1、口蹄疫病毒亚单位与宿主细胞凋亡的研究进展中国兽医科学 2008,38(08):728732ChineseVeterinaryScience中图分类号:S852.659.6 文献标识码:A 文章编号:1673 4696(2008)08072805口蹄疫病毒亚单位与宿主细胞凋亡的研究进展丛国正,沈小燕,邵军军,独军政,林彤,刘萍,周建华,常惠芸,谢庆阁(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室国家 t=l 蹄疫参考实验室,甘肃兰州 730046)摘要:通过对口蹄疫病毒和其他小 RNA 病毒的蛋白质功能研究进行总结 ,分析了口蹄疫病毒蛋白参与调控宿主
2、细胞凋亡平衡的作用,并对口蹄疫病毒持续感染形成的机制进行了探讨.关键词:口蹄疫病毒;亚单位;宿主细胞;凋亡;进展Advancesinsubunitoffoot-and-mouthdiseasevirusandhostcellapoptosisCONGGuozheng,SHENXiaoyan,SHAOJun-jun,DUJunzheng,LINTong,LIUPing,ZH()UJianhua,CHANGHuiyun,XIEQingge(NationalFootandMouthDiseaseRefefenceLaboratory/KeyLaboratoryofAnimalVirologyofth
3、eMinistryofAgricultureStateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBi00gyLnnhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China)Abstract:Thisarticlesummarizedtheprogressesintheproteinfunctionoffootandmouthdiseasevirus(FMDV)andotherpicornaviruses,andanalyzedtheroleofFM
4、DVproteininregulatinghostcellapoptosishomeostasis,anddiscussedthemechanismofFMDVpersistenceinfection.Keywords:footandmouthdiseasevirus;subunit;hostcell;apoptosis;advances口蹄疫病毒(foot andmouthdiseasevirus,FMDV)感染宿主会引起感染细胞迅速崩解死亡,具有强烈的致细胞病变效应.FMDV 感染与宿主细胞死亡的关系尚未完全阐明,为了最终有效地控制口蹄疫还需要了解病毒蛋白和宿主细胞间错综复杂的相互关系,阐
5、明其病理学机制.FMDV 非结构蛋白的结构和功能比较保守,这暗示了它们可能参与调节宿主细胞的凋亡平衡.对其他小 RNA 病毒的病毒蛋白与宿主细胞相互作用的研究发现,病毒蛋白参与宿主细胞的凋亡,推测 FMDV 与宿主细胞蛋白的相互作用可能是其致病的原因之一.FMDV属于小 RNA 病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus),病毒粒子由 1 条 RNA 单链和各 60拷贝的 4 种结构蛋白组成 140S 的病毒颗粒.FM DV 基因的组成与其他小 RNA 病毒科成员基本相似.1 个 2324 个氨基酸大小的基因连接蛋白VPg 以共价键连接在基因组 5 端.FMDV
6、RNA 有1 个长的开放阅读框(ORF),可被翻译成 1 条多聚蛋白,经一系列蛋白水解酶裂解为 14 个成熟蛋白.基因组组成为:5 端非编码区;前导蛋白 L 编码区,编码多聚蛋白的氨基端部分,其中包含 2 个 AUG起始密码子,可生成 2 种形式的 L 蛋白,即 Lab 和Lb;L 编码基因下游是 P1 区,主要编码 4 种结构蛋白 VP1,VP2,VP3 和 VP4;P1 之后是 P2 区,编码3 种非结构蛋白 2A,2B 和 2C;接着是 P3 区,编码非结构蛋白 3A,3B,3Cp 和 3Dm.历来认为 2A 是P2 的组成部分 ,但研究证实 FMDV2A 短肽是从P12A 前体上裂解下
7、来的.3Cm 是一种病毒蛋白酶,主要参与病毒多聚蛋白的裂解;3Er 是病毒 RNA依赖性 RNA 聚合酶,负责病毒 RNA 的复制 J.L,2A 和 3C 蛋白作为蛋白水解酶发挥功能,与宿主细胞蛋白协同调节病毒与宿主的共生关系.收稿日期:20080228;修回日期:20080724基金项目:国家重大基础研究发展计划(973)项目(2005CB523201)作者简介:丛国正(1977 一),男,山东昌乐人,助理研究员,博士,研究方向为病毒分子生物学.*通讯作者,研究员,Tel:09318342587,E-mail:changhuiyun126.corn第 8 期丛国正等:口蹄疫病毒亚单位与宿主细
8、胞凋亡的研究进展 7291FMDV 蛋白对宿主细胞凋亡平衡的影响病毒是一类寄生于宿主细胞的病原体,它的复制会影响宿主细胞的正常生理代谢,包括干扰细胞凋亡,以达到病毒与细胞的共存状态.在病毒感染早期,病毒需要抑制宿主细胞凋亡以完成其复制,生成子代病毒;而在病毒感染后期,病毒又需要宿主细胞凋亡崩解释放子代病毒,使子代病毒扩散感染周围细胞组织,这在脊髓灰质炎病毒_4 上已得到证实.DNA 片段化研究和 TUNNEL(terminaldeoxynueleotidyltransferasemediateddUTPbiotinnickendlabeling)染色表明 ,FMDV 能诱导宿主细胞凋亡_5J6
9、_.要明确病毒感染调控宿主细胞死亡的机制 ,有必要深入了解病毒功能蛋白和宿主蛋白间的相互作用.1.1L 蛋白并非所有小 RNA 病毒都有 L 蛋白,而且其核苷酸序列差异很大.FMDV 的 L 蛋白具有蛋白水解酶活性,可以催化半胱氨酸和组氨酸之间的多肽分解,通过裂解翻译起始因子如 eIF4GI 和 eIF4G来抑制帽子依赖性蛋白的翻译.这种对宿主蛋白合成的抑制可反过来促进病毒蛋白的合成,同时下调宿主免疫监视系统中反应蛋白干扰素的合成嘲.已证实鼠脑心肌炎病毒(murineeneephalomyoearditisvirus,MEV)L 蛋白可以干扰核一细胞质转运_g,改变与凋亡平衡有关蛋白的亚细胞定
10、位,如NF 一-cB.MEV 起始密码子的改变可产生突变的小I 蛋白, 已证实这种小 L 蛋白可通过阻止细胞毒性T 淋巴细胞的活化来抑制宿主细胞的凋亡.FMDVL 蛋白有 2 个起始密码子,两密码子之间相隔 81 个核苷酸.研究表明,第 1 个起始密码子突变可以使病毒毒力致弱,但仍保持感染性;第 2 个密码子突变能使病毒失去感染力,也就是说第 2 个起始密码子的存在与病毒的感染性密切相关.可以推断,FMDV 在复制过程中能够编码这种小 L 蛋白,而且这种小 L 蛋白在病毒复制过程中发挥重要的作用,但它在抑制宿主细胞凋亡中是否发挥作用尚需进一步研究.1.2 结构蛋白 P1FMDV 衣壳由 P1
11、区编码的 4 种结构蛋白VP1,VP2,VP3 和 VP4 各 60 分子组装成正二十面体结构,其中 VP2,VP3 和 VP1 呈楔形位于衣壳表面,VP4 位于衣壳内部.研究证实,FMDV 通过其衣壳蛋白 VP1 上的“RGD“ 基序结合细胞表面受体后诱导宿主细胞的凋亡_1.用重组表达的 VP1 蛋白处理 BHK 一 21 细胞,能够活化 AKT 途径,导致糖原合成激酶一 3 去磷酸化,裂解 easpase-3,7,9 等.虽然抗 VP1 和 VP2 的单克隆抗体能够抑制由完整病毒粒子诱导的凋亡,但由 VP1,VP2 和 VP3 组成的衣壳蛋白却不能诱导宿主细胞凋亡_1.研究发现,虽然 VP
12、1 可以诱导 BHK 一 21 细胞凋亡,但是FMDV 的完整衣壳蛋白却不能诱导该细胞凋亡_1.因此,VP2,VP3,VP4 蛋白对宿主细胞的作用还有待进一步研究.已证实 MEV 的 GDV可通过活化 TRAIL 和 TNF 受体而诱导宿主细胞凋亡.通过酵母双杂交试验发现,柯萨奇病毒 B3 的 VP2 可以与 Siva 相互作用,Siva 是一种受 p53 和 E2F 转录因子 1 作用的凋亡蛋白前体引,这种相互作用可以通过 caspase 的活化诱导凋亡 ,导致 poly-ADPribosepolymerase(PARP)的裂解(一种重要的 DNA修复酶),DNA 片段化和核浓缩.迄今还未发
13、现小RNA 病毒 VP4 蛋白和凋亡机制之间有任何关联.1.3 非结构蛋白 P21.3.12AFMDV2A 蛋白仅有 16 个氨基酸,能够从 Pl 一 2A 上自我裂解 ,它能裂解其他非结构蛋白P2,P3 成为成熟功能蛋白.2A 蛋白是小 RNA 病毒一个具有较大功能和结构差异的区域.如肠道病毒(enterovirus,EV)2A 蛋白是一种蛋白酶,而口蹄疫病毒属的 2A 蛋白就没有这种蛋白裂解功能.一些小 RNA 病毒如 MEV 和脊髓灰质炎病毒的 2A 蛋白与 FMDV 的 L 蛋白具有某些相似功能.直接突变 MEV2A 蛋白编码基因后发现,2A 蛋白对病毒在体外的复制不是必需的,但对保持
14、体内的病毒毒力是必不可少的_1.在经典的凋亡诱导过程中,easpase-3 通过裂解 eIF4GI 和 eIF2A 来抑制宿主的帽子依赖性蛋白的翻译.FMDV 也采用相似的策略,在感染细胞中 L 蛋白协同细胞内蛋白酶(但不依赖 easpase)抑制宿主细胞的翻译过程,直接或间接地裂解 eIF4GI173.同样,脊髓灰质炎病毒和鼻病毒的 2A 蛋白也通过不依赖于 caspase 的参与方式裂解 eIF4G_l 引.研究证实,脊髓灰质炎病毒 l1,肠道病毒_2,鼻病毒和柯萨奇病毒妇的 2A蛋白都能诱导宿主细胞凋亡.因此,在小 RNA 病毒中具有完整蛋白酶功能的 2A 在病毒诱导的凋亡中具有重要作用
15、,这为研究 FMDV 同样功能的 L蛋白酶与宿主细胞的关系提供了新的思路.1.3.22B 和 2BC 前体 FMDV2B 蛋白诱导小泡形成,有利于病毒的释放.研究表明,在 FMDV感染过程中,2B 蛋白定位于内质网.2BC 复合体蛋73O 中国兽医科学第 38 卷白在细胞质内呈点状着色,并能使内质网蛋白在核周围聚集.同时,FMDV2BC 蛋白还可以抑制糖蛋白从内质网到细胞膜表面的转运,从而扰乱正常的分泌途径.研究证实口.,脊髓灰质炎病毒 3A 也能改变内质网到高尔基体的转运,通过抑制 IL-6,IL 一 8,IFN-fl 的产生以逃避宿主的免疫系统,因而推测具有相似功能的 FMDV2BC 蛋白
16、可能在反刍动物的持续感染和免疫逃避中发挥重要的作用.酵母双杂交试验证实,柯萨奇病毒和脊髓灰质炎病毒的 2B 可以自我聚合,荧光共振能量传递分析(FRET)发现,2B 能形成二聚体和四聚体引.这些发现确证了 2B 的作用如同病毒性的孔道蛋白,通过形成膜通道,改变细胞膜对离子的通透性,最终在病毒感染过程中裂解高尔基体复合体.这些通道的通透性具有可调控性,如表达脊髓灰质炎病毒的2BC,可以增强 2B 的膜通道功能2,而不能分开表达 2B 和 2C,这说明形成膜通道过程的复杂性.此外,表达柯萨奇病毒 2B 蛋白可以降低在内质网,高尔基体和线粒体间的 Ca 信号,使 Ca 渗漏至细胞质中,同时引起细胞外
17、 Ca 的渗入2,从而抑制宿主细胞的凋亡,该机制目前尚不清楚.1.3.32CFMDV 的 2C 蛋白是一个高度保守的多功能蛋白,它可以结合至细胞膜和 RNA 上.2C可以结合到复制中间体的负链 3 端,对病毒复制至关重要.禽脑脊髓炎病毒的 2C 可以在鸡胚细胞和COS-7 中通过细胞色素 C,caspase-9 途径诱导细胞凋亡 L2,但对 FMDV2C 在此途径中的作用尚无研究 .1.4 非结构蛋白 P31.4.13A 在 FMDV 感染过程中 ,3A 蛋白定位于核周围,已证实 3A 在病毒的宿主嗜性方面起重要作用,3A 点突变可以导致 FMDV 适应新的宿主2.FMDV3A 蛋白不具有脊髓
18、灰质炎病毒 3A蛋白抑制转运的功能,点突变脊髓灰质炎病毒 3A构建的基因工程病毒不但能够诱导 HeIa 细胞死亡,又可诱导 Vero 细胞死亡.另外,禽脑脊髓炎病毒 3A 蛋白在内质网的积聚可引起细胞膜通透性改变31,通过释放钙池内的钙离子来调控细胞凋亡的平衡.脊髓灰质炎病毒 3A 蛋白还可以通过消除TNF 受体来抑制由 TNF 诱导的凋亡_2.1.4.23B(VPg)FMDV3B 蛋白即 VPg,它以共价键结合于病毒 RNA 的 5 端,在病毒基因组复制的过程中起引物的作用,是病毒复制的重要调节元件,没有结合 3B 的病毒基因组不能复制.FMDV3B 蛋白不能直接诱导宿主细胞死亡,但 3B
19、和 3AB前体对病毒的宿主嗜性非常重要.分析 FMDV 的3B 缺失突变体发现,3B 的拷贝数与病毒的病理学特性和嗜性直接相关,提示 3B 具有调控 3A 功能的作用.1.4.33C,3CD 前体和 3DFMDV3C 蛋白酶是将多聚蛋白裂解为功能单体的主要蛋白酶,属于胰蛋白酶家族,并且它可以裂解细胞内的真核翻译起始因子 elF4A 和 elF4G,以抑制宿主细胞的蛋白合成.在 FMDV 的复制组装过程中,3C 蛋白酶作为3CD 融合蛋白瞬时存在,然后自我裂解为 3C 和3D.病毒组装过程中的中间产物 3CD 是一种具有特定功能的稳定产物.在病毒的复制过程中,早期抑制细胞凋亡有利于病毒的复制组装
20、,而后期促进凋亡则有利于病毒粒子的释放.因此,需要病毒蛋白在病毒复制的不同阶段以不同的方式调控宿主细胞凋亡,而 3CD 蛋白到 3C 蛋白的裂解,其中间产物的稳定性和潜在的功能易变性暗示了它们可能在改变宿主细胞凋亡平衡中发挥重要作用.在小 RNA 病毒家族中,3C 的功能是很保守的.脊髓灰质炎病毒 3C 蛋白酶介导 TATA 结合蛋白裂解,从而导致 caspase 依赖性的细胞凋亡 l3 引,发生 DNA 裂解和 PARP 裂解 l3.肠道病毒 71 的3C 蛋白也能诱导人神经元细胞 caspase 依赖性的凋亡,这可以通过 PARP 的裂解检测到.对脊髓灰质炎病毒,肠道病毒 1,鼻病毒 14
21、 的 3C 蛋白功能的研究表明,它可以裂解 NFB 中的 p65 一 RelA,从而阻断 NF-B 依赖性的先天免疫反应口.据此推测FMDV 的 3C 蛋白也可以诱导宿主细胞凋亡,笔者的研究结果也已证实 FMDV 的 3C 蛋白具有诱导BHK 一 21 细胞凋亡的功能,但其分子机制尚不清楚.3C 蛋白的酶活性可以被 2C 蛋白的丝氨酸蛋白酶活性所调控,这可能是病毒调控宿主细胞凋亡的手段之一.肠道病毒3 和脊髓灰质炎病毒3 的 3C 裂解poly(A)结合蛋白 ,打乱了与 poly(A)结合蛋白相关的真核起始因子 4B,从而抑制了内源性 mRNA 的翻译.脊髓灰质炎病毒的 3C 能够裂解转录因子
22、Oct 一 1l4.和 cAMP 反应元件结合蛋白41J.在细胞质中若通过裂解转录因子来抑制蛋白合成,就会导致典型的依赖线粒体的细胞凋亡,因此推测 3C 蛋白能够诱导细胞凋亡也是顺理成章的.FMDV3D 蛋白是 RNA 依赖性的 RNA 聚合酶,主要负责病毒 RNA 的复制,但它没有特定的校正能力.因此,FMDV 基因组在复制过程中发生突变的概率非常大.至今尚未见有关 3D 蛋白在调控宿主细胞凋亡方面的报道.3D 蛋白含有核定位信第 8 期丛国正等:口蹄疫病毒亚单位与宿主细胞凋亡的研究进展 731号,可以诱导 3CD 至核内的转运.3CD 比 3C裂解 QG 位点的效率高 i001000 倍_
23、4,3CD 可能直接裂解转录因子或核内加工 3CD 产生 3C 来完成 3C 介导的转录因子裂解,同时细胞核内裂解3CD 产生 3C 可以裂解 TATA 结合蛋白,导致细胞内转录的全面抑制.因此,3CD 的核内定位可以裂解核定位的转录因子和 TATA 结合蛋白,从而改变宿主细胞的转录.裂解核定位蛋白和转录因子以及全面抑制细胞内转录可能有利于病毒持续感染.据此推测 3D 作为 3C 的分子伴侣导致 3CD 和 3C 不同的定位,而3CD 和 3C 在感染细胞内的平衡就像一个功能开关控制着病毒持续感染与宿主细胞凋亡.由此推断,3C 介导的细胞质内的蛋白裂解可能导致细胞死亡,而 3CD 在核内介导的
24、宿主蛋白的裂解可能导致病毒持续感染.2 问题和展望FMDV 病理学是以病毒杀伤细胞的能力为基础的,遗憾的是这种死亡机制尚不清楚,但其感染细胞引起死亡的一种潜在机制是凋亡.了解 FMDV如何调控宿主细胞凋亡平衡对控制病毒传播和治疗至关重要.通过整理 FMDV 和与之相关的小 RNA病毒家族的蛋白功能研究结果,阐述了 FMDV 蛋白在控制宿主细胞凋亡平衡中的作用,以期对 FMDV感染和细胞死亡的关系有进一步的了解.例如依据脊髓灰质炎病毒和肠道病毒 3C 诱导宿主细胞凋亡的研究结果,预测 FMDV3C 蛋白是一种凋亡蛋白,这在笔者的研究中已得到了验证.以这种方式对FMDV 蛋白功能进行推测固然存在某些风险,需要进一步的验证,但这种预测可使研究问题更加有指向性,并能缩小研究范围.基于这种功能预测,笔者提出了 FMDV 持续感染产生机理的一种假说,即3D 作为分子伴侣导致 3C 和 3CD 蛋白的不同亚细胞
