1、第十章 核酸的生物合成第一节 DNA 的生物合成一、DNA 的半保留复制1、 什么是半保留复制？以 DNA 的两条链为模板，复制时两条链分开，用碱基配对的方式按照单链的 DNA 核苷酸顺序合成新链以组成 DNA 分子，这样新形成的两个 DNA 分子与原来的 DNA 分子的碱基顺序完全相同，每个子代分子的一条链来自亲代 DNA，另一条是新合成的，这种复制方式叫做半保留复制。2、如何证明 DNA 复制是半保留复制？图示：Mathew Meselson 和 Franklin Stahl 在 1957 年设计了一个非常出色的实验证明：（1） 他们把大肠杆菌培养在含有单一氮源 15N 的培养基上培养多代
2、后，DNA 呈重密度；（2） 转移到仅含有 14N 的培养基上增殖一代；（3） 从这些细胞制备的 DNA 在 CSCl 梯度离心中形成一条带，它的密度表明这些DNA 分子为一条含 15N 和另一条含 14N 的杂合链；（4） 让细胞再在 14N 介质中增殖两代，提取的 DNA 在 CSCl 中形成两条带，一条是重、轻的杂和链，另一条为纯轻链。以上实验证明 DNA 复制是半保留的不是全保留的。二、DNA 复制的起始点和方向有几个问题需要解决：（1）复制是从随机点开始的，还是从固定的起始点开始的？（2）完全解开两条链，还是部分解开？（3）方向是朝一个方向还是朝两个方向？解答：（1） DNA 复制是
3、从 DNA 上一个固定点开始的；（2） DNA 复制起始点称为原点；（3） 它的复制从原点开始可双向同时进行，环状 DNA 以方式进行复制；也可以单向进行；（4） DNA 复制是边解链边复制，复制中的 DNA 在复制点呈叉状，这个分叉点称为复制叉。三、DNA 复制是半不连续的（1）以 DNA 为模板，新链合成的方向应该是 5 3； （2）但模板两条链的方向是相反的，那么另一条相反链的方向如何决定？a 冈崎片断：日本学者冈崎及其同事发现，DNA 复制时在复制叉上一条链是连续合成的，另一条新链是以片段的方式合成的，这种复制方式称半不连续复制，这种合成的片断称为冈崎片断。b 连续合成的新链称为前导链
4、，不连续合成的新链称为滞后链。四、DNA 聚合酶大肠杆菌有三种 DNA 聚合酶：DNA 聚合酶 I：活力低、 5 3聚合酶活性、5 3外切酶活性、3 5外切酶活性；DNA 聚合酶 II：活力低、5 3聚合酶活性、3 5外切酶活性；DNA 聚合酶 III：活力高、负责 DNA 链延伸，酶活性同 I。简单介绍一下 DNA 聚合酶 III 全酶，至少含 10 个亚基，为主要成分， 亚基识别引物结合于模板链，一旦全酶结合上去，起始点辅酶就以游离形式释放出来。五、DNA 复制的阶段性大肠杆菌的 DNA 分子复制分为 3 个阶段：起始、延长和终止。1起始（1）有 9 个不同的蛋白和酶参与复制起始DnaA
5、蛋白 识别原点顺序，在特异位点打开 DNA 链DnaB 蛋白（解旋酶） DNA 解旋DnaC 蛋白 辅助 A 蛋白与原点结合HU DNA 结合蛋白，刺激复制起始引物酶（DnaG 蛋白） 合成 RNA 引物单链 DNA 结合蛋白（SSB） 结合单链 DNA，防止再螺旋RNA 聚合酶 促进 DnaA 激活DNA 旋转酶（ToPo II） 解超螺旋Dam 甲基化酶 原点顺序甲基化（2）原料a引物：互补于模板链的一个寡核苷酸片断，它带有一个游离的 3-OH，在 DNA聚合酶作用下与后来的核苷酸形成磷酸二酯键，延长 DNA 链。b模板 DNA 链：指导 DNA 合成的原来的 DNA 单链。c四种脱氧核苷
6、酸：dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP。dMg2+。（3）具体过程：从原点（OriC）开始，DnaA 复合物，在 HU 和 ATP 的参与下，识别原点序列（富含A-T）DnaB 揭开双链 SSB 结合解开的单链旋转酶去除由于解链造成的负超螺旋，起始开始。2延伸引物酶在原点处合成 RNA 引物DNA 聚合酶 III 利用上述原料从 5端加脱氧核苷酸（前导链）合成冈崎片断DNA 聚合酶 I 切下冈崎片断DNA 连接酶连上切口。3终止：当复制叉遇到多拷贝 Ter 顺序时即终止。4DNA 复制的速度是每条链每秒钟加 1000 个核苷酸。六、真核细胞与原核细胞复制的异同点相同点是基本过程相似。不
7、同点在于：（1）真核细胞 DNA 复制有多个起点，由多个复制子共同完成；（2）真核细胞 DNA 复制叉移动速度慢，但总速度快；（3）真核细胞 DNA 有至少 5 种 DNA 聚合酶；（4）真核细胞 DNA 有端粒的合成问题。端粒酶：真核细胞中负责染色体上端粒的合成的酶。七、生物细胞 DNA 复制的基本特点1复制是半保留的；2复制起始于细菌或病毒的特定位置，真核生物有多个原点；3复制可以朝一个方向，也可以朝两个方向进行，后者较常见；4复制时 DNA 两条链都从 5端向 3端延伸；5复制是半不连续的，前导链连续合成，滞后链形成冈崎片断（不连续合成） ，再连接起来；6冈崎片断合成起始于小段 RNA
8、引物后被酶切除，缺口由脱氧核苷酸补满后，再与新生 DNA 链连在一起；7复制有多种机制。八、什么是反转录？什么是转录？中心法则？PCR 技术？（1）反转录：以 RNA 为模板合成 DNA 的过程。（2）转录：以 DNA 为模板合成 RNA 的过程。（3）中心法则：20 世纪 50 年代由 Crick 提出的生物遗传信息传递规律的一种假说。这个假说认为生命中遗传信息的传递是以 DNA 为中心的，分为 3 个过程：第一步是复制，亲本 DNA 拷贝自己，形成有着与亲本 DNA 相同核苷酸顺序的子代 DNA 分子。第二步是转录，各部分编码在 DNA 中的信息被精确的拷贝成 mRNA。第三步是翻译：把编
9、码在 mRNA 上的遗传信息翻译成有特殊氨基酸顺序的蛋白质。中心法则的补充：逆转录（反转录） ，RNA 病毒的 RNA 可通过反转录将遗传信息给cDNA；也可以通过 RNA 复制或转录传给子代 RNA。（4）PCR 技术（聚合酶链式反应， Polymerase Chain Reaction）是一种体外模拟自然 DNA 复制过程的核酸扩增技术，是一种无细胞分子克隆技术。它以待扩增的两条 DNA 链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物介导，通过 DNA 聚合酶酶酶促反应，快速体外扩增特异的 DNA 序列的技术。图示：九、DNA 的损伤与修复 1.DNA 的损伤与突变的损伤与突变（1）损伤可造成突变
10、或致死。突变（mutation）：指一种遗传状态，可以通过复制而遗传的 DNA 结构的任何永久性改变。携带突变基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。（ 2）损伤原因：物理（紫外（见下页）损伤原因：物理（紫外（见下页） 、高能射线、电离辐射）、高能射线、电离辐射） ；化学（烷基化试剂、亚硝；化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）酸盐、碱基类似物） ；生物因素（碱基对置换、碱基的插入；生物因素（碱基对置换、碱基的插入 / 缺失造成移码）缺失造成移码） 。（3）当 DNA 受到大剂量紫外线（波长 260nm 附近）照射时，可引起 DNA 链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如 TT
11、二聚体。2.DNA 损伤修复：光复活、 、重组修复和SOS 修复。 （1）光复活：可见光（最有效波长 400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。是一种高度专一的修复形式，只分解由于 UV 照射而形成的嘧啶二聚体。切除修复：即在一系列酶的作用下，将 DNA 分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使 DNA 恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。细胞的修复功能对于保护遗传物质 DNA 不受破坏有重要意义。重组修复：受损伤的 DNA 在进行复制时，跳过损伤部位，在子代 DNA 链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整
12、的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。SOS 修复：指 DNA 受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种 DNA 修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复第二节 RNA 的生物合成一、 转录基本特点转录基本特点反应体系：DNA 模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+，合成方向 53。连接方式- 3 , 5磷酸二酯键。转录特点：（1）不对称转录：DNA 片段转录时，双链 DNA 中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录。（2）模板链:指导 RNA
13、合成的 DNA 链为模板链，又称反意义 链。（3）编码链：不作为转录的另一条 DNA 链为编码链，又称有意义链。（4）原料：四种磷酸核苷 NTP,DNA 中的 T 在 RNA 合成中变为U。 （5）合成过程:连续，方向：53从头合成,5末端的 起始核苷酸常为 GTP 或 ATP。二、转录和复制的异同点不同：（1）最显著的不同是复制过程中染色体被复制，以产生与亲代 DNA 相同的子代 DNA，而转录是有选择性的，在某个时期只有某个特别基因或一组基因被转录。（2）转录不需引物，它只涉及一个短的 DNA 片断。（3）转录时双链中只有一条链作模板。相同：（1）化学机制，模板使用（2）合成方向相同。（3
14、）阶段都是起始、延伸、终止三、RNA 聚合酶大肠杆菌只有一种 RNA 聚合酶，全酶由 5 种亚基 2w 组成， 因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与 2 分离，没有 、 w 亚基的酶称为核心酶只催化链的延长，对起始无作用。四、具体过程：也包括起始、延伸和终止三个阶段，见 p263 图示。（1）RNA 聚合酶核心酶与结合，帮助识别转录的起始位点；（2）三磷酸核苷加入，转录起始，因子被释放出来，重新开始（）步骤。RNA 聚合酶延着模板滑动中不断加入三磷酸核苷；（3）当延伸到一定程度，NusA 蛋白（终止辅助因子）与 RNA 聚合酶结合，因子结合进入，终止转录；（4）释放出、NusA 和核心酶
15、及转录产物。*原核生物一种酶可转录出三种 RNArRNA、tRNA、 mRNA五、原核生物和真核生物转录过程的不同点：基本过程相似的： 真核生物中转录与复制在不同的区域 RNA 聚合酶不相同 启动子不同 转录后 RNA 加工修饰不同不同点：（1）真核生物的转录机制比原核生物要复杂，特别是起始装配参与的因子较多（2）真核生物有 3 种不同的 RNA 聚合酶，分别负责合成不同类型的 RNA 分子，而原核生物一种 RNA 聚合酶可合成 3 种类型 RNA 分子。RNA 聚合酶 I rRNA（18S、5.8S、28S）RNA 聚合酶 IImRNA 及一些特殊 RNARNA 聚合酶 IIItRNA、rR
16、NA （5S ）及小分子 RNA（3）真核生物 mRNA 转录后产物需加工才能成熟，原核生物 mRNA 不需加工即可进入工作。（4）转录过程的抑制剂也不同原核生物放线菌素 D、丫啶、利福平真核生物放线菌素 D、丫啶、 -鹅膏蕈碱机理：放线菌素 D：使模板变形，扦到 G 三 C 间丫啶：使模板变形，扦到 G 三 C 间利福平：与亚基结合-鹅膏蕈碱：阻断 RNA 聚合酶 II六、什么是转录后加工？三种 RNA 如何加工？（1）转录后加工：在细胞内，由 RNA 聚合酶合成的原初转录物往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和 3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟
17、的 RNA 分子。此过程总称为 RNA 的成熟或称为 RNA 的转录后加工。*原核生物的 mRNA 转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短） 。 （2）真核生物 mRNA 的加工：a在 5端加上“帽子”结构b3端 Poly（A ）尾巴的加入c前体中内含子的剪接（去除）（3）rRNA 前体的加工：rRNA 基因之间以纵向串联的方式重复排列。加工过程：需核酸酶参与的剪切作用、修饰在碱基上的甲基化修饰和核酶的自我剪接作用。原核 rRNA 加工：rRNA 含非转录的间隔区，其产物中含 tRNA真核 rRNA 加工：5S 自成体系加工少无修饰和剪接；45S 加工中含剪切和甲基化修饰，需核酸酶。tRNA 前体的加工：tRNA 前体在 tRNA 剪切酶的作用下，切成一定在小的 tRNA 分子3末端加上 CCA，碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用。
