1、蛋白电泳在肾脏疾病中的临床应用,主讲人：乔玉龙 2014年7月21日,北京康圣安科技发展有限公司,1,第一部分-为什么要做尿蛋白电泳？ 第二部分-多发性骨髓瘤肾脏损伤? 第三部分-能诊断哪些肾脏疾病? 第四部分-临床符合率怎样？如何看电泳结果？,2,内容提纲,肾脏病基本诊断思路,第一步：是不是肾脏病？ 第二步：是肾小球疾病,还是肾小管疾病？有条件的要确定病理类型 第三步：是哪种综合征？ 第四步：是何种原发性疾病，肾功能是否正常？,第一步：如何判断是不是肾脏病 ？,1.血尿、水肿、腰痛、多尿、尿频等是肾脏疾病常见的症状。但上述症状并不能说明肾脏有病。 2.以上临床症状+尿常规异常（蛋白尿、血尿、
2、管型尿,白细胞尿) 3.以上临床症状+肾功能异常。以上2、3中任何一项才能考虑为肾脏病。,肾小球疾病,原发性肾小球疾病 1.急性肾炎 2.慢性肾炎 3.IgA肾病 继发性肾小球疾病 1.肾病综合症 2.糖尿病肾病 3.狼仓性肾炎 4.肾小球沉积病 1）淀粉样变性 2）轻链沉积病 3) 巨球蛋白血症 4）冷球蛋白血症 肿瘤相关性肾小球疾病,间质性肾炎-TIN,原发性间质性肾炎： 肾脏损伤主要位于肾小管和间质，无明显的肾小球和肾血管系统病变 继发性间质性肾炎： 肾小球和和肾血管系统疾病引起的小管和间质损伤 TIN是引起肾功能衰竭的重要疾病 临床表现： 急性TIN：表现为少尿性或非少尿性急性肾损伤，
3、通常肾小管会损伤。 特发性急性TIN：多见于青年女性，临床表现为疲乏，发热，肌肉疼痛或眼部葡萄炎等。伴有肾小管损伤征象。实验室检查可有贫血，嗜酸细胞增多，血沉快，CRP及Y球蛋白升高。,早期肾病诊断大多依靠尿蛋白含量做出大概的分类. 随着肾小球基底膜损害不断加重,尿中排泄的蛋白量不断增加,然而终末期肾衰患者肾小球多数已毁坏,尿量反而减少,说明尿蛋白含量的多少不一定能完全反映肾脏损伤的程度. 实验发现尿蛋白含量与肾脏损伤程度并不呈正比. 常规尿蛋白定量严重低估了肾脏损伤的程度,并且无法明确鉴别肾脏损伤部位. 尿蛋白电泳作为肾脏疾病的早期诊断方法越来越受到重视.其有助于确定尿蛋白来源,对尿蛋白组分
4、进行精确分析,有助于疾病的诊断和预后的判断,为临床提供极有价值的证据.,蛋白尿,9,10-40%的MM确诊时 已出现肾损害 25%-50%的MM在病程中出现程度不同的肾功能异常 肾损害类型 管型肾病-骨髓瘤肾病（CN）-最常见（肾小管损害） 淀粉样变性 免疫球蛋白沉积病（MIDD）,骨髓瘤肾脏损害,10,肾脏疾病的病因机制,肾功能衰竭,穿刺部位,肾穿禁忌症,出凝血异常 孤立肾 一般情况差 小肾 其他 过度肥胖、重度腹水、配合欠佳,合并症及其处理,出血 大出血 血肿 血尿 感染 动静瘘 上海新华医院 中华医学会检验学会副主席-沈霞教授 总结: 肾活检虽然对肾脏疾病的病理及免疫分型具有很高的诊断性
5、,但由于肾穿刺属于创伤性诊断技术,可能造成出血,感染等并发症,而且穿刺技术及取材部位也会影响穿刺的成败,因此患者对此顾虑较大.,合并症及其处理,出血 大出血 血肿 血尿 感染 动静瘘 上海新华医院 中华医学会检验学会副主席-沈霞教授 总结: 肾活检虽然对肾脏疾病的病理及免疫分型具有很高的诊断性,但由于肾穿刺属于创伤性诊断技术,可能造成出血,感染等并发症,而且穿刺技术及取材部位也会影响穿刺的成败,因此患者对此顾虑较大.,解放军总医院-肾内科-陈香美院士,迄今为止，各类肾病的临床诊断与病情的进展判断主要依赖于肾活检，其次为尿蛋白，血液生化等检测指标。 肾活检的创伤性使其难以随时施行，而临床的血液生
6、化指标又难以早期，全面地反映疾病的病理改变。 因此，国外及国内多数专家学者，试图通过蛋白组学研究方法找到与肾脏疾病相关的特殊蛋白质标志物，以用于早期诊断与疗效的随访观察。 蛋白电泳是尿液蛋白质组学研究中分离和鉴定的常用方法。摘自:单位：北京解放军301医院-肾内科-陈香美院士,17,肾小球损伤的-尿蛋白谱,肾小球性肾炎 病理因素(感染) 糖尿病肾病 自身免疫性疾病 肿瘤,与肾小球蛋白尿相关的疾病,北京康圣安科技发展有限公司,18,19,20,肾盂肾炎 肾血管性疾病 遗传病:范科尼综合症 肾毒性物质:重金属(铅,钙) 药物性肾病:抗癌药,庆大霉素等,与肾小管蛋白尿相关的疾病,北京康圣安科技发展有
7、限公司,21,22,23,a2-巨球蛋白 (900 kDa),SDS,SDS,+,-,分子筛,原理：分子量排列,SDS：十二烷基磺酸钠,25,SDS 尿蛋白 图谱,电泳技术由于操作方便, 成本低廉, 目前已成为许多实验室进行体液(血清, 尿液, 脑脊液)分离、分析的常规方法之一蛋白电泳是一项用途广泛的检测技术, 可用于多种疾病的检测 (肝硬化, 肾病综合症, 多发性硬化症, 血红蛋白病, 单克隆免疫球蛋白疾病）目前, 尚没有一种方法可以取代电泳技术用于检测多发性骨髓瘤中出现的单克隆免疫球蛋白(M蛋白) 电泳结果中对电泳图谱的分析很重要，是唯一具有病理诊断价值的检验项目。,第二部分. 为什么会误
8、诊与漏诊？如何避免？,2.多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma MM),河北省第三人民医院 1557例多发性骨髓瘤误诊分析,吕鸿雁, 张金巧. 河北医药. 2009, 31(9): 1052-54,误诊率：65.17%,重视实验诊断,39.8%,15.6%,19.8%,7.6%,15.6%,就诊晚2/3 确诊时已达中晚期误诊率高1/3 非血液科首诊60%,多发性骨髓瘤诊治现状,晚 骨折 预后差 增加负担 感染发生率高 肾脏病变不可逆,死亡率 ,华西医院对-多发性骨髓瘤的误诊原因分析,MM缺乏特异性,首发症状多种多样。骨痛常为早期症状,骨质疏松或骨质破坏后,极易造成病理性骨折,误诊为骨
9、科疾病发现尿蛋白或尿素氮升高,而被误诊为肾脏疾病因面色苍白、乏力、纳差、头晕等贫血症状常被误诊为贫血;,诊治现状分析：北大人民医院 - 血液病研究所 -黄晓军（全国主任委员）,诊断及预后评估体系欠广泛应用是影响MM规范化治疗的原因之一。规范化治疗源于正确的诊断。MM的诊断必须进行血和尿的免疫固定电泳以及24小时尿的蛋白电泳检测。目前仍有很多单位无法进行免疫固定电泳检测，以北京25家三级甲等医院调查为例： 14家医院不能进行免疫固定电泳检测，基本上所有医院均不常规进行尿蛋白电泳的检测。摘自-中华血液学杂志2013年4月第34卷第4期,sebia,31,诊治现状分析：天津血液病研究所-邱录贵,漏诊
10、与误诊原因分析 1.目前初次就诊的MM患者漏诊和误诊率仍然很高，主要原因是： 非血液科医师：对本病缺乏认识 血液科医师： 对诊断标准掌握不准 2.骨髓穿刺的局限性 由于MM细胞在骨髓内分布不均，可能会导致某些部位的骨髓穿刺结果低于上述数值，使得部分患者漏诊 MM早期瘤细胞散在分布于造血细胞和脂肪细胞之间，骨髓穿不易抽取到瘤细胞。瘤细胞分泌M蛋白，具有较正常有核细胞更强的骨髓基质粘附性，细胞越幼稚，粘附力越强，容易出现空抽。(华西医院-血液科） 3.现有参考标准过时 旧的诊断标准（2003年前）不利于寡分泌型和不分泌型MM的诊断 国内目前多数教科书及血液科医师广泛参考的血液病诊断及疗效标准（第3
11、版）MM的诊断仍然沿用以往的诊断标准，需要及时更新。摘自-中华血液学杂志2013年4月第34卷第4期,32,多发性骨髓瘤分型,多发性骨髓瘤分型,单克隆（10种） Ig G,IgA, Ig M,IgD, Ig E, (kappa，lambda),轻链型（2种）kappa，lambda,双克隆型,不分泌型,14种,多发性骨髓瘤临床表现/并发症,Calcium,Renal,Anemia,Bone,CRAB,起因：主要与单克隆轻链造成的肾脏损害有关，病理学上可以表现为3种： 管型肾病-骨髓瘤肾病 淀粉样变性 轻链沉积病或混合型 血清肌酐及GFR-主要针对肾小球 不同类型的M蛋白造成肾功能损害的概率不同
12、 IgG骨髓瘤-本周阳性率 60% IgA骨髓瘤-本周阳性率 71% IgD骨髓瘤-本周阳性率 100%,多发性骨髓瘤-肾功能不全,36,多发性骨髓瘤最新诊治指南-诊断部分解读 （2013版） 上海长征医院-侯健,2013诊治指南-诊断部分更新内容注重概念的深化 强调骨髓瘤的诊断要认识疾病的本质，即导致相关靶器官的损害，出现典型的CRAB症状及免疫力低下所导致的反复感染，高滞血症等。 同时又要重视瘤细胞的生物学特征及对疗效和预后的影响。 注重把握新的诊断技术的应用 首次列入并明晰了诊断骨髓瘤的必须检测项目及对诊断或判断预后有价值的项目，必须检测项目是诊断骨髓瘤最为基本而不可或缺的内容。 注重把
13、握新标准的界定： 在诊断标准上提出了新的诊断定义： 在有症状骨髓瘤的诊断标准中不再强调M蛋白的数值，只要有血清和（或）尿中出现单克隆M蛋白，即为标准之一，但仍要求骨髓单克隆浆细胞比列10%。 少数小于10%，若能证实CRAB症状由克隆性浆细胞引起，也可诊断。摘自中华内科杂志-2013年9月第52卷第9期,北京康圣安科技发展有限公司,38,2013版-多发性骨髓瘤诊疗指南 多发性骨髓瘤必需检测项目,多发性骨髓瘤-国际诊断标准流程,第三部分-能诊断哪些肾脏疾病?,1.血清蛋白电泳 2.血-免疫固定电泳 3.尿-免疫固定电泳 4.尿蛋白电泳,1.确定尿蛋白类型(见59-61页幻灯） 2.早期糖尿病肾
14、病的诊断 早期表现:微量尿蛋白阳性 糖尿病肾病电泳图谱特征: 以大分子蛋白为主, 肾损伤以肾小球为主,肾小管损伤较轻. 3.早期高血压肾病的诊断 电泳图谱特征: 以小分子蛋白如a1-微球蛋白为主，肾损伤以肾小管为主，肾小球损伤较轻 尿蛋白以肾小管性，混合型蛋白尿为主，对肾脏损伤较重,临床应用范围-北京天坛医院-康熙雄教授,42,4.慢性肾炎，肾病慢性肾炎，肾病为混合型蛋白尿，以肾小球性蛋白尿为主，若肾小管性蛋白尿增多时，表明预后不良。5.肾功能不全 尿中检出的肾小管蛋白种类越多，肾功能恶化程度越严重.肾小管间质损害对肾小球肾炎患者的预后有着重要的影响。 慢性肾功能不全患者中，肾小球肾炎引起的最
15、为常见,约占50%-60%，发展到肾功能不全时，尿蛋白电泳结果为混合性蛋白尿，各小管蛋白种类也增多，约在3种左右。 6.尿免疫固定-尿游离轻链-多发性骨髓瘤,临床诊断疾病,43,滤纸电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳临床 聚丙烯酰胺凝胶电泳科研 毛细管电泳 电泳技术的革命,蛋白电泳技术的变迁,电泳技术的原理,-,+,蛋白加样位置,阴极,阳极,0,+,正常血清,单克隆 Ig,1.血清蛋白电泳,血清蛋白电泳是检测M蛋白的唯一方法,若在区出现异常的峰，且高宽比大于2:1,可以初步判定为M蛋白峰,正常血清蛋白电泳图谱,血清蛋白电泳：M蛋白形成异常浓集带，位于 区内，或 、2 区内可见一
16、窄底的高峰。由于尿液可以浓缩许多倍，因此检查游离轻链时尿蛋白电泳（UPEP）比SPEP灵敏。80%的MM患者可发现M蛋白,血M蛋白鉴定,急性肾炎,特征：以急性肾炎综合征为主要临床表现的肾脏疾病：血尿，蛋白尿，水肿，高血压 临床表现： 本病主要发生于儿童，高峰年龄为2-6岁，2岁以下或40岁以上的患者仅占所有患者15%。 病理检查： 病理免疫荧光检查可见：免疫复合物沉积，主要是IgG和C3，IgA和IgM较少见 电镜检查可见上皮细胞下“驼峰状”电子致密物沉积。,实验室检查,尿液检查：几乎所有患者都有镜下血尿或肉眼血尿。尿中红细胞多为畸形红细胞。尿沉渣可见白细胞，小管上皮细胞，并可有红细胞管型，颗
17、粒管型。 血常规：可由轻度贫血，白细胞计数可正常或升高，血沉加快。 免疫学检查：动态观察C3的变化对诊断急性肾炎非常重要。疾病早期，C3下降，8周内恢复到正常水平，是急性肾炎的重要特征。,电泳图谱-急性炎症,P N,慢性肾炎,临床表现：以血尿，蛋白尿，水肿和高血压为基本症状。 发病机制：主要与原发病的免疫炎症损伤有关 实验室检查： 疾病早期尿液检查可表现为程度不等的蛋白尿或血尿，可见红细胞管型，部分患者出现大量蛋白尿，定量结果大于3.5g/24h.,电泳图谱-慢性炎症,高蛋白尿高度水肿高脂血症低白蛋白血症,三高一低,肾病综合征是肾小球疾病 中一种常见的临床综合征,微小病变性肾病 系膜增生性肾小
18、球肾炎 局灶节段性肾小球硬化症 膜 性 肾 病 膜增生性肾小球肾炎,原发性,系统性红斑狼疮 糖尿病 过敏性紫癜 乙型肝炎 多发性骨髓瘤,原发性,继发性,胆固醇 三酰甘油,总蛋白 白蛋白 30g/L,尿液检查,血液学检查,白蛋白 1、球蛋白 2、球蛋白,血脂,血浆蛋白电泳,血浆蛋白,N P,总蛋白浓度降低(低于 60g/l),电泳图谱-肾病综合征,M蛋白？ 什么类型？,2. 血清免疫固定电泳,G A M kappa lambda,血清免疫固定电泳,ELP 泳道: 固定液 G 泳道： 抗 IgG 重链抗血清 A 泳道： 抗 IgA 重链抗血清 M 泳道： 抗 IgM 重链抗血清 K 泳道： 抗 轻
19、链抗血清 L 泳道： 抗 轻链抗血清,仪器： Sebia 琼脂糖凝胶电泳仪 试剂：免疫固定电泳试剂 灵敏度：31-125ug/L,正常血清免疫固定,确认IgM 型M蛋白,血清蛋白免疫固定电泳应用举例 （1）,IF,在区 发现疑似M蛋白,轻链病,血清蛋白免疫固定电泳特殊病例,免疫固定结果显示为单独的 l 成分,本周氏蛋白,1844年Henry Bence Jones 在一个骨髓瘤患者尿中发现 一种具有特殊凝溶性质的蛋白 4060发生沉淀，加热煮沸时溶解，冷却后又沉淀 轻链二聚体 大多数骨髓瘤患者尿中有本周氏蛋白,浆细胞病的诊断和治疗监测 某些情况下，特别是对轻链型的M蛋白，比血清免疫固定电泳更加
20、敏感 因为游离轻链的分子量比较小（2550KDa）更容易通过肾脏清除进入尿液中，从而在尿中被检测到,本周氏蛋白电泳的临床意义,90100,4060,室温,本周氏蛋白检测方法热沉淀反应法,本周氏蛋白检测方法-尿液的免疫固定电泳,重链,参考泳道,复合轻链,游离轻链,4.尿蛋白电泳,68,白蛋白 转铁蛋白 免疫球蛋白 小分子蛋白,小分子蛋白,微量免疫球蛋白， 转铁蛋白，白蛋白,肾小球滤过,白蛋白 转铁蛋白 免疫球蛋白 小分子蛋白,小分子蛋白,肾小管重吸收,微量免疫球蛋白，转铁蛋白，白蛋白,尿液,SDS尿蛋白电泳图谱,SDS,SDS,+,-,分子量标记 (kDa),14.4,30,43,67,94,低
21、分子量 ( 67 kDa),高分子量 ( 67 kDa),白蛋白 ( 67 kDa),分子筛,肾小球性蛋白尿, 67 kDa,白蛋白, 67 kDa,肾小管性蛋白尿,混合性蛋白尿, 67 kDa, 67 kDa,SDS尿蛋白电泳,15号样本BJ电泳,尿蛋白电泳的联合应用,尿本周氏蛋白电泳,游离kappa,敏感性高：检测限为15mg/L 标本收集：随机尿，无需浓缩(推荐晨尿) 检测结果 尿蛋白的全貌 直观反映肾脏受损部位 对不愿意进行肾穿检查的病人,可作为替代实验 动态观察：对确诊或不典型患者可进行动态观察,SDS非浓缩尿蛋白电泳检测的优势,第四部分-给临床的报告单格式,报告单必须含有以下内容: 电泳条带图谱检测结果的M蛋白峰必须给出%和g/L数值全部图谱条带的解析,77,尿蛋白电泳报告单,电泳标准报告单,北京康圣安科技发展有限公司,78,Thanks,乔玉龙 电话：15603712709 微信: robert60309875 邮箱：,我们一起共同成长，见证奇迹！,
