1、沼气发酵液中一株酵母菌菌株的鉴定与系统发育分析中国沼气 ChinaBiogaz2008,26(4)7沼气发酵液中一株酵母菌菌株的鉴定与系统发育分析游银伟,迟晓峰,岳寿松,张昌爱.,王,王艳芹.,刘英.(1.山东省农业科学院高新技术研究中心,济南 250100;2.山东省农业科学院土壤肥料研究所,济南 250100)摘要:从沼气发酵液中分离到一株酵母菌,根据形态学特征 ,生理生化特征和分子生物学方法对其进行了鉴定.克隆了该菌的 18SrDNA 序列(GenBank 接受号:EU784644) 和 5.8SITSrDNA 序列(GenBank 接受号:EU784645)并进行测序,结果表明 18S
2、rDNA 全长 1739bp,5.8S.ITSrDNA 全长 569bp.以 5.8SITSrDNA 序列同源性为基础构建了相关属种的系统发育树,结果表明 CXF.1 与季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)处于同一进化分支中,相似性达 99.6%,因此将该菌鉴定为季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii).关键词:沼气发酵液;季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii);5.8S ITSrDNA;系统发育分析中图分类号:Q939.9;$216.4 文献标识码:A 文章编号 :10001166(2008)04000704Identificati
3、onandPhylogeneticAnalysisofaYeastStrainfromBiogasSlurry/YOUYin-wei,cmXiao_feng,YUEShou.song,ZHANGChang-ai2,LIUYing2/(1.HighTechResearchCenter,ShandongAcademyofAgriclll-turalSciences,Jinan250100,China;2.SoilandFertilizerInstitute,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan250100,China)Abstract:Ayeast
4、strainCXF.1isolatedfrombiogasslurrywasidentifiedbymorphological,physiological,biochemicalcharacteristicsandmoleculartechnology.The18SrDNAand5.8S-ITSrDNAofthestrainwerean1plifiedandsequenced.Theresultsshowedthatthecompletesequenceofthe18SrDNAand5.8SITSrDNAwere1788bpand607bp,respective?ly.Aphylogeneti
5、ctreewasconstructedbycomparingwiththepublished5.8SITSrDNAsequencesofrelativeyeastspecies.Inthephylogenetictree.thestrainCXF-1wastheclosestrelativetOPichiaguilliermondiiwithmolethan99.6%sequencesimilarity.ThestrainCXF 一 1WaSidentifiedasPichiaguilliermondii.Keywords:biogasslurry;Pichiaguilliermondii;5
6、.8SITSrDNA;phygeneficanalysis沼气发酵微生物主要包括发酵性细菌,产氢产乙酸菌,耗氢产乙酸菌,食氢产甲烷菌,食乙酸产甲烷菌五大类群】,前三类群细菌的活动可使有机物形成各种有机酸,将其统称为不产甲烷菌,后二类群为古细菌,其活动可使各种有机酸转化成甲烷,将其统称为产甲烷菌 J.但是沼气池中微生物并不是只有上述五类菌,还会有一些酵母菌存在.有研究报道沼气池中存在大量的酵母菌可以促进沼气的产生,这可能跟酵母菌分解有机物有一定关系,同时还跟酵母菌细胞作为生长因子促进其他沼气发酵微生物生长有关.目前国内外关于沼气池中酵母菌的作用及作用机理研究非常少,因此分离沼气池中酵母菌并进行深
7、入研究非常必要.传统分类方法主要依据形态学和生理生化特征,但是由于某些酵母菌属,种在这两方面差异很不明显,因此传统方法有时不能达到分类目的.随着分子生物学技术发展,一些分子水平的分类方法被应用于酵母菌分类中,主要包括 18SrDNA 序列分析,5.8S.ITS 间区序列分析等.酵母菌同属的 5.8srDNA 序列很相似,但其两侧间隔序列在长度和序列上有高度变异性,可以提供丰富的变异位点和信息位点.5.8S.ITS 间区序列的这种特性成为目前鉴定酵母菌理想的模板 J.本研究主要利用分子分类方法对从沼气发酵液中分离到的一株酵母菌进行了鉴定并进行系统发育分析,为进一步研究其应用价值奠定基础.1 材料
8、和方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒收稿日期:2008-07-01 修回日期 :2008-07 一 l1作者简介:游银伟(1976 一),男,助研,主要从事农业微生物研究,E mail:8 中国沼气 ChinaBiogas2008,26(4)大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a 由本实验室保存;pMD18 一 TVector 购自 TaKaRa 公司.菌株 CXF 一 1从山东省农业科学院沼气科学研究中心试验池的沼液中分离得到.1.1.2 培养基YEPD 培养基:葡萄糖 2%,蛋白胨 2%,酵母膏1%,pH6.0.1.1.3 酶和试剂dNTP,DL2000Marker 购自北
9、京全式金生物技术有限公司;IPTG(异丙基一 BD 一硫化半乳糖苷 ),xGal(5 一溴 4 一氯-3.吲哚一 BD 一半乳糖苷), 氨苄青霉素(Ampicillin)购自上海生工公司;胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司;TaqDNA 聚合酶,EcoRI,PstI 限制性内切酶购自 TaKaRa 公司.其他试剂均为分析纯试剂.1.2 茵落及茵体形态观察取 100txL 稀释到 10 的菌株 CXF 一 1 发酵液涂布 YEPD 固体培养基平板,3Oqc 倒置培养 3 天,观察菌落形态.结晶紫单染色法菌体染色,1600 倍观察菌体形态特征.1.3 生理生化特征按 10%接种量将 CXF
10、 一 1 分别接种于 pH3.5,4.0,5.5,6.0,6.5,7.0 的 50mLYEPD 液体培养基中 3Oqc 培养 72h,离心收集菌体,l2Oqc 烘至恒重,计算生物量,判断最适生长 pH 值;同理,接种CXF 一 1 于 pH6.0 的 YEPD 液体培养基后,分别在2Oqc,25qc,3Oqc,35qc,4Oqc 下培养,判断最适生长温度;接种 CXF 一 1 于 pH6.0 的 YEPD 液体培养基后,3Oqc 培养 ,每隔 12h 取样,获得生长曲线.采用文献一中推荐的培养基和培养条件进行糖发酵实验和同化碳源实验,观察结果.1.4PCR(聚合酶链式反应)扩增 18SrDNA
11、菌株 CXF 一 1 基因组 DNA 提取参照精编分子生物学指南的方法略有改动8.采用古细菌特异引物 w017 和生物通用引物 w002 尝试 PCR 扩增菌株 CXF 一 1 的 18SrDNA 序列.引物序列为 w002:5/一TACGGCTACCTrGTrACGACT-3/;w017:5/一 ATTCYCC,rrCATCCYGSCRC-3/【.反应体系(50L)包括:10buffer5IxL,模板 1IxL,dNTP200Imol?L,Taq 酶 2U,引物 w002 和 w017 各 0.1imol?L.反应条件:97C5 分钟;94C1 分钟,55oC1分钟,722 分钟,3O 个循
12、环;72C10 分钟.扩增产物回收后,连接到 pMD18 一 T 载体上,转化 E.coliDH5a.在含有 100mg?L 氨比西林 (Ampicilin),IPTG0.5mmol?L 一,XGal40g?mL 一的 LB 平板上培养后挑选白色菌落,提取阳性转化子质粒进行验证.PCR 验证条件同克隆条件;双酶切验证体系参照 EcoRI 和 PstI 说明书进行.将通过酶切和PCR 双重验证正确的重组质粒命名为 pMD 一 18S.1.5PCR 扩增 5.8SITSrDNA根据 White 等报道.,采用引物 ITS1:5/一 TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3/:ITS4:5/一 T
13、CCTCCGCTTATTGATATG-3/扩增 5.8SITS 序列.反应条件:97qc5 分钟;94qc1 分钟,54C1 分钟,72qc2 分钟,3O 个循环;72qc10 分钟 .扩增产物回收后,连接到 pMD18.T 载体上,转化大肠杆菌 DH5a,挑取阳性转化子进行 PCR 验证,PCR 验证条件同克隆条件,将通过验证正确的重组质粒命名为 pMD-5.8S.1.65.8SITSrDNA 序列分析和系统发育树构建由北京博尚生物技术有限公司进行测序,在NCBI 上分析序列同源性.将所测的 5.8SITSrDNA基因序列与 GeneBank 数据库中已有序列比较 ,并从数据库获得相关种的
14、5.8SITSrDNA 基因序列,构建系统发育树.序列对排用 CLUSTALXprogramL1,进化树构建按照 Neighbour-joining 方法引,用 PHYLIPprogram 中的 NEIGHBOURprogram 进行.进化树分枝模式的稳定性用 PHYLIP 中的 SEQBOOT,DNADIST 和 CONSENSE 分析,重复次数为 i000E.2 结果与分析2.1CXF 一 1 形态特征观察CXF 一 1 在 YEPD 培养基上菌落圆形,乳白色,半透明,质地均匀,边缘整齐,表面光滑,湿润,粘稠,易挑起.菌体椭圆形,大小 1.03.Om2.06.O(图 1).图 1 菌株 C
15、XF.1 菌体光学显微观察(1600)2.2 生理生化特征菌株 CXF 一 1 最适生长温度为 2530C,最适生中国沼气 China8/oga2008,26(4)9长 pH 范围为 5.06.0,CXF 一 1 接种培养 48h 后,生物量即达到最高.糖发酵实验结果表明,CXF 一 1 可以发酵葡萄糖,半乳糖,蔗糖,海藻糖,蜜二糖,棉籽糖,菊糖,不能发酵麦芽糖,纤维二糖,乳糖,松三糖.同化碳源实验结果表明 CXF 一 1 可以同化葡萄糖,半乳糖,L 一山梨糖,蔗糖,纤维二糖,海藻糖,蜜二糖,棉籽糖,松三糖,菊糖,D 一木糖,L 一阿拉伯糖,D 一阿拉伯糖,甘油,核糖醇,D 一甘露醇,甜醇,不
16、能同化乳糖,赤藓醇,肌醇.2.318SrDNA 序列 PCR 扩增以 CXF 一 1 染色体 DNA 为模板,以 w017 和 w002为引物进行 PCR 扩增,得到 1.8kb 左右的片段,与预计相符(图 2).1DL2000;2.阴性对照;3.PCR 产物图 218SrDNAPCR 扩增图谱将目的片段同 pMD18 一 T 载体连接后转化大肠杆菌 DH5a,挑取转化子进行验证.将增大的重组质粒 pMD 一 18S 进行 EcoRI/PstI 双酶切验证,酶切图谱显示酶切产物包含 2 个片段,一个大约 1.8kb,与 PCR 产物大小相当,另一个大约 2.7kb,与pMD18 一 T 载体相
17、当(图 3);用引物 w017,w002 对重组质粒 pMD 一 18S 进行 PCR 扩增,扩增出来的 PCR产物大约 1.8kb 左右,与预计相符(图 4),表明重组质粒 pMD 一 18S 为构建成功的重组子 .将验证好的重组质粒 pMD 一 18S 进行测序,测序1.PL2000;2.PMD-tSS,3 双酶切产物图 3pMD18S 酶切验证1.DL2000;2PCR 产物图 4pMD 一 18SPCR 验证结果表明该扩增片段除去两端引物序列长 1739bp,该序列在 NCBI 上 BLAST,结果表明它与季也蒙毕赤酵母菌(P.guilliermondii), 汉逊德巴利酵母菌(Deb
18、aryomyceshansenii)及假丝酵母菌属(Carutida)一些种的 18SrDNA 序列同源性均很高,同源性达98%以上 ,因此,仅通过 18SrDNA 序列不能将菌株CXF 一 1 鉴定到种.将该序列提交 GenBank 获得接受号为 EU784644.该结果同时表明用古细菌特异引物 w017 和生物通用引物 w002 扩增酵母菌 18SrDNA 序列是可行的.2.45.8SITSrDNA 序列 PCR 扩增以 CXF 一 1 染色体 DNA 为模板,以 ITS1 和 ITS4为引物进行 PCR 扩增,得到 0.6kb 左右的片段,与预计相符(图 5).12图 55.1DL200
19、0;2PCR 产物图 6pMD-5.8SPCR 验证一一10 中国沼气 ChinaBiogas2008,26(4)将目的片段同 pMD18 一 T 载体连接后转化大肠杆菌 DH5oL,挑取转化子进行验证.用引物 ITS1,ITS4 对增大的重组质粒 pMD-5.8S 进行 PCR 扩增,可扩增出 600bp 左右的目的带,与预计相符(图6),表明重组质粒 pMD-5.8S 为构建成功的重组子.将验证好的重组质粒 pMD-5.8S 进行测序,测序结果表明该扩增片段除去两端引物序列长 569bp,将该序列在 NCBI 中比对,结果表明它与季也蒙毕赤酵母(P.guilliermondii)5.8SI
20、TSrDNA 序列同源性高达 99.6%.该序列提交 GenBank 获得接受号为 EU784645.2.55.8SITSrDNA 系统发育树构建根据菌株 CXF-1 的 5.8SITSrDNA 序列在 GenBank中比对结果,用舢软件做系统发育树(图 7).facar/bbaCNRMA2oo500812U569O291iaguilliermondllL280663476)chiailliermondii(ABlOS435)舅 cpisensis(EU3270351cuaucozymaCECT11449(DQ4145391Pich/ainusCBS744(EU117199)henricffC
21、ECTl14510)Q41454o1cspatinaeNRRLY 一 76653fAF423029)P.chiadeserticola(AY790539,Pc/amembrandens(EF061132)jnorvegensis(AB27817O1pichiaiadinii(EU568909)PithiaCECT118000414543)Hc/ffasssippiensisCECT11463(DQ414542)iaamyloph 也 lCECT11439fDQ414541P/chiaraaulensis(AY790541).iaanomala07321fEU38“0207)cacacAB054
22、116)PithiaadnosdWM803(EF5680671jiamexicanaWM805fEF568o691scobrd(AB0541l1Phinositovora(AB0541131CXF 一 1cguilllermondii(EU2367031Pith 诅 guilliermondiiWM02.374F568007)图 75.8SITS 系统发育树由系统发育树可看出菌株 CXF 一 1 与 P.guillier-morutii 亲缘关系最近,序列同源性大于 99.6%,形成一个簇群.结合 CXF 一 1 的形态学特征,培养特征,生理生化特征,18SrDNA 序列,5.8SrDNA 序
23、列将该菌鉴定为 P.guilliermondii,命名为季也蒙毕赤酵母 CXF 一 1.3 讨论采用古细菌特异引物 w017 和生物通用引物w002 可以成功克隆菌株 CXF 一 1 的 18SrDNA 序列 ,主要原因是 w017 为兼并引物,该设计可为其他同行参考.季也蒙毕赤酵母为非致病酵母,在工农业生产中有着很好的潜在应用前景.Droby 等口将季也蒙毕赤酵母发酵液与 CaC1:混合后喷洒到成熟的苹果上,可以防止青霉等霉菌的侵染,将苹果发生腐烂的几率降低 3%一 27%,推测该菌在发酵过程中能产生抗真菌物质,可抑制有害真菌生长;季也蒙毕赤酵母具有很强的将木糖转化为木糖醇的能力,而木糖醇由
24、于其多功能性而成为近几年研究的热点.本研究首次报道从沼气发酵液中分离到季也蒙毕赤酵母,但是该菌在沼气池中的具体作用还不清楚,有待于进一步研究.参考文献:1钱泽澎,阒航 .沼气发酵微生物学M.杭州:浙江科学技术出版社,1986.21BalchWE,FoxGE,MagrmnLJ,eta1.Methanogens:reevaluationofauniquebiologicalgroupJ.MicrobiolRev,1979,43(2):260296.3OlcayO,KocasoyG.AccelerationofthedecompositionrateofanaerobicbiologicaltreatmentJ.JEnvironSciHealthAToxHazardSubstEnvironEng.2004,39(4):10831093.4周春艳,张秀玲 ,王冠蕾.酵母菌的 5 种鉴定方法J.中国酿造,2006,8:5154.5KregervanRijNJW.TheYeasts:aTaxonomicStudyM.Amsterdam:ElsevierSciencePublishiersBV,1984.6巴尼特 JA.酵母菌的特征与鉴定手册M.青岛:青岛海洋大学出版社.1991.7BarnettJA.Yeasts:CharacteristicsandIdentification
