1、桦木酸纳米粒的制备与表征 吴铭芳 许文佳 祖元刚 赵修华 东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室 摘 要： 目的:制备桦木酸纳米粒, 并对其进行表征。方法:以乙醇为溶剂、水为反溶剂, 采用反溶剂重结晶法制备桦木酸纳米粒。以粒径为指标, 采用单因素试验与正交试验优化桦木酸纳米粒处方工艺中桦木酸溶液质量浓度、反溶剂-溶剂体积比、反溶剂滴加速度、反应温度和搅拌速度, 并进行验证试验。采用扫描电子显微镜、激光粒度仪、傅里叶红外光谱仪和质谱分析仪对所制得的桦木酸纳米粒进行表征。结果:最优处方工艺为桦木酸溶液质量浓度为 3 mg/mL、反溶剂-溶剂体积比为 1:1、反溶剂滴加速度为 8 mL/min、
2、反应温度为 20、搅拌速度为900 r/min;所制桦木酸纳米混悬液粒径为 (156.08.6) nm (n=3) , 冻干后粒径为 (235.012.2) nm (n=3) , 外观近球形、大小均匀、形态较规整;与桦木酸原料药比较, 所制桦木酸纳米粒的化学结构没有发生改变, 分子量和质荷比无明显变化。结论:成功制得桦木酸纳米粒。关键词： 桦木酸; 纳米粒; 反溶剂重结晶法; 单因素试验; 正交试验; 表征; 作者简介：吴铭芳, 博士研究生。研究方向:植物化学与植物药。E-mail:作者简介：赵修华, 教授, 博士。研究方向:药物新剂型。E-mail:xiuhua-收稿日期：2017-03-2
3、5Preparation and Characterization of Betulinic Acid NanoparticlesWU Mingfang XU Wenjia ZU Yuangang ZHAO Xiuhua Key Laboratory of Forest Plant Ecology, Ministry of Education, Northeast Forestry University; Abstract： OBJECTIVE:To prepare the betulinic acid nanoparticles, and characterize them. METHODS
4、:Using ethanol as solvent and water as anti-solvent, anti-solvent recrystallization method was used to prepare betulinic acid nanoparticles. Using particle size as indicator, single factor test and orthogonal test were adopted to optimize the mass concentration of betulinic acid solution, anti-solve
5、nt-solvent volume ratio, anti-solvent drip rate, reaction temperature and stirring speed in formulation technology of betulinic acid nanoparticles, and verification test was conducted. The betulinic acid nanoparticles were characterized by scanning electron microscopy, laser particle size analyzer,
6、Fourier infrared spectrometer and mass spectrum analyzer. RESULTS:The optimal technology was as follow as betulinic acid solution mass concentration of 3 mg/mL, anti-solvent-solvent volume ratio of 1:1, anti-solvent drip rate of 8 mL/min, reaction temperature of 20 and stirring speed of 900 r/min. T
7、he average size of prepared betulinic acid nanosuspension was (156.08.6) nm (n=3) and the particle size was (235.012.2) nm (n=3) after freeze-drying, with nearly spherical appearance, uniform size and regular form. Compared with raw material of betulinic acid, the chemical structure of prepared betu
8、linic acid nanoparticles did not change, and there were no significant changes in molecular weight and mass ratio. CONCLUSIONS:Betulinic acid nanoparticles are successfully prepared.Keyword： Betulinic acid; Nanoparticles; Anti-solvent recrystallization method; Single factor test; Orthogonal test; Ch
9、aracterization; Received： 2017-03-25桦木酸 (Betulinic acid) 又称白桦酯酸, 是从白桦树皮中萃取得到的一种五环三萜类化合物, 具有抗肿瘤1、抗人类免疫缺陷病毒2、抗炎3-4和抗疟病5等药理活性。研究发现, 桦木酸能够抑制肿瘤细胞生长和对抗血管新生, 从而诱导癌细胞凋亡, 对癌细胞具有靶向作用, 且毒性很小, 是最有前途的抗癌药物前体之一。但由于桦木酸水溶性差、口服生物利用度低6, 其应用受到了限制。为了提高难溶性药物的生物利用度, 可将其制备成粒径小、粒度分布均匀的纳米粒。药物纳米化的常用方法有气流粉碎法、机械粉碎法、高压均质技术、超临界流体
10、技术和反溶剂重结晶法等。目前应用最广泛的是机械粉碎法, 但是其缺点是耗能大、效率低和所制纳米粒粒径分布不均匀;而高压均质技术7和超临界流体技术8又都存在高投资、低产率等缺点。反溶剂重结晶法是把药物溶于溶剂中后, 再加入反溶剂中, 通过降低溶剂的溶解能力, 使药物迅速达到过饱和状态而析出结晶的一种传统微粉化技术9。此方法具有易操作、成本低及能够适应工业化大生产等优点, 通过该法已成功制备了多种难溶性口服药物纳米粒10。本研究拟通过反溶剂重结晶法制备桦木酸纳米粒并对其进行表征, 以期提高桦木酸的口服生物利用度。1 材料1.1 仪器BI-200SM 型 Zeta 电位及粒度分析仪 (美国 Brook
11、haven 公司) ;78HW-1 型数显磁力搅拌器 (杭州仪表电机有限公司) ;BS-110 型电子分析天平 (德国Sartorius 公司) ;Inspect S 型扫描电子显微镜 (SEM, 美国 FEI 公司) ;Magna-IR560ESP 型傅里叶红外光谱仪 (FTIR, 美国 Nicolet 公司) ;6520 型液相色谱质谱 (LC-MS) 分析仪 (美国 AB 公司) ;GW-RO 型超纯水器 (北京普析通用仪器有限责任公司) 。1.2 药品与试剂桦木酸原料药 (陕西慧科生物科技有限公司, 批号:111802-201001, 纯度:98%) ;无水乙醇 (天津市天力化学试剂有
12、限公司, 批号:20130408, 分析纯) ;甲醇 (江苏汉邦科技有限公司, 批号:131583, 色谱纯) ;溴化钾 (常州市海拓实验仪器有限公司, 批号:20160421, 光谱纯) ;水为去离子水。2 方法与结果2.1 反溶剂重结晶法制备桦木酸纳米粒利用一些有机溶剂对桦木酸进行溶解度测试后, 选择乙醇作为溶剂, 将一定质量的桦木酸原料药与一定体积的乙醇溶液放入烧杯中, 置于恒温水浴锅中并在恒温磁力搅拌器下控制其搅拌的速度, 使原料药充分溶解, 得到桦木酸乙醇溶液。待温度稳定后, 将一定体积的反溶剂 (去离子水) 缓慢逐滴加入到桦木酸乙醇溶液中, 得到桦木酸纳米混悬液。收集桦木酸纳米混悬
13、液, 8 000r/min 离心 (离心半径:10 cm) 10 min, 弃上清, 取一部分沉淀用等体积的去离子水复溶, 通过 Zeta 电位及粒度分析仪测得粒径大小;另一部分沉淀于-40中预冻12h, 再冷冻 48 h, 即得桦木酸纳米粒。2.2 单因素试验筛选处方工艺本研究在预试验基础上筛选了 5 个对桦木酸纳米粒的形态和粒径影响较大的因素, 分别为桦木酸乙醇溶液质量浓度、反溶剂-溶剂体积比、搅拌速度、反溶剂滴加速度和反应温度。每个因素设 4 个水平:桦木酸乙醇溶液质量浓度为0.5、1、2、3、4、5 mg/m L;反溶剂-溶剂体积比为0.51、11、21、31、41、51;搅拌速度为
14、600、700、800、900、1 000、1 100 r/min;反溶剂滴加速度为 2、4、6、8、10、12 m L/min;反应温度为 10、15、20、25、30、35。分别考察上述因素对桦木酸纳米粒的影响, 以粒径最小原则进行筛选, 每组试验重复 3 次。2.1.1 桦木酸乙醇溶液质量浓度在磁力搅拌速度为 900 r/min、反应温度为 25的条件下, 按反溶剂-溶剂体积比 41 将去离子水以 8 m L/min 的滴加速度分别加入到质量浓度为1、2、3、4 mg/m L 的桦木酸乙醇溶液中, 制成桦木酸纳米粒, 测定其粒径。结果显示, 当质量浓度为 3 mg/m L 时所制桦木酸纳
15、米粒的粒径最小, 故确定桦木酸乙醇溶液质量浓度为 3 mg/m L, 详见图 1。2.1.2 反溶剂-溶剂体积比图 1 单因素试验结果 Fig 1 Results of single factor test 下载原图在磁力搅拌速度为 900r/min、反应温度为 25的条件下, 按反溶剂-溶剂体积比分别为 11、21、31、41 将去离子水以 8 m L/min 的滴加速度分别加入到质量浓度为 3 mg/m L 的桦木酸乙醇溶液中, 制成桦木酸纳米粒, 测定其粒径。结果显示, 当反溶剂-溶剂体积比为 11 时所制桦木酸纳米粒的粒径最小, 故确定反溶剂-溶剂体积比为 11, 详见图 1。2.1.
16、3 搅拌速度在磁力搅拌速度分别为 700、800、900、1 000 r/min, 反应温度为 25的条件下, 按反溶剂-溶剂体积比为 11 将去离子水以 8 m L/min 的滴加速度加入到质量浓度为 3 mg/m L 的桦木酸乙醇溶液中, 制成桦木酸纳米粒, 测定其粒径。结果显示, 搅拌速度为 900 r/min 时所制桦木酸纳米粒的粒径最小, 故确定搅拌速度为 900 r/min, 详见图 1。2.1.4 反溶剂滴加速度在磁力搅拌速度为 900 r/min、反应温度为 25的条件下, 按反溶剂-溶剂体积比为 11 将去离子水以 4、6、8、10 m L/min 的滴加速度分别加入到质量浓
17、度为 3 mg/m L 的桦木酸乙醇溶液中, 制成桦木酸纳米粒, 测定其粒径。结果显示, 反溶剂滴加速度为 8m L/min 时所制桦木酸纳米粒的粒径最小, 故确定反溶剂滴加速度为 8 m L/min, 详见图 1。2.1.5 反应温度在磁力搅拌速度为 900 r/min, 反应温度分别为 15、20、25、30的条件下, 按反溶剂-溶剂体积比为 11 将去离子水以 8 m L/min 的滴加速度加入到质量浓度为 3 mg/m L 的桦木酸乙醇溶液中, 制成桦木酸纳米粒, 测定其粒径。结果显示, 反应温度为 25时所制桦木酸纳米粒的粒径最小, 故确定反应温度为25, 详见图 1。综上单因素试验
18、结果, 桦木酸纳米粒的处方工艺条件为:桦木酸乙醇溶液质量浓度为 3 mg/m L, 反溶剂-溶剂体积比为 11, 搅拌速度为 900 r/min, 反溶剂滴加速度为 8 m L/min, 反应温度为 25。2.3 正交试验优化处方工艺2.3.1 正交试验在单因素试验结果的基础上, 确定以桦木酸乙醇溶液质量浓度 (A, mg/m L) 、反溶剂-溶剂体积比 (B) 、反溶剂滴加速度 (C, m L/min) 和反应温度 (D, ) 为因素, 按 L16 (4) 表设计正交试验, 每个因素设 4 个水平:A 为 1、2、3、4 mg/m L, B 为 11、21、31、41, C 为 4、6、8、
19、10 m L/min, D 为15、20、25、30。以纳米混悬液粒径为指标, 以粒径最小原则进行筛选, 每组试验重复试验 3 次, 采用正交试验优化桦木酸纳米粒处方工艺。因素与水平见表 1, 正交试验设计与结果见表 2, 方差分析结果见表 3。表 1 因素与水平 Tab 1 Factors and levels 下载原表 表 2 正交试验设计与结果 Tab 2 Orthogonal test design and results 下载原表 由表 2 和表 3 结果可知, 各因素对桦木酸纳米粒粒径大小的影响程度依次为反应温度反溶剂-溶剂体积比桦木酸乙醇溶液质量浓度反溶剂滴加速度, 其中反溶剂-
20、溶剂体积比、反应温度、桦木酸乙醇溶液质量浓度对粒径有显著影响 (P0.05 或 P0.01) 。综合考虑, 确定木酸纳米粒的最优处方工艺条件为A3B1C3D2, 即桦木酸乙醇溶液质量浓度为 3 mg/m L, 反溶剂-溶剂体积比为 11, 反溶剂滴加速度为 8 m L/min, 反应温度为 20。表 3 方差分析结果 Tab 3 Results of variance analysis 下载原表 2.3.2 验证试验按最优处方工艺条件, 首先称取 30mg 的桦木酸原料药溶于 10 m L 的乙醇中, 充分溶解得到质量浓度为 3 mg/m L 的桦木酸乙醇溶液;在 20温度下, 向桦木酸乙醇溶
21、液中以 8 m L/min 的滴加速度加入反溶剂 (去离子水) 10 m L, 即制备出桦木酸纳米混悬液;混悬液离心后冻干制成桦木酸纳米粒。试验重复 3 次并测定所制桦木酸纳米粒的粒径。结果显示, 桦木酸纳米混悬液平均粒径为 (156.08.6) nm (n=3) , 冻干后粒径为 (235.012.2) nm (n=3) 。2.4 桦木酸纳米粒表征2.4.1 SEM 分析用 SEM 分析最优处方工艺所制桦木酸纳米粒和桦木酸原料药的形貌和大小。操作步骤:样品台上黏好双面铜导电胶, 在此导电胶上黏附少量样品, 再对样品喷金处理 (电流为 3 m A、时间为 6 min 或电流为 50 m A、时
22、间为 30 s) , 将喷金处理后的样品置于样品室中观察。结果显示, 桦木酸原料药呈针状的晶体结构, 平均粒径约在 3 00020 000 nm 之间, 粒度分布不均匀;桦木酸纳米粒呈近球形, 大小比较均匀, 形态较规整, 平均粒径约为 300 nm。桦木酸原料药和桦木酸纳米粒的 SEM 图见图 2。图 2 桦木酸原料药和桦木酸纳米粒的 SEM 图 Fig 2 SEM pictures of betulinic acid raw material and nanoparticles 下载原图2.4.2 FTIR 分析用 FTIR 分析最优处方工艺所制桦木酸纳米粒和桦木酸原料药的化学结构。操作步
23、骤:将样品与溴化钾粉末按 1100 混合, 研成细粉末、压片, 进行红外光谱分析。结果显示, 桦木酸纳米粒和桦木酸原料药的红外吸收峰位置基本相同, 说明桦木酸纳米粒与桦木酸原料药对比, 其化学结构没有发生改变。桦木酸的红外特征峰为 3 522 cm 为羧基的 OH 伸缩振动吸收峰, 1 760 cm 为羧基的C=O 伸缩振动吸收峰, 1 082、1 035 cm 为 CO 伸缩振动吸收峰。桦木酸原料药和桦木酸纳米粒的红外光谱图见图 3。图 3 桦木酸原料药和桦木酸纳米粒的红外光谱图 Fig 3IR pictures of betulinic acid raw material and nano
24、particles 下载原图2.4.3 LC-MS 分析采用 LC-MS 分析仪对最优处方工艺所制桦木酸纳米粒和桦木酸原料药的相对分子量进行分析。操作步骤:将样品 5 mg 溶于 10 m L 甲醇溶液中, 以 10 000 r/min 离心 (离心半径:10 cm) 10 min, 取上清进行检测。结果显示, 桦木酸纳米粒的相对分子量与桦木酸原料药比较未发生明显变化, 桦木酸纳米粒分子质子化之后的质荷比为 456.3, 这一结果与桦木酸分子式计算出来的结果 (分子量为 456.7) 吻合。两种不同晶型的桦木酸具有相同的分子量, 这一结果与FTIR 结果吻合, 由此判断出通过反溶剂重结晶法制得
25、的桦木酸纳米粒的化学结构没有发生变化。桦木酸原料药和桦木酸纳米粒的 LC-MS 图见图 4。图 4 桦木酸原料药和桦木酸纳米粒的 LC-MS 图 Fig 4LC-MS pictures of betulinic acid raw material and nanoparticles 下载原图3 讨论本研究通过单因素试验和正交试验对桦木酸纳米粒的处方工艺进行了优化。结果显示, 最优处方工艺条件为:桦木酸乙醇溶液质量浓度 3 mg/m L、反溶剂-溶剂体积比 11、反溶剂滴加速度 8 m L/min、反应温度 20、搅拌速度 900 r/min。所制得的桦木酸纳米混悬液粒径为 (156.08.6)
26、 nm (n=3) , 冻干后粒径为 (235.012.2) nm (n=3) 。本试验以难溶于水的药物桦木酸为研究对象, 考察了反溶剂重结晶法制备桦木酸纳米粒的可行性, 并对所制纳米粒进行了表征, 为进一步开发桦木酸新剂型的研究奠定了良好的基础。参考文献1胡祥正, 冯亚亚.桦木酸及其衍生物的制备与抗肿瘤作用的研究进展J.化学通报, 2016, 79 (7) :589-596. 2易金娥, 邬静, 文利新, 等.桦木酸的药理作用研究进展J.中草药, 2014, 45 (14) :2118-2124. 3徐先祥, 秦思, 李琼.桦木酸抗炎作用与机制J.中国现代应用药学, 2014, 31 (10
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