1、高选择性半胱氨酸荧光探针的合成及生物成像 杨志广 冯灿灿 彭鹏 武文 田明刚 周口师范学院化学化工学院 山东大学晶体材料国家重点实验室 摘 要： 生物巯基分子在人体生理和病理过程中发挥着重要作用。因此, 专一性识别生物巯基分子在生命科学领域具有非常重要的应用价值。我们利用醛基作为巯基识别基团进行成环反应, 合成了一种新型的荧光增强型半胱氨酸 (Cys) 荧光探针, 其结构用核磁共振氢谱、质谱以及红外光谱进行表征。该探针分子具有合成简单、选择性好、光稳定性好等优点, 本身无色, 无荧光, 与 Cys 作用后, 紫外吸收光谱蓝移约 15nm, 荧光强度增强 105 倍, 荧光颜色由无色变为深蓝色,
2、 可实现裸眼观测且能进行活细胞成像。关键词： 半胱氨酸; 荧光探针; 合成; 选择性; 成像; 作者简介：杨志广, 男, 博士, 讲师, 研究方向为有机功能材料和无机纳米材料.E-mail:收稿日期：2017-03-17基金：河南省高等学校重点科研项目 (No.15A430055) Synthesis and Biological Imaging of Highly Selective Fluorescent Probe for CysteineYANG Zhi-guang FENG Can-can PENG Peng WU Wen TIAN Min-gang College of Chemi
3、stry and Chemical Engineering, Zhoukou Normal University; State Key Lab of Crystal Materials, Shandong University; Abstract： Biothiols play an important role in the physiological and pathological processes.Therefore, the specific discrimination of biothiols in biological samples is of great importan
4、ce in life sciences.In this work, a novel fluorescene-enhanced probe for cysteine was synthesized successfully and then characterized by means of 1H NMR, MS and IR.The probe showed many advantages including easy synthesis, good selectivity and high photostability.The free probe was colorless and non
5、-fluorescent.An apparent color change from colorless to deep blue was observed upon addition of Cys with a15 nm blue-shift in absorption spectra and 105-fold fluorescence intensity enhancement, which can serve as a “naked-eye“ probe for Cys and achieve good imaging in living cells.Keyword： Cysteine;
6、 Fluorescent probe; Synthesis; Selectivity; Imaging; Received： 2017-03-17生物体内半胱氨酸 (Cys) 、高半胱氨酸 (Hcy) 、谷胱甘肽 (GSH) 等许多含巯基生物分子在体内生理与病理过程中发挥着关键性作用。例如, 人体中缺乏Cys 会引起肝脏受伤、皮肤松弛、身体浮肿和毛发褪色等病症1-3;而 Hcy 含量的增高则会引起老年痴呆症、动脉硬化、神经中枢缺陷和骨质疏松等疾病4-5;GSH 则与人体中的氧化还原动态平衡密切相关6-7。因此, 定量、专一性检测细胞内生物巯基分子对于人体疾病的预防、诊断和治疗具有非常重要的指导
7、意义。荧光分析法相对于高效液相色谱法8、电化学法9、质谱法10、毛细管电泳法11等检测方法, 具有操作简单、选择性好、灵敏度高以及可视化观测等优点12-14, 在检测生物巯基分子方面得到了广泛的关注和应用。图 1 探针 C1 结构式 Fig.1 Structure of C1probe 下载原图本文根据醛基与巯基、氨基官能团共同作用合成了一种新型的, 利用醛基识别生物巯基分子的荧光探针 C1, 探针 C1 结构式如图 1 所示。该探针本身无荧光, 与 Cys 作用后, 荧光强度迅速增强且溶液颜色由无色变为深蓝色, 实现了对Cys 的专一性识别和裸眼检测。1 实验部分1.1 主要仪器与试剂Bru
8、ker Advance 300 型核磁共振谱仪 (瑞士, 布鲁克公司) ;Nexus 670 型红外光谱仪 (美国, 尼高力公司) ;6510 型 Q-TOF 质谱仪 (美国, Agilent 公司) ;Cary50 型紫外可见吸收光谱仪 (美国, 瓦利安公司) ;HITACH F-4500 型单光子荧光光谱仪 (日本, 日立公司) 。咔唑 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) ;N-溴代丁二酰亚胺 (NBS) (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) ;4-乙酰氧基苯乙烯 (分析纯, 百灵威化学技术有限公司) ;氨基酸 (分析纯, 日本株式会社生物试剂公司) 。水为去离子水。1.2 探针 C
9、1 的合成与表征1.2.1 9-乙基咔唑的合成将一定量的 KOH 粉末和咔唑加入到丙酮中, 室温搅拌数小时后, 加入含有 1-溴乙烷的丙酮溶液, 反应过夜。经水洗, 过滤, 乙醇重结晶等过程, 得到白色的固体, 产率:83%。1H NMR (300 MHz, CDCl3) , (ppm) :8.10 (d, J=7.8 Hz, 2H) , 7.397.44 (m, 4H) , 7.207.25 (m, 2H) , 4.36 (q, J=7.2Hz, 2H) , 1.43 (d, J=7.2Hz, 3H) 。1.2.2 3-甲酰基-9-乙基咔唑的合成在 250mL 圆底烧瓶中, 加入 1.86m
10、L DMF, 冷却至 0, 逐滴加入 2.3mL POC13, 再加入溶有 4.88g 9-乙基咔唑 (25mmol) 的 CHC13溶液, 加热回流 20h。蒸出CHC13, 倒入水中, 调节 pH 至 78 左右, 用 CH2Cl2进行萃取, 用水、饱和 NaCl溶液洗涤, 无水 MgSO4干燥过夜, 过滤, 蒸出溶剂, 粗产品用石油醚乙酸乙酯 (101) 作淋洗液, 经柱色谱分离得到黄色固体, 产率:87%。H NMR (300MHz, CDCl3) : (ppm) 10.10 (s, 1H) , 8.61 (s, 1H) , 8.16 (d, J=7.8Hz, 1H) , 8.01 (
11、dd, J1=8.4Hz, J2=1.5Hz, 1H) , 7.477.57 (m, 3H) , 7.267.35 (m, 1H) , 4.40 (q, J=7.2Hz, 2H) , 1.47 (t, J=7.4Hz, 3H) 。1.2.3 3-甲酰基-6-溴-9-乙基咔唑的合成在 100mL 三口烧瓶中, 加入 2.2g 3-甲酰基-9-乙基咔唑 (9.85mmol) 和 60mL CHC13HAc 混合溶液 (11, V/V) , 氩气保护下, 加入 1.9g NBS (10.67mmol) , 室温搅拌反应 20h, 倒入冰水中, 用 CH2Cl2进行萃取, 水洗, 无水 MgSO4干燥
12、过夜, 过滤, 蒸出溶剂, 粗产品用石油醚乙酸乙酯 (101) 作淋洗液, 经柱色谱分离得到白色固体, 产率:81%。H NMR (300 MHz, CDCl 3) : (ppm) 10.10 (s, 1H) , 8.56 (d, J=1.2Hz, 1H) , 8.27 (d, J=1.8Hz, 1H) , 8.05 (dd, J1=8.6 Hz, J2=1.5Hz, 1H) , 7.62 (dd, J1=8.7Hz, J2=1.8Hz, 1H) , 7.49 (d, J=8.4Hz, 1H) , 7.35 (d, J=8.7Hz, 1H) , 4.4 (q, J=7.3Hz, 2H) , 1
13、.47 (t, J=7.4Hz, 3H) 。1.2.4 探针 C1 的合成在 100mL 三口烧瓶中, 加入 0.9g 3-甲酰基-6-溴-9-乙基咔唑 (3mmol) 、33.67mg 乙酸钯 (0.15mmol) 、91.31mg 三邻甲苯基膦 (0.3mmol) 和 30mL DMF, 室温搅拌 30min。然后加入 0.91mL 4-乙酰氧基苯乙烯 (6mmol) 和 1mL 三乙胺, 氩气保护下, 加热至 120, 反应 3d。倒入水中, 再用 CH2Cl2进行萃取, 水洗, 无水 MgSO4干燥过夜, 过滤, 蒸出溶剂, 粗产品用 CH2Cl2作淋洗液, 经柱色谱分离得到黄色固体,
14、 产率:35%。IR (cm) :1 671 ( C=O) , 1 755 ( C=O) 。H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) , (ppm) :10.08 (s, 1H) , 8.80 (d, J=1.2 Hz, 1H) , 8.57 (s, 1H) , 8.02 (dd, J=8.55 Hz, 1H) , 7.797.83 (m, 2H) , 7.73 (d, J=8.4Hz, 1H) , 7.647.69 (m, 2H) , 7.327.45 (m, 2H) , 7.147.18 (m, 2H) , 4.53 (m, 2H) , 2.29 (s, 3H) , 1.36 (
15、t, J=7.2 Hz, 3H) 。HRMS (m/z) :C 25H21NO3M+H计算值为 383.15, 测定值为 384.18。2 结果与讨论2.1 探针 C1 紫外吸收和滴定光谱分析固定探针 C1 浓度为 10mol/L, Cys 浓度为 01.010mol/L, 激发波长为347nm, 在甲醇中进行吸收光谱紫外和荧光滴定实验。由图 2 (a) 可知, 随着Cys 浓度的增加, 探针 C1 的紫外吸收峰在 347nm 左右逐渐消失, 而在 332nm 处有一新峰出现, 蓝移 15nm 左右, 同时在 346nm 和 324nm 处各出现一个等吸收点 (图 2 (a) ) , 表明探针
16、 C1 与 Cys 发生了反应, 生成了一种新的物质。根据荧光滴定结果, 探针 C1 本身没有荧光, 荧光强度逐渐增强 (图 2 (b) ) , 当 Cys浓度为 600mol/L, 荧光强度增强 105 倍, 说明探针 C1 是一种良好的检测 Cys荧光增强型探针。另外, 探针 C1 在最大发射波长处的荧光强度与 Cys 的浓度存在一定的线性关系, 线性范围为 20100mol/L, 荧光检出限 (S/N=3) 15为5mol/L。图 2 探针 C1 的紫外吸收 (a) 和荧光滴定 (b) 光谱 Fig.2 UV absorption (a) and fluorescence titrati
17、on (b) spectra of probe C1 下载原图2.2 探针 C1 的选择性分析固定探针 C1 的浓度为 10mol/L, 其它相关生物分析物浓度均为 600mol/L, 激发波长为 347nm。由图 3 可见, 在甲醇中加入 Cys 后, 探针 C1 的紫外最大吸收峰蓝移 15nm 左右, 荧光强度显著增强, 而加入 Hcy、GSH 等其它生物分析物后, 紫外吸收和荧光光谱几乎没有变化, 说明探针 C1 对 Cys 具有较高的选择性。另外, 在自然光下溶液颜色均为无色 (图 4 (a) ) , 但在紫外灯 ( ex=365nm) 下, 只有加入 Cys 溶液颜色呈深蓝色 (图
18、4 (b) ) , 其它溶液颜色没有发生变化, 表明探针 C1 可以作为检测 Cys 的裸眼探针。图 3 探针 C1 加入各种生物分析物前后的紫外吸收 (a) 和荧光 (b) 光谱 Fig.3 UV absorption (a) and fluorescence (b) spectra of probe C1 (10mol/L) in the presence of 60equiv diverse bioanalytes 下载原图图 4 探针 C1 加入各种生物分析物前后的自然光照片 (a) 和紫外灯下 (ex=365nm) 照片 (b) Fig.4 The photos of probe C
19、1 (10mol/L) in the ab-sence and presence of 60equiv diverse bioanalytes under natural light (a) and UV light (b) (ex=365nm) 下载原图From left to right, then from top to bottom:C1, Cys, Hcy, GSH, Arg, Asn, Asp, -ala, DTT, Gln, Glu, Gly, His, Ile, L-ala, Leu, Lys, Met, NAC, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, V
20、al.2.3 反应时间对体系荧光强度的影响固定探针 C1 的浓度为 10mol/L, Cys、Hcy 和 GSH 的浓度均为 600mol/L, 激发波长为 347nm。由图 5 可见, 在甲醇中加入 Cys 后, 探针 C1 的荧光强度在110min 内显著增强并达到最大, 随着时间的延长, 荧光强度逐渐降低, 但降低幅度较小。因此, 探针 C1 与 Cys 的最佳反应时间为 10min。而探针 C1 本身以及与 Hcy、GSH 作用后的荧光强度很弱且在 1h 内几乎保持不变, 表明探针 C1与 Cys 作用后生成的强荧光物质具有较高的光稳定性。2.4 探针 C1 的细胞成像将浓度为 5mo
21、l/L 的探针 C1 分子在 37孵育细胞 0.5h, 用 PBS 洗三遍。将接种好细胞的玻片用 PBS 洗三遍, 室温下在 5mol/L 的 C1 溶液中染色 0.5h, 用488nm 氩离子激光进行扫描, 经滤色片滤色后收集探针分子成像的荧光信号。成像结果如图 6 所示, 结果表明, 探针 C1 具有较好的细胞渗透性, 能进入活细胞, 并且得到了清晰的蓝色荧光照片。图 5 反应时间对探针荧光强度的影响 Fig.5 Effect of reaction time on fluorescence intensity of probe 下载原图图 6 探针 C1 的宽场成像 Fig.6 Wide
22、-field image of probe C1 下载原图3 结论以咔唑为原料, 利用亲核取代反应、Vilsmeier 反应和 Heck 反应等简单的有机化学反应, 合成了一个荧光增强型半胱氨酸探针, 并通过核磁、质谱和红外光谱等对探针结构进行了表征。该探针具有合成简单、选择性好和光稳定性好等优点, 对半胱氨酸具有高度的选择性, 可进行裸眼分辨和活细胞成像, 在生物医学领域具有广阔的应用前景。参考文献1Zhang H T, Liu R C, Liu J, Li L, Wang P, Yao S Q, Xu Z T, Sun H Y.Chemical Science, 2016, 7 (1) :
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