚌小能随分化效率提岛.山 JI)MSI 的毒性.反而使绌8 蜉殖建唐蜓缓牙体牙髓牙周病学杂志(ChinJConservDent)2006,16(6)肌肉转录因子家族包括 MyoD,myoge
18、nin,Myf一4,Myf 一 5 等成员 j.无论在胚胎发育期还是在肌肉损伤后,对肌肉的形成和再生均起着至关重要的作用.为此,本实验利用这些因子作为向骨骼肌细胞分化成熟的特异性指标.本实验结果证实:在正常条件下,外胚间充质细胞表达肌球蛋白,而无肌肉转录因子的表达.这是因为颅神经嵴细胞迁移到颌面部后,具有了部分中胚层的特性,可向平滑肌样细胞自然分化,因此表达肌球蛋白.本实验还证实:外胚间充质细胞在持续培养的条件下,有向骨骼肌分化的潜能,当加入诱导剂后,细胞形态即向成肌细胞形态变化,出现肌肉转录因子的表达.这是因为在调控骨骼肌的分化及成熟方面,肌肉转录因子(MRFs) 家族起着重要作用 ,myo
19、genin 在分化中的和成熟的肌细胞表达,能够刺激鼠单核肌母细胞分化形成多核肌管.MyoD 及 myogenin 缺陷时可出现骨骼肌发育不良.这些结果都说明外胚间充质细胞开始向骨骼肌细胞分化.目前,在组织工程中用作细胞支架的生物材料主要是一些天然高分子,天然无机物和合成高分子.天然高分子及天然无机物一般都具有无毒,亲水性,生物相容性及细胞亲和性好的特点.合成高分子的生物相容性及细胞亲和性一般不如天然高分子.因此,本研究选用 BAM 作组织工程骨骼肌的生物支架材料.结果显示:细胞在支架材料上有明显的增殖,可牢固地贴附于材料表面,局部区域有复层生长的趋势,与以往用于组织工程骨骼肌的材料相比,有明显
20、的优越性.这是因为 BAM 是一自制双头双角度根管充填器池庆田(莱钢特钢医院,山东莱芜 271105)手持根管充填器是临床常用的一种器械,成品因只有一头一种角度,在磨牙根管充填中,有时因位置和角度的原因,操作较困难.针对这一原因,作者用不锈钢探针自制双头双角度根管充填器,效果良好,现报告如下.首先把不锈钢探针两端矫直.一端从尖部开始 25mm种天然高分子生物材料,是由胞外基质成分组成,含胶原,糖蛋白,蛋白多糖,透明质酸等多种成分,能为细胞的增殖,分化提供丰富的营养成分,有利于细胞的生长繁殖.本实验通过使外胚间充质细胞定向分化为骨骼肌细胞,最后将其与生物支架材料复合,可为肌肉组织工程的研究开辟新
21、的思路.参考文献:1张光东,金岩 ,史俊南,等.sD 大鼠面突未分化外胚间充质细胞的体外培养J.临床口腔医学杂右,2003,19(2):9O一922邓蔓菁,金岩 ,史俊南,等.酶消化法培养 Balb/c 胎鼠下颌突未分化外胚间充质细胞J.牙牙髓牙周病学杂志,2002,12(8):403406吕红兵,L,金岩,等? 小鼠颅神经嵴细胞的培养和特征J. 牙牙髓牙周病学杂右,2002,12(4):1881904EdwardsM,HarrisJF,McBurneyMW.InducedmuscledifferentiationinanembryonalcarcinomacelllineJ.MolCellB
22、iol,1983,3(12):228022865DraperJS,PigottC,ThomsonJA,eta/.Surfaceantigensofhumanembryonicstemcells:changesupondiffenfimionincultureJ.JAnat,2002,200(1):2492586秦瑞峰,顾晓明 .生肌调节因子在肌肉发生和发育中的作用J.口腔领面外科杂志,2001,11(3):2562597DinsmoreJ,RatliffJ,DeaconT,eta1.Embryonicstemcellsdif-ferentiatedinvitroasanovelsourceof
23、cellsfortransplantationJ.CellTransplant,1996,5(2):131438邓蔓菁,金岩 ,史俊南,等.TGF,rhBMP 一 2 体外诱导 Balb/c胎鼠下颌突外胚间充质细胞向平滑肌细胞分化J.牙牙髓牙周病学杂志.2002.12t1o,:584587处折成 9O.,再向后 10mm,反折成 135;另一端从 15mm 处折成 90.,再向后 10mm 处反折成 165.然后,用低速打磨机把两头均匀打磨成直径为 0.250.4mm 的锥型,抛光,消毒备用(图 1).双头双角度糊剂输送器在临床的实际应用中,操作方便灵活,比较适合磨牙根管充填,且材料易取,制作简单,效果明显,可在临床上试用.图 1 自制双头双角度根管充填器(收稿日期:20060207)
