1、Comment 编编编编1: 请核实题目修改Comment 编编编编2: 动物来源及编号？Comment 编编编编3: 具体随机方法？Comment 编编编编4: 7组分别如何处理？Comment 编编编编5: 动物来源及编号？Comment 编编编编6: 哪 6组？每组多少只？Comment 编编编编7: 哪 3组？Comment 编编编编8: 指代不明，不知道什么是对照组Comment 编编编编9: 请适当罗列正文结果重要数据，并请与正文一致Comment 编编编编10: 需要修改，请指明短期时间（4 周） 、含川芎嗪 UW液等，需要与目的呼应Comment 编编编编11: 是 2个基金？
2、Comment 编编编编12: 补充与中文一致的英文基金项目名称及编号写法含川芎嗪 UW液保存不同时间对异体神经再生的影响钟 建 1，阳明明 2，蒋电明 2 (4021601 重庆，重庆医科大学附属永川医院骨科 1；400016重庆，重庆医科大学第一附属医院骨科 2)摘要 目的 探讨在4 条件下用含川芎嗪的UW液保存不同时间后大鼠异体神经再生的影响,阐明 。方法 取3月龄雄性清洁级成年健康 Wistar大鼠56只（ ），体质量200250 g，随机分为A、A、B、B、C、C、D组，每组8只。取3月龄雄性清洁级成年SD大鼠24只（ ），体质量200250 g，切取双侧坐骨神经干约15 mm，随机
3、分为6组， ，于4 条件下，其中 3组分别经含川芎嗪的UW液保存4、6、12周后，作为实验组A、B、C组神经修复供体，对照组供体神经用不含川芎嗪的UW液保存。D组为新鲜自体神经移植组。术后4、8、12周行大体观察，术后12周行电生理检测，光镜、电镜观察神经再生情况。结果 术后12周腓肠肌湿质量、电生理检测，A、D两组优于其他组，但D组优于A组，组间有统计学意义(P0.05)；B组优于B组，B组与A组比较有统计学差异。结论 在短期内保存异体神经，川芎嗪可改善其神经再生效果。关键词 UW液；川芎嗪；异体神经；时间中图法分类号 R651.3 R622.3 文献标志码 A基金项目 重庆市卫生局资助项目
4、（渝中医200964 号,2009-1-10）通信作者 蒋电明，E-mail：Investigate the regenerative effect of allograft nerves preserved in UW solution with tetramethylpyrazine for different time at 4 Zhong Jian,Yang Mingming,Jiang Dianming (1.Department of Orthopedics,Yongchuan Hospital,Chongqing Medical University,402160;2.Depar
5、tment of Orthopedics, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University，400016，China)【Abstract】 Objective: To investigate the effects of peripheral nerve allografts regeneration after being preserved with tetramethylpyrazine (TMP) for different times at 4.Methods: 56 Wistar rats(male，weigh
6、ing 200250 g) were divided into 7 groups randomly(groups A,A,B,B,C,C and D, n=8)The sciatic nerve allografts were preserved in University of Wisconsin solution (UW solution) containing TMP at 4 for different time intervals, and then being employed to repair the sciatic nerve defect of Wistar rats. T
7、hose nerve allografts in control groups were preserved in UW solution without TMP. The sciatic nerve autografts were also employed in one group. 4、8、12 weeks postoperative,observing the fuction of affected limb.The gastrocnemius weight, morphological and electric neurophysiology of gastrocnemius wer
8、e detected at 12 weeks postoperatively. Results: With respect to the electrophysiological test as well as gastrocnemius weight, the results of A、D groups were better than other groups, and the result of D group was superior to A group(P0.05); the results of B group were fine and superior to B group,
9、 but there was statistical significance compared with A group. Conclusion: TMP could exert its potency on the regeneration of allograft nerve in short term.【Key words】time; allograft nerve; UW solution; tetramethylpyrazineSupported by the .Corressponding author: Jiang Dianming, E-mail：自体神经移植是治疗周围神经损
10、伤的金标准。周围神经缺损的治疗方式，目前的临床标准是移植一段Comment 编编编编13: 1、此段描述是否有些混乱？供体、受体、供体组、实验组、对照组？并且提及“受体为成年健康雄性 Wistar大鼠 48只，体质量 200250 g，均由重庆医科大学实验动物中心提供”，另 8只又为 D组，不算受体吗？分开讲，其来源呢？2、请标明动物号、喂养条件及方式等Comment 编编编编14: 分组太混乱，叫我如何区分“实验组：Wistar 大鼠24只，随机分为 A、B、C 3 组。对照组：Wistar大鼠 24只，随机分为A、B、C 3 组”？分组问题务请解决：简单、清楚，并注意全文描述一致Comme
11、nt 编编编编15: 请说明哪些大鼠？实验组与对照组？Comment 编编编编16: 这里在说明术后时间，1.3.3 中又根据术后时间进行了分组，描述混乱，请理清全文的分组，全文描述一致Comment 编编编编17: 哪几个组？Comment 编编编编18: 哪些组？具体的随机方法？“相对不重要”的自体神经,感觉神经诸如腓肠神经是常用的供体神经 1。然而周围神经损伤的治疗对于重建外科来说始终是个挑战，因为供体神经的稀缺且供区的并发症不可避免。异体神经可能是自体神经移植极佳的替代物 2。大多数周围神经损伤患者需行急诊手术治疗，故要求异体神经的保存时间较长且保存条件简便。川芎嗪（TMP）是中药川芎
12、所含的生物碱，对清除氧自由基的作用极强,其作为中国传统医学药物广泛用于心脑肾等疾病的治疗 3-6。随着研究的进展，在兔和大鼠实验中发现川芎嗪能减轻神经元细胞的缺血性或创伤性脑脊髓损伤，并有助于功能恢复 7-8。另有研究报道，川芎嗪在创伤性脊髓的治疗中能降低促炎症因子TNF-、IL-1的表达，上调抗炎症因子IL-10的表达，并抑制NF-B活化 9。我们在前期实验中发现异体神经在 4 条件下经川芎嗪预处理后保存4周移植，与自体神经移植效果相近，为使异体神经移植应用于临床，本实验延长异体神经保存时间进一步探讨神经再生效果。1 材料与方法1.1 动物及分组供体为成年健康雄性 SD大鼠 24只，受体为成
13、年健康雄性 Wistar大鼠 48只，体质量 200250 g，均由重庆医科大学实验动物中心提供。供体组：SD 大鼠 24只，用于取供体神经保存后动物造模。实验组：Wistar 大鼠 24只，随机分为 A、B、C 3 组，每组均含大鼠 8只，用于含川芎嗪的 UW液不同保存时间后的异体神经移植。对照组：Wistar 大鼠 24只，随机分为A、B、C 3组，每组均含大鼠 8只，用于不含川芎嗪的 UW液不同保存时间后的异体神经移植。新鲜自体神经移植组（D组）：Wistar 大鼠 8只，切取大鼠部分坐骨神经后立即做原位移植。1.2 主要仪器及材料盐酸川芎嗪注射液（中国北京市燕京药业有限公司），UW 液
14、（美国 Bristol-Myers squibb公司） ，双目显微镜（日本奥林巴斯） ，肌电图仪（日本 HITACHI-2000)，透射电镜（日本 Hitachi公司） ，显微手术器械（中国上海市泽强医疗器械公司） 。1.3 方法1.3.1 供体神经获取 以 10%水合氯醛 0.2 mL/100 g将 SD大鼠腹腔麻醉，麻醉成功后手术部位脱毛，常规消毒铺巾，沿股后外侧做约 35 mm纵行切口，于股外侧肌、股二头肌及外展短肌肌间隙钝性分离，拉钩牵开两侧肌肉，清晰暴露双侧坐骨神经，于无菌条件下距梨状肌下缘以远 5 mm处游离并平整切取双侧坐骨神经干，所取神经长约 15 mm。共取 48条神经。1.
15、3.2 神经保存液的配制 川芎嗪（40 mg/支），按比例加入 30 mL UW液，配备成含川芎嗪浓度为 200 mg/L的 UW液，同时添加 16 mg/L 地塞米松,40 U/L 胰岛素以及 100 U/mL盘尼西林。对照组用不含川芎嗪的 UW液保存。液体均即用即配。1.3.3 神经保存 所获取的 48条供体神经生理盐水冲洗后随机放入 24根冻存管中，每根冻存管均只含 2条供体神经。24 根冻存管又随机分为 A、B、C、A、B、C 6组，A、B、C 3组分别用保存液保存 4、6、12 周，A、B、C分别用不含川芎嗪的保存液保存 4、6、12 周。1.3.4 建立动物模型 操作步骤同上，暴露
16、受体 Wistar大鼠右侧坐骨神经，在距梨状肌下缘以远 5 mm处整齐切除受体Wistar大鼠部分坐骨神经，造成 10 mm的神经缺损，将保存的 SD大鼠神经修成 10 mm长的神经段，于手术显微镜下以 11-0尼龙线缝合神经外膜 46 针，对合满意。D 组为将 Wistar大鼠坐骨神经切断后立即原位移植。术后 3 d抗生素预防感染，按移植神经来源，各组分笼饲养。1.4 检测指标1.4.1 大体观察 术后当天观察实验大鼠的麻醉苏醒及进食，术后 4、8、12 周观察实验动物术后肢体功能及足底溃疡，术后12周取材时于肉眼下进一步仔细观察移植神经的肿胀及与受体组织的粘连。1.4.2 神经电生理检测
17、术后 12周，每组中随机抽取 8只 Wistar大鼠，待麻醉成功后取股后外侧纵行切口暴露移植神经，刺激电极放置于移植神经近端吻合口以近约 2 mm处，接收电极放置于移植神经远端吻合口以远约 2 mm处，地线放置于两电极之间的股二头肌，线路检查准确无误后测定神经动作电位潜伏期和传导速度。1.4.3 腓肠肌湿质量 术后 12周，取每组 Wistar大鼠腓肠肌后立刻于电子天平称质量，观察腓肠肌萎缩情况。1.4.4 透射电镜观察 术后 12周行电生理检测后，每组随机取 4只移植神经段，即刻置入戊二醛溶液中，行透射电镜检查，进一步观察再生神经超微结构情况。Comment 编编编编19: 不明白比较对象？
18、1.4.5 光镜观察 移植术后12周，每组取4只大鼠移植神经段，即刻置入10%甲醛溶液中，行HE染色后切片，光镜下观察炎性细胞浸润及移植神经结构形态。1.5 统计分析 数据以 s表示，采用SAS 9.1软件，组间差异比较采用GLM方法，两两比较采用SNK法。x2 结果2.1 大体观察术后 4周每组动物均出现右后肢功能障碍及患肢肿胀，尤以 C及 C组肿胀程度为重，A 组及 D组大鼠患肢肿胀程度最轻，患肢拖行、足趾并拢。C 组 3只、C组 4只大鼠出现足底溃疡。术后 8周 A、A、D 组动物跛行情况较前减轻，B组动物跛行较前稍改善。C、C组跛行无明显改变,两组足底溃疡情况较前好转，溃疡面积较前稍缩
19、小。术后 12周 A、D 组中部分大鼠恢复四足行走，A、B组大鼠右后肢跛行明显改善，C、C组中大鼠跛行较前仍无明显改变且两组中部分大鼠仍残存足底溃疡。术后 12周进一步观察发现 A、D 组移植段神经与周围组织粘连较轻，稍加钝性分离后即可取出。C、C组移植神经段肿胀情况明显，粘连严重，不易钝性分离。A、B 两组移植神经段与周围组织粘连情况介于 A组及 D组之间。2.2 神经电生理检测术后 12周行神经电生理检测，测定各组神经动作电位潜伏期和传导速度，各组检测结果中以 D组最高，A 组次之，D 组与 A组间有统计学意义。C 及 C组检测结果最差，两组间无统计学意义，具体见表 1。表1 各组动作电位
20、潜伏期及传导速度检测结果 （均数标准差）组别 神经传导速度（m/s） 潜伏期(ms) A 9.430.40# 1.350.04#A 8.520.37# 1.410.04#B 7.930.35# 1.500.05#B 7.060.54# 1.620.06#C 4.870.69# 1.910.06#C 4.890.62# 1.890.07#D 10.200.52 1.210.03 A、B、C组分别与 A、B、C组比较， P0.05；各组与 D组比较，#P0.052.3 腓肠肌湿重术后 12周取腓肠肌后即刻于电子天平称重，各组检测结果中以 A、D 组最高，两组间无统计学意义。C 及 C组检测结果最差
21、，与其他组比较有统计学意义，见表 2。表2 各组腓肠肌湿重检测结果 (均数标准差)Table 2 The results of gastrocnemius in each group (MeanSD)组别 腓肠肌湿重（g）A 1.250.05A 1.150.06#B 1.020.07#B 0.820.08#C 0.650.10#C 0.670.09#D 1.260.04A、B、C 组分别与 A、B、C组比较，P0.05；各组与 D 组比较，#P0.052.4 光镜观察术后 12 周移植神经段行 HE 染色光镜观察，C 组及 C组炎症反应最重且空泡变性最为明显，D 组炎症反应最轻，镜下见 A、D
22、 两组神经纤维排列较规则（HE400）。A.A 组 B.B 组 C.C 组 A.A组 B.B组 C. C组 D.D 组图 1 术后 12 周各组行 HE 染色光镜观察 （HE400）2.5 透射电镜观察术后 12 周行透射电镜检测，A、D 两组再生的有髓神经纤维较多，并可见少许无髓神经纤维，髓鞘完整，呈同心圆排列，细胞器丰富；B 组镜下情况差于 A 组，C、C组再生的有髓神经纤维较少，并见结缔组织结构（4000）A.A 组 B.B 组 C.C 组 A.A组 B.B组 C. C组 D.D 组图 2 术后 12 周各组行透射电镜观察 （4000）3 讨论自体神经移植是治疗周围神经损伤的金标准，却有
23、其诸多弊病，如造成相应供区的功能障碍等10。神经套管技术应用于临床已有较长时间，但仅适用于修复较短的神经缺损，且临床效果欠佳11。异体神经因其含有正常神经的三维结构，有可能成为极佳的自体神经替代移植物。理想的异体神经移植，应有满意的神经修复效果，保存时间较长及保存方便。雪旺细胞（SC）是周围神经系统的神经胶质细胞，并是周围神经主要的细胞成分。SC 细胞所生成的神经营养因子对周围神经系统的再生至关重要12。现有冷冻保存、酒精处理、甘油处理、化学去细胞等方法用以降低异体神经免疫原性，但处理过程较为繁琐，不适于临床工作的应用开展。UW 液目前广泛用于组织、器官的保存，在心、肝、肾器官的保存中，UW
24、液是最为常用及首选的保存液并成为保存液中的金标准13-14,UW 液通过其强大的抗氧化作用减轻移植组织器官的缺血性损伤15。缺血性损伤可能在一定程度上与有活性 SC 细胞的减少有关，因其激发一系列反应进而导致 SC 细胞坏死、凋亡16。故本实验选用 UW 液作为神经保存液。为进一步提高保存神经的活性，我们在保存液中加入 TMP。TMP 对清除氧自由基有极强作用,其作为中国传统医学药物广泛用于心脑肾等疾病的治疗3-6，多年来对 TMP 在体内外的代谢、毒性及分布已做了大量的研究。随着研究的进展，在兔和大鼠的动物实验中发现 TMP 能减轻神经元细胞的缺血性或创伤性脑脊髓损伤，并有助于功能恢复7-8
25、。另有研究报道，TMP 在创伤性脊髓的治疗中能降低促炎症因子 TNF-、IL-1 的表达，上调抗炎症因子 IL-10 的表达，并抑制 NF-B 活化9。有研究发现 TMP 可能通过增加硫氧化蛋白的表达，降低一氧化氮合酶系统的表达，进而对缺血性脑损伤发挥神经保护作用17-18。此外，TMP 还有一定的免疫抑制作用，实验发现淋巴细胞 DNA 的合成可被 TMP 所抑制，其机理可能为 TMP 通过对过度活化的 CD4 T 淋巴细胞的直接抑制，从而抑制免疫功能19。前期实验中，我们发现异体神经在 4条件下经 TMP 预处理后保存 4 周移植，与自体神经移植效果相近。为进一步延长异体神经保存时间并探讨移
26、植效果，本实验分别保存异体神经4、6、12 周。实验发现 A 组神经电生理及腓肠肌湿重结果与 E 组相近，B 组结果尚可但与 A 组相较有统计学差异，C 组与 C组效果最差且二组之间无统计学差异。我们考虑由于 TMP 具有神经保护作用及免疫抑制作用，一定程度上减轻了免疫排斥反应及雪旺细胞的凋亡，进而促进周围神经再生，但随着保存时间的延长，有活性的雪旺细胞逐渐减少。本实验一定程度上证实了川芎嗪在短期内能促进异体神经再生，但 TMP 的具体作用机制及进一步简便神经保存条件，有待进一步探讨。参考文献：1 Battiston B,Geuna S,Ferrero M,et al.Nerve repair
27、 by means of tubulization:literature review and personal clinical experience comparing biological and synthetic conduits for sensory nerve repairJ.Microsurgery,2005,25(4):258-267.2 Jan Rustemeyer, Aleksandra Krajacic, Ursula Dicke.Histomorphological and functional impacts of postoperative motor trai
28、ning in rats after allograft sciatic nerve transplantation under low-dose FK506J. Muscle Nerve,2009,39(4):480-488.3 Ho JW, Jie M. Pharmacological activity of cardiovascular agents from herbal medicine.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem.2007;5:2737.4 陈郡兴，苏志源，詹鹏.川芎嗪对体外循环心脏手术血浆神经元特异性烯醇化酶及术后认知功能障碍作用的初步探
29、讨.临床医学工程,2010,17(7):22-245 严根福，王健，贾玉柱，等.川芎嗪对急性脊髓损伤大鼠神经细胞早期凋亡的影响.浙江中医杂志,2012,47(9):666-6686 Liao SL, Kao TK, Chen WY, Lin YS, Chen SY, Raung SL, Wu CW, Lu HC, Chen CJ: Tetramethylpyrazine reduces ischemic brain injury in rats. Neurosci Lett 2004, 372:40-45.7 Kao TK, Ou YC, Kuo JS, Chen WY, Liao SL, W
30、u CW, et al.Neuroprotection by tetramethylpyrazine against ischemic brain injury in rats. Neurochem Int. 2006;48:16676.8 胡建中，吕红斌，周斌，等.川芎嗪对脊髓急性损伤大鼠神经营养因子表达的影响.现代中西医结合杂志,2010,19(9):1058-10609 Lihong Fan, MDa, Kunzheng Wang, MDa, Zhibin Shi, MDa, Jun Die, MDb, Chunsheng Wang, MDa, Xiaoqian Dang, MDa.Te
31、tramethylpyrazine protects spinal cord and reduces inflammation in a rat model of spinal cord ischemia-reperfusion injury.J Vasc Surg.2011 jul;54(1):192-20010Brian Hood, M.D., Howard B. Levene, M.D., Ph.D,et al.Transplantation of autologous Schwann cells for the repair of segmental peripheral nerve
32、defectsJ.Neurosurg Focus,2009,26 (2):1-911 Siemionow, M., Brzezicki, G., Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int. Rev. Neurobiol.2009. Chapter 8: 87, 141-72.12 Zarbakhsh S, Bakhtiyari M, Faghihi A, Joghataei MT,et al. The effects of chwann and bone marrow stromal stem cells o
33、n sciatic nerve injury in rat: a comparison of unctional recovery.cell J,2012;14(1):39-46.13Hoeger, S., Lueg, G., Tsagogiorgas, C., Schneider, M., Theisinger, S., Theisinger, B., Fontana, J., Waldherr, R., Krmer, B.K., Schnuelle, P., Yard, B. UW is superior compared with HTK after prolonged preserva
34、tion of renal grafts. J. Surg. Res.2011;170, e149-57.14George, T.J., Arnaoutakis, G.J., Baumgartner, W.A., Shah, A.S., Conte, J.V., Organ storage with University of Wisconsin solution is associated with improved outcomes after orthotopic heart transplantation. J. Heart. Lung. Transplant. 2011;30, 10
35、33-43.15Belzer F O,Southard J H. Principle of solid-organ preservation by cold storageJ.Transplant,1988,45(4):673676.16 Faubel, S., Edelstein, C.L.Caspases as drug targets in ischemic organ injuryJ.Curr.Drug. Targets. Immune. Endocr. Metabol. Disord.2005;5, 269-87.17Zhu, X.L., Xiong, L.Z., Wang, Q.,
36、 Liu, Z.G., Ma, X., Zhu, Z.H., Hu, S., Gong, G., Chen, S.Y. Therapeutic time window and mechanism of tetramethylpyrazine on transient focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Neurosci. Lett.2009;449, 24-718Xiao, X., Liu, Y., Qi, C., Qiu, F., Chen, X., Zhang, J., Yang, P.Neuroprotection and enhanced neurogenesis by tetramethylpyrazine in adult rat brain after focal ischemia. Neurol. Res.2010;32, 547-55.19 王建杰，罗文哲，张涛等川芎嗪对类风湿性关节炎患者PBMC免疫球蛋白合成的影响黑龙江医药科学，2004，27(1)：4-15
