1、SRB 法检测大鼠原发肝癌细胞、骨髓间充质干细胞和 HepG2 细胞的抗肿瘤药物敏感差异(1)【摘要】目的：应用 SRB 法探讨不同药物对骨髓间充质干细胞（MSCs） 、肝癌细胞和 HepG2 细胞的药敏差异.方法：雌性清洁级 SD 大鼠 20 只，应用二乙基亚硝胺饲喂法建立大鼠原发性肝癌模型，选取诱癌成功大鼠 8 只分别原代培养 HC 与 MSCs，同时培养 HepG2 细胞系细胞，SRB 法进行药物敏感实验，观察药物敏感性的差异.结果：对阿霉素、顺铂、洛拉曲克的敏感度从高到低依次为 HepG2 细胞,HC,MSCs.而丝裂霉素药敏显示，3 种细胞药物敏感度从高到低依次为 HepG2,MSC
2、s,HC.结论：HC 药敏实验与 HepG2 细胞和 MSCs 存在一定异同.【关键词】肝肿瘤；肿瘤干细胞；间质干细胞；SRB 药物敏感实验原发性肝癌细胞中也存在类似于其他实体瘤肿瘤干细胞的强增殖性细胞亚群，其在表面标志、耐药性、强增殖性等方面与骨髓间充质干细胞（marrowmesenchymalstemcells,MSCs）存在相同点1.而细胞系则被认为是不同于肿瘤干细胞的永生化细胞.我们使用二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine,DEN）制备大鼠原发性肝癌模型，应用 SRB 法药物敏感实验检测抗肝癌药物（阿霉素、顺铂、丝裂霉素、洛拉曲克）对肝癌细胞（hepatocarcinom
3、acells，HC）,MSCs 和 HepG2 细胞杀伤作用，为探讨耐药机制不同的细胞特征差异提供新的线索.1 材料和方法材料雄性清洁级 SD 大鼠 20 只，鼠龄 8wk，体质量（）g，由南方医科大学动物实验中心提供;HepG2 细胞由广东省人民医院肿瘤科惠赠;LDMEM ，RPMI1640 ，胎牛血清为杭州四季青产品;SRB，DEN 为美国 Sigma 公司产品;阿霉素为浙江海正药业股份有限公司产品；顺铂（规格:10mg/瓶）为山东齐鲁药业股份有限公司产品；丝裂霉素为浙江海正制药厂产品；洛拉曲克（nolatrexeddihydrochloride,AG337）为北京康辰医药发展有限公司产品
4、.方法采用 DEN 诱发大鼠肝癌模型，即用 g/LDEN 水溶液为诱癌剂，放在水中大鼠自由饮水.1216wk 后选取诱癌成功的大鼠 8 只进行实验.将大鼠处死，750mL/L 乙醇浸泡 3min.无菌条件下剥离肿瘤，取肝癌组织约 1g，置于含 500U/L 青霉素,500g/L 链霉素的无菌 PBS 液中.切取无坏死肝癌组织块，用 Hank 液漂洗 2 次，剪碎为 mm31mm3，放入 25mL 培养瓶贴壁，加少量含 200mL/L 胎牛血清的 RPMI1640 培养液.翻置 25mL 培养瓶，50mL/LCO2,37恒温箱中培养 23h.再次翻转，加足量含 200mL/L 胎牛血清的 RPM
5、I1640 培养液.根据培养液改变情况 23d 换液.同只大鼠在 HC 原代培养取材后，无菌条件下分离股骨胫骨，咬去骨两端，用 LDMEM培养基冲出骨髓于离心管中，吹打制成细胞悬液.贴壁培养法纯化 MSCs2.抗癌药物工作液浓度为该药的标准血浆峰浓度 2 倍.血浆峰浓度（mg/L）=药物用量（mg/kg）60kg/5000mL21000mg/g.四种药物分别配成 20X 溶液.取培养瓶中细胞，调整细胞密度至 3107 个/L，180L/孔接种至 96 孔板,预培养 24h 后，每孔加药物 20L，每种药物设 3 个复孔，每孔总液量为 200L，继续在培养箱内培养 48h，甩去培养液风干.每孔加
6、冰冷 500g/L 三氯醋酸50L（终浓度为 100g/L）固定 60min 后去离子水洗 45次，干燥.每孔加 4g/LSRB100L 作用 30min,10mL/L 醋酸轻洗 4 次,甩干.每孔加 10mmolTrisbase200L 摇动混匀，在平板振荡器上振荡 5min,在酶联免疫检测仪测定 A 值，用空白对照调零，所用波长为 490nm.将所获 HC 生长抑制率定义为药物对 HC 的体外抑制率.抑瘤率（%）=（无药细胞对照孔 A 值平均值-用药孔 A 值平均值）/无药细胞对照孔 A值平均值100%.统计学处理：采用 SPSS 统计软件.各化疗药物对 HC 抑制率、MSCs 抑制率和
7、HepG2 抑制率组组间进行配对 t 检验，不同化疗药物对 HC 抑制率,MSCs 抑制率,HepG2 抑制率分别进行 OnewayANOVA 分析.2 结果对阿霉素、顺铂、洛拉曲克 3 种药物的敏感性为：HCHepG2MSCs，对丝裂霉素的敏感差异从高到低依次为：MSCsHepG2HC，差异具有统计学意义.3 种化疗药物对 HC抑制率、对应 MSCs 抑制率与 HepG2 抑制率，之间存在统计学差异（P 3 讨论肝癌化疗的有效率低下依然是目前临床晚期肝癌的棘手问题，建立一个体外化疗药物敏感实验系统，进行个体化治疗，有望提高肝癌化疗疗效3.现在临床常用的药敏实验主要有 MTT 比色法、放射性同
8、位素标记物掺入法、三磷酸腺苷生物发光法、区别染色细胞毒法、流式细胞仪测定法等，各有不同的优缺点4-5.SRB 法药物敏感实验成本相对三磷酸腺苷生物发光法低，相对 MTT 结果准确并能保存较长时间（1520d） ，是 NCI 推荐的一种较新筛选抗癌药物的方法.HepG2 细胞系细胞本身是永生化细胞，但目前普遍认为：细胞系与现在提出的肿瘤干细胞虽然在增殖性和永生化方面一样，但细胞系缺乏分化能力，与肿瘤干细胞存在某种尚未明了的差异.我们的实验结果表明，阿霉素和洛拉曲克杀伤细胞作用较强，而 MSCs 对阿霉素、顺铂、洛拉曲克敏感性明显低于肿瘤细胞和 HepG2 细胞.而丝裂霉素对 HepG2 细胞和
9、MSCs 的抑制率却远远高于 HC.这些差异说明 HC 和干细胞样细胞存在不同的抗药物机制，其抗药物杀伤能力相差较大.肿瘤干细胞也可能存在相同的耐药机制.细胞系药物敏感类似于普通 HC，相对抑制率都较其他两者高，但在抗丝裂霉素杀伤上却于间充质干细胞相似.细胞系存在类似干细胞样细胞药物作用位点，可能为区别于普通 HC 但类似肿瘤干细胞的功能结构，还有待通过进一步的实验研究来清楚阐明.【参考文献】1周思朗，李鹏，曹漫明，等.大鼠肝癌干细胞生物学行为研究J.中华肝脏疾病杂志，XX，14（5）：364-366.2BaddooM,HillK,WilkinsonR,etal.CharacterizationofmesenchymalstemcellsisolatedfrommurinebonemarrowbynegativeselectionJ.JCellBiochem.XX,89:1235-1249.3陈涛，褚忠华，刘建平，等.体外化疗药物敏感实验对指导原发性肝癌个体化疗的临床意义J.癌症，XX，24:1018-1022.（作者：3COME 未知本文来源于爬虫自动抓取，如有侵犯权益请联系 service立即删除）
