1、吡喹酮非水溶液注射剂的研制日本血吸虫病治疗试验中国兽医 2003 年 7 月第 23 卷第 4 期 ChinJVetSciJuly2003Vo1.23No.4353吡喹酮非水溶液注射剂的研制日本血吸虫病治疗试验赵俊龙,刘恩勇,李克斌,姚宝安,程方玺.,吴海青.,操继跃,周艳琴(1.华中农业大学畜牧兽医学院,湖北武汉 430070;2.湖北省动物血防站,湖北武汉 430064;3.随州市畜牧局,湖北随州 434000)摘要:刺用本课题组研制的吡喹酮非水溶液注射荆, 分剐进行了小鼠和牛的日本血吸虫病治疗试验.结果表明,感染日本血吸虫的小鼠按每千克体质量 20mg 和 30mg 的剂量肌肉注射吡喹酮
2、的减雌率均达 100,人工感染日本血吸虫的牛按每千克体质量 10mg 和 12mg 的荆量肌肉注射吡喹酮的减雌率均迭 100,每千克体质量 8mg 的荆量的减雌率为 96.41%.自然感染血吸虫病牛按每千克体质量 10mg 的剂量肌肉注射后 30d,粪便转阴率达 9O.5O.这一结果说明,研制的吡喹酮注射荆具有良好的治疗效果.关 t 词:日本血吸虫病;吡喹酮注射荆;牛中圈分类号:S855.9;S859 文献标识码:A 文章编号:10054545(2003)04035302血吸虫病作为一种重要的人畜共患病,在我国流行已久,危害极其严重.近年来,该病疫情又有所回升.流行病学分析证实,耕牛仍是日本血
3、吸虫的主要传染源.因此,耕牛血吸虫病的防治具有重要意义.吡喹酮作为血吸虫病的治疗药物,因其原粉不溶于水,在人医方面通常是制成片剂,口服方便,有效,但该药在耕牛用于口服时,需要剂量大,刺激性强,成本高,且操作不太方便.有关吡喹酮注射剂的应用,国内虽有一些报道,但结果不尽相同1,目前仍没有在临床上大量推广应用.因此,研制安全有效,使用方便的吡喹酮注射剂具有重要意义.近年来,我们通过对多种溶媒的筛选,研制出了新的吡喹酮注射剂.该制剂的药物代谢动力学,生物利用度,稳定性及刺激性试验均取得了理想的结果.在此基础上,我们又成功地进行了该制剂治疗血吸虫病的应用试验.1 材料与方法1.1 试验药物 6 吡喹酮
4、注射液,试验品批号 000610,华中农业大学畜牧兽医学院与湖北省畜牧局联合研制.吡喹酮原粉,含量 98.27,批号 980615,为韩国 SHINPOONG 药物股份有限公司产品.1.2 试验动物1.2.1 小鼠昆明小鼠 4O 只,体重 20g 左右,购自湖北省医学科学院实验动物中心.每只小鼠人工接种日本血吸虫尾蚴 5O 条左右,感染后 28d 备用.1.2.2 人工感染病牛从日本血吸虫病非疫区购买黄牛 18头,临床检查健康,背部剃毛,用新孵出的日本血吸虫尾蚴(900+50)条感染 ,感染后 35d 粪检全部阳性后按性别,体重搭配抽签分组.1.2.3 自然感染病牛在日本血吸虫病疫区用“一血四
5、检“(即血吸虫病,锥虫病,肝片吸虫病,捻转血矛线虫病)诊断试剂盒查出的血吸虫阳性病牛,再用试管倒插一粪三检确诊,经询问 1 个月内未用任何抗寄生虫药物治疗,也无其他传染病及内,外科疾病的耕牛作为试验对象,共筛选试验牛 197 头.收稿日期:20020409基金项目:湖北省重点科技攻关项目(20002P0906)作者介:赵俊龙(1967 一),男,副教授,博士.1.3 感染材料日本血吸虫阳性钉螺 200 只,购自湖南省寄生虫病防治研究所1.4 试验方案1.4.1 血吸虫病小鼠治疗试验人工感染 28d 的 4O 只小鼠随机分为 4 组,每组 1O 只,1,2,3 组分别按每千克体质量1O,2O,3
6、0mg 的剂量肌肉注射吡喹酮注射液,4 组为空白对照组.用药后 1 个月全部断颈处死,冲虫计数.1.4.2 人工感染阳性病牛治疗试验人工感染阳性病牛 18头共分为 6 组,1,2,3 组每组 4 头,分别按每千克体质量 8,1O,12mg 的剂量肌肉注射吡喹酮注射液;第 4 组 2 头 ,按每千克体质量 10mg 剂量静脉注射;第 5 组 2 头,按每千克体质量 30mg 剂量口服吡喹酮粉剂;第 6 组为空白对照组.用药后20d 全部宰杀,非离体冲洗计数观察疗效.1.4.3 自然感染阳性病牛治疗试验自然感染阳性病牛197 头,随机分为 3 组:137 头按每千克体质量 10mg 的剂量颈或臀部
7、肌肉注射吡喹酮注射液;5O 头按每千克体质量 3Omg 的剂量口服吡喹酮原粉;10 头作空白对照.用药后观察临床副反应,并于 15,3O,45d 采粪按“一粪三检“ 用试管倒插法检查毛蚴,观察疗效.2 结果2.1 小鼠治疗试验见表 1.2O,30mg/kg 组的减雌率均达到 100,10mg/kg 组的减雌率为 91.92.2.2 人工感染阳性病牛治疗试验见表 2.肌肉注射和口服治疗的牛用药后均未发现临床副反应,静脉注射的 2 头牛在用药后 1h 有精神沉郁,步态不稳现象.宰杀后剖检,肌肉注射 1O,12mg/kg 剂量组的减雌率均为 100,8mg/kg 剂量组的减雌率为 96.41%;静脉
8、给药组的减雌率仅为 78.26,口服给药组为 100%.2.3 自然感染阳性病牛的治疗试验见表 3.肌肉注射组和口服治疗组病牛 3Od 转阴率分别为 90.5 和 9O,统计学检查二者结果无差异;对副反应的观察结果显示,肌肉注射组有副反应的牛为 23 头,反应率为 16.29;而口服治疗组牛有副反应的为 17 头,反应率为 34,统计学检查二者差异明显.354 中国兽医 2003 年 7 月第 23 卷第 4 期 ChinJVetSciJuly2003Vo1.23No.4组别第 1 次检查第 2 次检查第 3 次检查阳性阴性转阴率/%阳性阴性转阴率/%阳性阴性转阴率/%3 讨论用吡喹酮注射剂治
9、疗动物血吸虫病,国内曾有一些报道,但治疗效果差异很大-l. 本试验用 6%吡喹酮注射剂按每千克体质量 1O,12mg 的剂量肌注,均获得了 100 的减雌率,效果均优于以上报道.我们认为,这与本制剂的生物利用度有关.该制剂所做的药代动力学和生物利用度试验表明,肌注吡喹酮的生物利用度高达 77.93.目前临床上吡喹酮的常用方法是口服给药,口服给药不仅操作麻烦,而且生物利用度低.内服吡喹酮的生物利用度仅为 32.13,因此所需药量就大.大剂量口服用药产生的副反应率就高.静注给药虽然生物利用度最高,但达到血药浓度高峰时间短,药物消除快.静脉注射我们研制的吡喹酮制剂,用药后 1h 即达高浓度,但维持有
10、效浓度时间仅为 4h;而肌肉注射同剂量的吡喹酮,有效浓度维持时间长达 12h 以上.本试验按每千克体质量 1O,12mg 的剂量肌肉注射和 30mg 的剂量口服,减雌率均达 100,静脉注射治疗减雌率仅为78.26,所以静注的治疗效果明显不如肌注和内服.虽然吡喹酮是目前治疗日本血吸虫病的首选药物,但有关该药副作用的报道也很多,并成为许多种吡喹酮注射剂不能推广应用的主要原因之一.如凌孝甫等用吡喹酮注射剂治疗奶牛血吸虫病时,以每千克体质量 20mg 的剂量转阴率只有 57.1,副反应率却高达 27.吡喹酮注射剂副作用产生差别的原因主要来自溶媒的不同.为此,本研究小组对吡喹酮注射剂的溶媒进行了筛选,
11、从临床应用看,副反应率为16.79,仅为口服治疗组副反应率的一半,这一结果还是比较理想的.在自然病例的治疗中,治疗后 30d 检查仍为阳性的病牛多为体重较大的病牛(黄牛 300kg,水牛 400kg 以上).这些病牛试验前粪检每杯毛蚴数一般均在 58 个,而治疗后每杯毛蚴数仅为 13 个,说明治疗还是有效果的,未能转阴的原因可能是药物剂量不够.因此,临床上针对这些体重较大的病牛,是采取重复用药还是加大用药剂量,仍是尚待研究的问题.从本试验结果可以看出,我们研制的吡喹酮注射剂具有很好的杀灭血吸虫作用,临床上按每千克体质量 10mg 的剂量肌肉注射可达理想的结果.该方法不仅操作方便,副反应小,而且
12、用药量低,可以大大降低治疗成本,值得在治疗血吸虫病中进一步推广应用.(本项试验得到了随州市曾都区兽医站的大力支持; 参加本项试验的还有周诗其,罗永香,周煜,何会时,袁对松,许勇,彭又新等,特此致谢)参考文献:1凌孝甫,毛官元 ,张圣虎,等.肌肉注射毗喹酮治疗奶牛的吸血虫病口.中国兽医杂志,1991,3:40.2刘吉海.毗喹酮治疗耕牛血吸虫病疗效观察口.中国兽医杂志,1994,12:10.3胡述光,李景上 ,杨锡玖,等.毗喹酮注射液治疗猪日本血吸虫病试验口.中国兽医杂志,1992,10:16-18.4施福恢,沈纬 ,钱承贵,等.水牛实验血吸虫病的药物效果比较口.中国兽医寄生虫病,1993,2:3
13、034.中国兽医 2003 年 7 月第 23 卷第 4 期 ChinJVetSciJuly2003Vo1.23No.4355小球隐孢子虫 gpl5 基因的克隆与核苷酸序列分析何宏轩,张西臣,欧阳红生,尹继刚,李建华,杨举(解放军军需大学军事兽医系,吉林长春 130062)摘要:为了给小球隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)核酸疫苗的研制提供基因材料,用聚合酶链式反应(PCR)技术,从牛源小球隐孢子虫基因组中扩增了子孢子表面蛋白 CP15 的 gpl5 基因(413bp),然后将其克隆到 pMD18 一 T 栽体中,用 Sangers 双脱氧法对重组质粒中的插入片段进行序列分
14、析.将测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与国外报道的序列进行同源性比较,结果表明核苷酸同源性为 99.2%,氨基酸同源性为1o0.关键词:小球隐孢子虫;gP15 基因;基因克隆;序列分析中图分类号;Q78;$852.723 文献标识码:A 文章编号 ;10054545(2003)04035503小球隐孢子虫(Cryptosporidium 加“m)是隐孢子虫病的主要病原体,它是一种危害严重的人畜共患寄生虫,其可引起腹泻,体重减轻,腹痛和头痛,尤其对幼畜,幼儿及免疫力低下或免疫抑制的个体更容易发生1.自从发现该寄生虫以来,许多研究者一直致力于防治该病的研究,但是至今尚未找到一种行之有效的措施2
15、. 本试验利用 PCR 技术,从牛源小球隐孢子虫基因组中克隆出了 413bp 的 gpl5 基因,并对其进行了核苷酸序列分析,从而为研制隐孢子虫核酸疫苗提供了理想的基因材料.1 材料与方法1.1 卵囊的分离和纯化用本室保存的牛源小球隐孢子虫接种于 1 日龄健康黑白花奶牛,收集其粪便,参照 Serge 等描述的方法,用乙醚去脂法和蔗糖密度梯度离心法分离纯化卵囊收稿日期;20010723基金项目;吉林省杰出青年基金资助项目(2000 年度 )作者筲介:何宏轩(1970 一),男,讲师,博士.现工作单位,河南职业技术师范学院.*通讯作者1.2DNA 提取取纯化小球隐孢子虫卵囊约 11O 个,加入 1
16、0 倍体积的裂解液(100mmol/LNaCI,20mmol/LED TA,20mmol/LTrisHCIpH7.5,2SDS),经反复冻融 3 次(液氮中 5min,23C 水浴 10min),再加入蛋白酶 K(2g/L),56C 水浴 2h 后,用等体积的酚一氯仿一异戊醇(25:24:1)抽提 23 次,吸取水相,加入 1/10 体积的乙酸钠(3mmol/L,pH5.2)和等体积无水乙醇沉淀,一 20C 过夜,12000 g 离心10min,去乙醇,真空抽干加 TE 缓冲液溶解 DNA,4C 保存.1.3 引物的设计和合成根据 GenBank 报道 的 CP15 蛋白基因核苷酸序列(L34
17、568), 设计合成了 1 对 PCR 引物.P1:5 一 GCAGATCTAAGCTCCTTACCATG 一 3;P2:5 一 GGAGATCTTACTTTAGAGGAATG 一 3.该引物跨越了 gpl5 基因的开放阅读框,在 2 条引物上分别设计了限制性酶切位点Bgl以便于克隆.1.4PCR 在 100L 的反应体系中,加引物 P1,P2 各 0.1mol/L(终浓度),dNTPs 各 0.25mmol/L(终浓度),MgCl21.5mmol/L(终浓度),Taq 酶 2U 和适量的模板 DNA,按以下的循环参数在 PCR 扩增仪上孵育:首先在水浴锅上煮沸15min,然后再以 94C3O
18、s 一 4OC5Os 一 72C90s,30 个循环,最后 72C 延伸 10min.扩增产物在 1.5 琼脂糖凝胶上进行电泳.TheDevelopmentofPraziquantelInjectionStudyontheTreatmentofSchistosomiasisJaponicumZHAOJunlong,LIUEnyong.,LIKebin.,YAOBaoan,CHENGFangxi.,WUHaiqing.,CAOJiyue,ZHOUYanqin(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,Huazh0gAgriculturalUniv
19、ersity,Wuhan430070,China;2.InstituteofSchistosomiasisControlofHubeiProvi“f,Wuhan430064,China;3.AnimalHusbandryBureauofShuizhouCity,Shuizh0,Hbei434000.China)Abstract:Thetreatmenttestofmiceandcattleschistosomiasisjaponicumbypraziquantelinjectionwarecarrledout.Theresultsshowedthat:miceinfectedwithSchis
20、tosomajaponicumwereintramusularlyadministratedwithpraziquante1atadoseof20,3Omg/kgbodyweight,allmicewereautopsiedonemonthaftertreatment,allofthetwogroupsgot100fema1ereduetionrate;artificialinfestedcattlewereintramuscularlyadiministratedwithpraziquantelatadoseof8,10,12mg/kgbodyweight,a11cattlewereauto
21、psied20daysaftertreatment,thefemalereductionratesofthegroupatdoseof8mg/kgbodyweightwere96?41,thefemalereductionratesoftheothergroupwereall100;naturalinfestedcattlewereintramuscu1ar1vadiministratedwithpraziquante1atadoseof10mg/kgbodyweight,theretronegativeratewas90.50thirtydaysaftertreatment.Keywords:schistosomiasisjaponicum;praziquantelinjection;cattle
