1、肝癌细胞生物学行为改变涉及 p120ctn酪氨酸磷酸化 黄华艺 农朝赞 郭凌宵（广西民族医院 530001）摘 要 目的 观察 p120ctn 磷酸化与肝癌细胞生物学行为的关系，探讨 p120ctn 肝癌细胞粘附和信号转导中的作用。 方法 使用免疫沉淀和免疫印迹法检测 EGF 引起的 p120ctn 磷酸化情况，用免疫细胞化学技 术观察 p120ctn 在细胞内的分布、转位和形态学改变，用相 应的方法检测细胞粘附和迁移情况，反 义核酸技术用于反义 p120ctn 的转染。结果 EGF 可使p120ctn 酪氨酸 发 生磷酸化，以作用 20min 时最明显；磷酸化后的 p120ctn发生了转位，
2、膜表达减少，核表达增加，-catenin 也发生相似的改变；细胞粘附能力下降，迁移能力增加， 细胞形态变为细长和不规则，伪足增多。结论 p120ctn 在细胞粘附和酪氨酸蛋白激酶信号转导途径中起重要作用。提示 p120ctn 酪氨酸磷酸化与肝癌发生和转移过程存在某种联系。关键词 酪氨酸磷酸化 肝癌 连环蛋白 p120P120ctn Tyrosine Phosphorylation Are Involved in Hepatocellular Carcinoma Cell Biologic Behavior Changes HUANG Hua-yi1*, NONG Chao-zan1, GUO
3、Ling-xiao1,ZHA Xi-liang2.Guangxi Nationalities Hospital, Guangxi Nanning 530001,China【Abstract】Objective In order to investigate the relationship between p120ctn phosphorylation and of biologic behaviors liver cancer cells for further exploring the role of p120ctn in hepatocellular carcinoma cell ad
4、hesion and signaling. Methods Phosphotyrosine of p120ctn were detected by immunoprecipitation and immunoblotting. The cellular distribution and translocation of p120ctn and -catenin and cell morphology changes were detected and examined by immunocytochemistry.Cell adhesion and migration abilities we
5、re also detected using correspondent methods. Antiseuse-nucleotide method were used in anti-p120ctn transfection. Results Phosphorylated tyrosine of p120ctn had been observed after EGF stimulation,The tyrosine phosphorylation level was significant at 20min after EGF stimulation comparied to control.
6、 Phosphorylated p120ctn translocated into nucleus, its membrane distribution was reduced, and same changes of -catenin were found while compared with p120ctn; Cell adhesion abilities reduced and migration abilities increased, cell morphology became thin, elongated and irregular, their speudopods inc
7、reased. Conclusion p120ctn play an important role in hepatocellular carcinoma cell adhesion and protein tyrosine kinase signaling cascade. It suggested that there is a relationship between p120ctn tyrosine phosphorylation and hepatocellular cacinoma occurrence and metastasis.【Key words】 P120ctn; Hep
8、atocellular Carcinoma; Tyrosine Phosphorylation作者单位：广西民族医院中心实验室（黄华艺，农朝赞，郭凌宵） ，广西 南宁 530001 ，作者现在地址： Department of pharmacology Microplate Reader 550 为 Bio-Rad，带有 490nm和 540nm 滤光片，X-光胶片和自动洗片机均为 KODAK。4.其他：人全长 p120ctn 反义核苷酸在中科院上海生化所设计，上海生工公司合成。序列如下:5-End:53 GTCCCATCATCTGAGGT3-End:53 CTGGATAACCATCTTCAT
9、AG、 方法1.细胞培养：细胞在含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基， 5%CO2, 37条件下生长。2.p120ctn 磷酸化方法：参照 Hazan 的方法进行 10。即生长在 60mmdish 中的细胞达到融合，换无血清培养液继续培养 36hr 以饥饿细胞，然后用 EGF 刺激以使 p120ctn 酪氨酸残基磷酸化。细胞分组如下：A 组：已饥饿的 BEL-7404 细 胞以 200ng/ml 的 EGF 刺激 10min,20min,30min；B 组：细胞在 EGF 刺激前 48hr 给予 Caliculin A 5nmolL-1（抑制磷酸酶），然后再给 EGF 刺激10m
10、in,20min,30min；C 组：细胞先转染 p120ctn 反义核苷酸 3A 24hr 后再给予 EGF 刺激10min,20min,30min。D 组：细 胞给予 0.1%DMSO 处理 48hr。E 组：细胞不作任何处理。p120ctn 反 义核苷酸转染细胞的方法如下：细胞在含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 中生长到融合，弃去培养液，加入 10molL-1 用无血清培养液溶解的反 义 p120ctn 寡核苷酸（60g/ml），无血清培养液培养 1hr，然后换含 10%胎牛血清继续培养 24hr。3.免疫沉淀(IP)和免疫印迹(IB)：细胞用溶解液（40mM NaPO4, pH
11、7.2, 250mM NaCl, 50mM NaF, 5 mM EDTA, 1%Triton X-100, 1%Deoxycholate）在冰上溶解 20min，震荡数秒， 然后在 4下 14,000rpm 离心 10min，上清液用 Bradford 法测蛋白含量（Bio-Rad），以 1000g 的总蛋白与 10g 的抗-pp120 抗体进行保温，然后加入 50l 的蛋白 G-琼脂糖混合液，4 转动下保 稳一小时，洗 琼脂糖四次，然后加入 50l 2SDS 上样 buffer，煮沸 5min， 离心，取上清 30l 上样到 8% SDS-PAGE gel 进行电泳。把蛋白转到 PVDF 膜
12、, 然后膜与抗-磷酸酪氨酸单抗（(PY20)在 4下保温过夜。与 HRP 标记的二抗保温，最后进行 ECL 发光并用 X 光胶片进行暴光，并在柯达自动洗片机中进行胶片冲洗。4.细胞粘附试验 11生长达到 80%融合的细胞用无血清培液培养 8hr，然后分 别 以不同的药物处理，再给EGF 处 理，细胞在 EDTA 消化后转到用 Fibronectin 包被 96 孔培养板，每孔加入经处理的细胞悬液 100l(10000 个细胞)后，置 37，5%CO2 温箱中保温 4hr 后取出，用温的 1640 培液轻轻洗去未粘附的细胞，加 0.4%EDTA/PBS 37下保温 20min，解离去粘附的细胞，
13、收集于另一培养板中，并用血球计数板 计数。粘附细胞数加入细胞总数5. 细胞迁移试验 12包被 10g Fn 的 6 孔培养板待长满细胞，用 200l Tip 轻轻擦过孔底，划一“井”字。用PBS 漂洗培养板，加入培养液 继续培养 24hr。显微镜下观察划痕中细胞迁移情况，并照相以图片表示。6. 免疫荧光显微镜技术：在激光细胞仪下观察照相。7. 细胞形态学观察：免疫细胞化学法，在 Olympus 荧光显微镜下观察照相。结 果、 反义核酸转染细胞效果鉴定转染 p120ctn 反义核苷酸前后的细胞荧光图谱(图 1)A B图 1 反义核苷酸转染细胞效果。 A：转染前 B：转染后、 EGF 对 p120
14、ctn 的磷酸化作用200ng/ml 的 EGF 作用 20min 后， p120ctn 酪氨酸明显磷酸化（ A 组），而加入磷酸酶粘附率(%) = 100%A BA B抑制剂后磷酸化增加（B 组），转染 p120ctn 反义核苷酸后以及对照组细胞磷酸化程度很微弱（C、 D 和 E 组）(图 2);时间进程的磷酸化作用 (图 3)。A B C D E IP: Anti-p120 IB: Anti-phosphotyrosine图 2 BEL-7404 细胞在接受 200ng/ml EGF 刺激 20min 后，p120 ctn 酪氨酸磷酸化情况。A：EGF ; B：Caliculin A+EG
15、F; C：p120ctn antisense+EGF；D：DMSO；E：空白对照IP: Anti-pp120 IB: Anti-phosphotyrosine图 3：时间进程 p120ctn 磷酸化情况. A: 10min; B: 20min; C: 30min、 EGF 作用不同时间对 BEL-7404 肝癌细胞粘附行为的影响BEL-7404 肝癌细胞经 EGF 作用 10min，20min，30min 后，细胞粘附能力有所下降，其中以 20 min 的改变较为显著(表 1)。表 1 EGF 作用不同时间对 BEL-7404 细胞粘附率的影响（%）组别 粘附率（%）10min 20min 3
16、0minEGF 31.2 15.6 23Caliculin A+EGF 21 12.7 19.8Antisense-p120ctn+EGF 73 51 62DMSO 83 87 81.2Non-treated cells 85.6 83 88四、EGF 刺激后 120ctn 和-catenin 在细胞内的分布变化BEL-7404 细胞在 EGF 刺激后，p120 ctn 在细胞内的分布变化表现为胞浆表达显著增强，许多细胞出现核内转位；而-catenin 也有相似的变化（图 5）。EGF 10min EGF 20min EGF 30min -Tubulinp120ctnA B C-Tubulin
17、p120ctnp120ctnEGF 10min EGF 20min EGF 30min图 5 BEL-7404 细胞经 EGF 刺激后 p120ctn 在细胞内的分布变化及其与-catenin 的关系。五、EGF 作用后 BEL-7404 细胞形态学的变化BEL-7404 细胞经 EGF 刺激后，细胞的形态发生了变化，表现为细胞伪足增多， 细胞变为细长而不规则(图 6)。EGF 10min EGF 20min EGF 30min图 6 EGF 刺激后 BEL-7404 细胞细胞形态变化。3.320讨 论p120ctn 与其它 Catenin 一样易发生酪氨酸残基磷酸化，而 导 致 Cateni
18、n 磷酸化的因素通常是因为激活的受体酪氨酸蛋白激酶。许多蛋白磷酸化后功能 发生了改变，大多数会 导致信号转导级联放大和细胞的增殖。我们的结果显示，EGF 刺激后 p120ctn发生了酪氨酸磷酸化，在 浓度为 200ng/ml 作用10min 后，其酪氨酸已开始发 生磷酸化作用，以作用 20min 后最为明显，30min 后又开始减弱。磷酸化后的 p120ctn 的分布 变化和去向目前仍不十分清楚，一般认为， p120ctn 和-catenin一样，当它发生磷酸化后就与 E-cadherin 分离而游离到细 胞浆中，并向核内转移，导致核信号转导的出现 13,14。但两者核信号 转导的结果可能不同
19、，-catenin 核信号转导导致细胞抗凋亡基因和核内转录因子的激活， 细胞增殖加速和肿瘤发生 15。而 p120ctn 核信号转导的作用目前还不清楚，可能起双向调节 作用，而且目前 认为 p120ctn 可以通过抑制 RhoA（Rho-GTP酶）, 激活 Rac 和 cdc42 而对细 胞信号转导产生作用，更 详细 的机制未明 16,17。近来发现，磷酸化后使 p120ctn 胞浆浓度升高，并与一种叫“Kaiso ”的转录 因子结合，已知 Kaiso 是一种甲基化依赖的转录抑制因子 18，但两者在核内 结合后的确切作用也不清楚。我们的结果发现，p120ctn 磷酸化后，BEL-7404 细胞
20、的粘附能力比对照组明显降低，而迁移能力较对照组增强，提示磷酸化是导致细胞恶性倾向发生的一个因素。此外，我们还发现，p120 ctn 磷酸化后在细胞内的分布发生了变化，表 现为胞浆表达显著增强， 许多细胞出现核内转移，即核表达增强，而-catenin 也有相似的变化，提示两者 间可能存在某种联系或-catenin 也发生了磷酸化的结果；因为 有报道，EGF、TGF、 PDGF、HGF-catenin和 CSF-1 等细胞因子均能使-catenin、-catenin 和 p120ctn 高度磷酸化，而 -catenin 和 E-cadherin 磷酸化 较微弱 19。当用酪氨酸磷酸酶抑制剂抑制了该
21、酶的活性后也同样出现Catenin 迅速磷酸化升高且伴发粘附复合物的破坏。反之，当用酪氨酸激酶抑制剂后这种情况得到了改善 20。最近的研究 发现，p120 ctn 磷酸化后影响细胞行为的作用与其跟 E-cadherin的结合状态有关 21。此外，研究还发现，p120 ctn 与-catenin 一样都能与乳腺癌相关糖蛋白-MUC1 粘蛋白结合，促进 p120ctn 核转位的发生 22。BEL-7404 细胞在接受 EGF 刺激后发生明显的形态学改变，表现为细胞伸出了很多“树枝状”伪足，细 胞形态变为细长 而不规则，说明有明显的移 动和游走倾向， 进一步提示了p120ctn 磷酸化后细胞获得了恶
22、性行为，如果从信号转导与细胞恶性行为的关系考虑，因磷酸化而转位到细胞核内的 p120ctn 或许与-catenin 一样起到一种癌基因样作用或别的机制？这有待探明;此外，我们的结果显示，通过 EGF 对 p120ctn 的磷酸化存在着酪氨酸蛋白激酶级联途径，为针对干预这一途径而达到影响 肿瘤细胞生物学行 为的实现得供了可能。参考文献1 Kanner SB,Reynolds AB,Vines RR,et al.Monoclonal antibodies to individual tyrosine-phosphorylated protein substrates of oncogene-enc
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