1、水稻叶鞘原生质体转化体系的构建及Pik-H4和 AvrPik-H4蛋白的瞬时表达 刘维 刘浩 董双玉 古丰玮 陈志强 王加峰 王慧 华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心 摘 要： 【目的】探索水稻叶鞘原生质体最佳游离时间以及转化时间, 提高瞬时表达效率, 在蛋白水平对目的基因进行检测且大批量表达。探索该系统表达抗稻瘟病蛋白 Pik1-H4、Pik2-H4 及无毒蛋白 Avr Pik-H4的可行性, 对目的基因的功能进行分析。【方法】以高抗稻瘟病品种 H4及对照品种中二软占作为试验材料, 利用 1/2 MS培养基种植水稻幼苗 25恒温培养 710 d。利用纤维素酶及离析酶对水稻叶鞘进行酶
2、解, 血球计数板分别统计游离1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 和 12 h的细胞数目获得最佳的酶解时间。将目标基因 Pik1-H4、Pik2-H4 及 Avr Pik-H4分别与 GFP融合, 构建瞬时表达载体, 利用 PEG介导转入水稻叶鞘原生质体。设置转化10、12、14、16、18、20、22 和 24 h, 分别提取细胞总 RNA, UBQ管家基因为对照, 设计 GFP特异性扩增引物, 利用实时荧光定量 PCR (q RT-PCR) 检测 GFP的相对表达量, 探索最佳的转化时间。通过激光共聚焦扫描显微镜对目标基因进行亚细胞定位观察, 推测基因功能。提取细胞总蛋白, 以
3、Anti-GFP为一抗用Western blot对目标蛋白表达进行验证。【结果】相对室温土壤栽培, 营养丰富且均衡的 1/2 MS培养基恒温种植的水稻幼苗质量更优质, 活力更高。游离时间的长短对游离效率影响较大, 游离的最佳时间为 46 h, 在 34 h细胞游离数目增长速度最快, 46 h 细胞数量趋于平稳, 6 h 以后细胞总量呈现下降趋势, 特别是 7 h以后, 显微下细胞碎片增多, 细胞死亡速度加快。检测 GFP的相对表达量, 获得最佳转化时间为 1416 h, 16 h达到最高值, 之后逐渐下降。随着时间的推移, 荧光显微镜下观察到 GFP蛋白发出的荧光逐渐淬灭。亚细胞定位观察发现
4、Avr Pik-H4蛋白主要被定位于水稻细胞膜上, 初步推测是一种膜蛋白, 通过某种形式运输到宿主细胞作为激发子触发一系列反应。Pik-H4是高效广谱抗稻瘟病基因, 分为 Pik1-H4和 Pik2-H4两个部分, Pik1-H4 主要定位在内质网, Pik2-H4 主要定位在质体, 从定位结果初步推定 Pik1-H4可能主要参与 Avr Pik-H4蛋白的识别反应, Pik2-H4 主要起到调控下游抗病的作用。Western blot结果显示目标蛋白表达成功, 分子大小正确。Pik1-H4 和 Avr Pik-H4的表达量高于 Pik2-H4, 说明分子量的大小不是影响转化效率的关键因素。【
5、结论】水稻叶鞘原生质体瞬时表达系统具有高效快速的特点, 通过对游离及转化时间的探索为水稻瞬时表达体系的广泛实践应用提供参考。目标基因的成功表达为 Pik-H4与无毒蛋白互作机制的研究提供了有价值的理论依据。关键词： 水稻; 原生质体; 亚细胞定位; Western杂交; 作者简介：刘维, Tel:18819266052;E-mail:。作者简介：王慧;Tel:020-85283237;E-mail:收稿日期：2017-06-12基金：国家重点研发计划 (2017YFD0100100) Construction of Rice Leaf Sheath Protoplast Transformat
6、ion System and Transient Expression of Pik-H4 and AvrPik-H4 ProteinsLIU Wei LIU Hao DONG ShuangYu GU FengWei CHEN ZhiQiang WANG JiaFeng WANG Hui National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, South China Agricultural University; Abstract： 【Objective】 The objective of this study is to
7、obtain the suitable digestion and transformation time of protoplasts of rice sheath, improve the efficiency of transient expression, the target gene can be detected at the protein level and expressed in large quantities. To explore the feasibility of transient expression of rice blast resistance pro
8、tein Pik1-H4, Pik2-H4 and avirulence protein Avr Pik-H4 in protoplasts of rice leaf sheath, and to analyze the function of above target genes.【Method】High blast resistance rice variety H4 and control variety Zhonger Ruanzhan were used as experimental materials. Rice seedlings were cultured with 1/2
9、MS medium at 25 for 7-10 d. The protoplasts were isolated by cellulase and macerozyme enzymatic action. The optimal time of digestion was obtained by counting the number of cells in 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 and 12 h using hemocytometer. The target genes Pik1-H4, Pik2-H4 and Avr Pik-H4 were
10、fused with GFP to construct the transient expression vector. The total RNA was extracted from transformed protoplasts in 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 and 24 h, respectively. Real-time quantitative PCR (q RT-PCR) was used to detect the relative expression of GFP to obtain the best transformation time,
11、UBQ housekeeping gene was used as control and GFP specific amplification primers were designed. The method of subcellular localization of the target gene by laser confocal scanning microscopy was used to estimate the gene function. The total protein was extracted and anti-GFP was used as the primary
12、 antibody, verified that the target protein successful expression by Western blot. 【Result】 Rice seedlings were grown better quality and vitality in constant temperature 1/2 MS medium with rich and balanced nutrients, compared with soil planted at room temperature. Digested time had a greater impact
13、 on protoplast isolation efficiency. The results showed that the best time to digest was 4-6 h. The number of cells grew fastest at 3-4 h, tended to be stable at 4-6 h, showed a downward trend after 6 h, cell death rate accelerated and observed debris increased in the microscopic cell after 7 h. By
14、detecting the relative expression of GFP, it was found that the most suitable time for transformation was 14-16 h, reached the highest value at 16 h, and then gradually decreased. Subsequently, fluorescence of the GFP protein was observed to be quenched by fluorescence microscopy. Subcellular locali
15、zation observation of Avr Pik-H4 protein was mainly located in the cell membrane, presumably this is a membrane protein that is transported by some form to the host cell as an exciton to trigger a series of reactions. Pik-H4 is composed of Pik1-H4 and Pik2-H4, which is highly efficient broad-spectru
16、m rice blast gene. Pik1-H4 and Pik2-H4 were mainly located in the endoplasmic reticulum and plastid, respectively. From the subcellular localization results, it was presumed that Pik1-H4 might be mainly involved in the recognition of Avr-Pik protein and signal transmission, Pik2-H4 mainly play a rol
17、e in changing the energy transmission and regulation of downstream disease caused hypersensitive reaction. Western blot results showed that the target protein was successfully expressed and the molecular size was correct. The expression of Pik1-H4 and Avr Pik-H4 was higher than that of Pik2-H4, indi
18、cating that the size of the molecular weight is not a key factor affecting the transforming efficiency. 【Conclusion】The protoplast transient expression system of rice leaf sheath has the characteristics of high efficiency and rapidity, the exploration of protoplast isolation and transformation time
19、has laid a foundation for the extensive practice of rice transient expression system. The successful expression of the target gene has provided a valuable theoretical basis for the study of the interaction mechanism between Pik-H4 and Avr protein.Keyword： rice; protoplast; subcellular localization;
20、Western blot; Received： 2017-06-120 引言【研究意义】稻瘟病是由稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae) 引起的全球性真菌性病害, 目前世界上有 85个国家已出现该病害, 每年减产 10%35%1。实践证明, 选育和使用水稻抗病品种是控制稻瘟病最为经济有效的措施。植物瞬时表达系统以宿主单个细胞为基础, 转入外源的 DNA在短时间内进行蛋白质高水平表达。由于水稻原生质体的生物功能在一定程度上与完整的细胞相似, 为研究植物细胞内信号转导提供了非常有利的细胞环境2。利用水稻叶鞘原生质体瞬时表达系统表达 Pik1-H4、Pik 2-H4及 Avr Pik-H
21、4蛋白并进行亚细胞定位, 有助于目的基因分子功能及抗病基因和无毒基因互作机制的研究。【前人研究进展】水稻抗稻瘟病蛋白基因 Pik-H4由 Pik1-H4和 Pik2-H4组成, 属于典型的NBS-LRR类基因, 对广东的稻瘟病菌生理小种大多表现出高抗3。Avr Pik-H4为编码 113 aa的小分子分泌蛋白, 不含有保守区域, 容易发生突变。相较稳定的转基因表达系统, 瞬时表达体系具有宿主范围广、周期短、检测快速及高通量的特点, 已被广泛应用于分子生物学研究领域, 如启动子活性分析4、Cas9编辑效率检测5-6、m RNA 衰变7、micro RNAs 对靶基因的调控8、蛋白功能研究9、信号
22、转导10-11等。目前主要通过基因枪法、农杆菌渗透法、聚乙二醇 (PEG) 介导法、电击法及植物病毒载体介导对目标基因进行转化12, 在小麦5、葡萄9、玉米10、水稻13、拟南芥14、樱桃15、莴苣16、马铃薯6,17、烟草18等都有应用。水稻叶表面具有蜡质层, 不利于原生质体的游离, 如鹿连明等19利用烟草的瞬时表达体系研究水稻条纹病毒 (Rice stripe virus, RSV) 的相关蛋白互作, 但基因产物的正确折叠、亚细胞精细定位都依赖于宿主特异性表达系统20。近几年, 有关水稻原生质体瞬时表达系统已经有相关报道, 转化效率也相对提高21, 如利用 Co-IP技术验证互作蛋白13,
23、 探索 ABA信号通路22, 邻近生物素 (Bio ID) 技术筛选近端蛋白23等。【本研究切入点】尽管对水稻原生质体瞬时表达系统的应用已经有少量报道, 但原生质体游离转化效率限制了该技术的应用, 利用该技术进行抗稻瘟病基因蛋白的表达还未见报道。【拟解决的关键问题】探索原生质体游离及转化的最佳时间, 通过将目的片段融合绿色荧光蛋白 (GFP) 构建载体, 利用水稻叶鞘原生质体瞬时表达体系成功表达目标蛋白, 在激光共聚焦扫描显微镜下观察蛋白在细胞内的表达部位, 并且利用 Western blot技术验证结论的真实性, 为水稻原生质体瞬时表达系统的推广应用提供依据, 为水稻抗病相关基因的功能性研究
24、及互作蛋白的筛选打下基础。1 材料与方法试验于 2016年 10月至 2017年 3月在华南农业大学国家植物航天育种技术工程研究中心完成。1.1 试验材料水稻材料为 H4以及中二软占, H4 是经过空间搭载诱变的中二软占突变体经地面选育的广谱、高抗的水稻优质种质资源。1.2 载体构建试验中所有的瞬时表达载体均以 p YL322d1-e GFPn为骨架, 如图 1所示, 由花椰菜花叶病毒 (Ca MV) 35S 启动子、绿色荧光蛋白 (GFP) 片段和 NOS终止子组成。目标基因 Pik1-H4、Pik 2-H4克隆于高抗稻瘟病水稻品种 H4的 c DNA, Avr Pik克隆于稻瘟病菌 GD0
25、193, 利用 CE Design V1.03软件设计引物, 如表1所示, 去除开放阅读框架片段终止密码子, 利用同源重组方法构建 p35S-Pik1-H4/Pik2-H4/Avr Pik-H4-GFP载体。载体骨架由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室刘耀光研究员惠赠。表 1 引物寡核苷酸序列 Table 1 The oligonucleotide sequences of primer 下载原表 1.3 水稻幼苗种植挑选饱满的 H4水稻种子, 去壳, 75%乙醇消毒 2min, 2%的次氯酸钠 150 r/min消毒 30 min。在超净工作台中用灭菌水洗净残留的次氯酸钠后, 将种子
26、接种到1/2 MS培养基中, 放到恒温培养箱, 25, 光周期为 12 h光照/12 h 黑暗培养10 d左右。1.4 水稻原生质体制备参照 YANG等13的原生质体游离方法, 沿根部将水稻幼苗剪下, 用锋利的刀片将水稻叶鞘切割成 0.51 mm的片段, 放到 0.6 molL甘露醇中, 室温预质壁分离 30 min, 吸干残留的甘露醇, 用 W5 (154mmolL Na Cl, 125 mmolL Ca Cl2, 5 mmolL KCl, 2 mmolL MES, p H 5.7) 溶液稍清洗后加入现配酶液 (0.5 molL甘露醇, 10 mmolL MES, 1.5%纤维素酶, 0.7
27、5%离析酶, 10 mmolL Ca Cl2, 0.1%BSA) , 30, 60 r/min, 酶解 46 h。在普通光学显微镜 40物镜下观察细胞, 视野中有 2040个完整的细胞即可。用 200目筛子过滤酶液, 加入 10 m L预冷的 W5溶液于酶解的残渣快速手摇 1 min, 再次过滤, 合并滤液, 300g, 离心 5 min, 吸出上清液。向 BD管中加入 2 m L预冷的 W5溶液, 让原生质体重新悬浮, 200g, 离心 3 min, 重复此步骤一次。用500L W5 重悬沉淀, 置于冰上 30 min后, 150g, 离心 2 min, 去除上清, 用 1 m L MMg悬
28、浮细胞 (使终浓度约为 10个/m L) 。图 1 322-d1-e GFPn载体结构图 Fig.1 Maps of 322-d1-e GFPn vector 下载原图1.5 PEG介导水稻原生质体转化在 100L 原生质体中, 加入高纯度 10g (约 10L) 质粒, 再加入 110L 40%PEG (40%PEG4000, 0.3 molL甘露醇, 0.1 molL Ca Cl 2) , 混匀后, 28黑暗中横放 15 min。加入 500L 的 W5溶液终止反应, 充分混匀, 300g离心 5 min, 去除上清, 加入 600L WI 溶液 (4 mmolL MES, p H 5.7
29、, 0.5 molL甘露醇, 20 mmolL KCl) , 28黑暗中培养 1416 h。1.6 亚细胞定位使用激光扫描共聚焦显微镜 (LSM 7 DUO) 观察转化后含有 GFP蛋白以及 GFP融合蛋白的原生质体, GFP、m Cherry 的激发波长分别为 488、561 nm, 发射波长分别为 530560、580620 nm。叶绿体自发荧光的激发波长为 488 nm, 发射波长为 650750 nm。1.7 Western验证收集转化后的原生质体, 300g, 离心 6 min, 尽量去除上清。加入 20L 的SDS-PAGE样品缓冲液 (50 mmolL Tris-HCl, 2%S
30、DS, 0.1%溴酚蓝, 10%甘油, 1%巯基乙醇) 100煮沸 5 min, 提取原生质体中的总蛋白。室温离心 1 min, 吸取上清, 用 10%的 SDS-聚丙烯凝胶 (Bio-Rad) 200 V 35 min 分离样品的蛋白, 300 m A 3 h 将蛋白转到硝酸纤维素膜上, 使用一抗 Anti-GFP温室孵育 1 h, 二抗 Anti-Mouse温室孵育 1 h, 使用化学发光试剂 (Thermo Scientific) 温室孵育 5 min后, 进行观察。1.8 实时荧光定量 PCR分析为确定转化的最佳时间, 在原生质体中转入 GFP载体, 分别提取转化10、12、14、16
31、、18、20、22、24 h 的产物, 300g 离心 5 min, 弃上清, 加入 500L TRIzol, 涡旋 15 s, 温室静置 3 min。加入 150L 氯仿, 涡旋 15 s, 静置 2 min, 4, 12 000g 离心 5 min, 吸取水相到新的离心管, 加入250L 预冷的异丙醇, 混匀后温室放置 3 min, 4, 12 000g 离心 5 min, 弃上清, 加入 1 m L 75%乙醇, 简单混匀后 4, 12 000g 离心 2 min, 去除残留酒精, 加入 20L RNase 水溶解沉淀。分别取 1g RNA 用SMARTScribeReverse Tra
32、nscriptase试剂盒 (Ta Ka Ra Clontech) 进行逆转录, 反应条件:3010 min, 4220 min, 995 min, 45 min, 瞬间离心后, 将样品浓度稀释至 300500 ng, 以此为模板做 q PCR定量分析, 设计 PCR引物 GFP-F:GACGACGGCAACTACAAGAC、GFP-R:TCGGCCATGATATA GACGTT, 产物为 163 bp, UBQ管家基因作为对照。使用 Ace Q q PCR SYBRGreen Master Mix试剂盒 (Vazyme) , 反应条件:955 min, 9510 s, 6030 s, 40
33、个循环。2 结果2.1 瞬时表达载体的鉴定将目的片段分别与 GFP进行组装, 如图 2所示, 选用 Eco R、Sma两个限制性内切酶将载体线性化, 选用这两个酶切位点插入目的片段不会导致移码, 保证目标蛋白的正确表达。经 PCR检测后结果如图 3所示, 除了 Pik1-H4-GFP有一个扩增片段不正确以外, 其余都正确, 挑取 PCR结果正确质粒送去公司测序, 结果表明组装成功。2.2 水稻原生质体游离选取茁壮、叶鞘较硬的幼苗, 用手术刀片将叶鞘切割成小段 (图 4) 。通过血球计数板统计获得不同游离时间细胞的数目, 游离的最佳时间为 46 h, 在34 h细胞游离数目增长速度最快, 46
34、h 细胞数量趋于平稳, 6 h 以后细胞总量呈现下降趋势, 特别是 7h以后, 显微下细胞碎片增多, 细胞死亡速度加快 (图 5) 。随着游离时间的增加, 细胞总数目增多, 导致供氧不足, 初始的游离细胞活力下降, 加上游离过程中的机械碰撞使细胞膜破碎, 从而导致总体细胞数目呈现下降趋势。2.3 实时荧光定量 PCR分析最佳转化时间GFP蛋白在蓝色波长范围的光线激发下, 发出绿色萤光。将 GFP载体转化到原生质体中, 28, 经过 1416 h的暗培养后, 吸取 5L 在荧光显微镜下进行检测, 可以看到 GFP蛋白发出的荧光 (图 6) 。从图中可以看出, GFP 载体有较高的转化效率, 经过
35、暗培养后, 大部分细胞还保持有较完整的形态, 较高的生命活力。图中也存在一部分细胞碎片, 说明存在一部分的细胞死亡, 有一定比例的损失。图 2 瞬时表达载体组装图 Fig.2 Schematic representation of transient expression constructs 下载原图:Avr Pik;:Pik1-H4;:Pik2-H4图 3 瞬时表达载体 PCR检测图 Fig.3 Identification of the transient expression plasmid detected by PCR 下载原图M:1 kb Marker;1-6:Pik1-H4-G
36、FP;7-12:Pik2-H4-GFP;13-18:Avr Pik-GFP图 4 水稻叶鞘原生质体游离图 Fig.4 Isolation of rice leaf sheath protoplasts 下载原图a:水稻叶鞘游离过程图 Process of rice leaf sheath protoplasts;b:水稻叶鞘原生质体图 Observation of protoplasts isolation from leaf sheath为探索原生质体转化的最佳时间, 通过转化 GFP质粒, 设置不同的转化时间, 通过提取原生质体的总 RNA, 用实时荧光定量技术估测 GFP的相对表达量,
37、获得最佳转化时间为 1416 h相对表达量最高的转化时间为 16 h, 之后逐渐下降 (图 7) 。2.4 Pik1-H4、Pik 2-H4及 Avr Pik-H4的亚细胞定位大部分基因产物与特定的细胞器有一定的关联, 可通过亚细胞定位来探索该蛋白的功能以及蛋白相互作用的网络。将瞬时表达载体转染到水稻的原生质体中, 通过激光共聚焦扫描显微镜 63水镜观察到目标蛋白在水稻细胞内的具体表达部位。由图 8可知 Avr Pik-H4主要定位于细胞膜, Pik 1-H4主要定位于内质网, Pik2-H4主要定位于质体。Avr Pik-H4 蛋白被定位于水稻细胞膜上, 说明是一种膜蛋白或者积累于膜上的蛋白
38、, 通过某种形式运输到宿主细胞作为激发子触发一系列反应。从定位结果初步推定 Pik1-H4可能主要参与 Avr Pik蛋白的识别反应以及信号传递的作用, Pik 2-H4主要起到改变能量的传输方式及调控下游抗病引发过敏性坏死的作用。相比烟叶、洋葱表皮细胞的瞬时转化体系, 水稻叶鞘细胞更具有说服力, 有正确的蛋白合成系统, 能引导目标蛋白的正确折叠。图 5 酶解时间对原生质体产量的影响 Fig.5 Effect of digestion time on the yield of protoplasts 下载原图图 6 水稻叶鞘原生质体 GFP转化 Fig.6 GFP transformation
39、 of rice leaf sheath protoplasts 下载原图a:GFP荧光 GFP filter;b:白光 Bright field图 7 不同转化时间 GFP相对表达量 Fig.7 Relative expression of GFP in different transformation times 下载原图图 8 Avr Pik-H4、Pik1-H4 及 Pik2-H4亚细胞定位 Fig.8 Subcellular localization analysis of Avr Pik-H4, Pik1-H4 and Pik2-H4 下载原图2.5 Western blot验证收
40、集转化结束后原生质体, 提取总蛋白, 进行 Western blot验证, 结果如图 9所示。融合蛋白比目标蛋白分子量增加 30 k D左右, 用 Anti-GFP作为一抗进行孵育, 其中泳道 1是没有转入质粒的细胞总蛋白作为阴性对照, 泳道 2转入GFP质粒作为阳性对照, 泳道 35是目的片段与 GFP的融合蛋白, 与 Marker进行对照结果表明正确, 为亚细胞定位的准确性提供了有力证据。图 9 目标蛋白 Western blot验证 Fig.9 Detected target protein by Western blot 下载原图1:阴性对照 Negative control;2:阳性
41、对照 Positive control;3:Pik1-H4-GFP;4:Pik2-H4-GFP;5:Avr Pik-H4-GFP3 讨论水稻作为单子叶模式植物被广泛地应用于分子功能、遗传进化研究, 是探索基因组学和比较基因组学的有效工具24。利用水稻转基因植株进行基因功能研究存在周期长、生物安全性问题, 而水稻瞬时表达体系能在短时间内实现目标基因的高水平表达, 且保留原有的合成、修饰及转运蛋白的途径, 更有益于后续接近真实情况抗病相关蛋白的筛选。目前, 水稻系统的瞬时表达主要采用原生质体表达系统25、农杆菌侵染26方法, 相对来说原生质体的方法更便捷高效。水稻叶片表面的蜡质层含有 10%的硅胶
42、27, 不利于被纤维素酶降解, 而水稻幼苗叶鞘的硅胶含量较低28, 适合做原生质体游离的材料。本研究利用 1/2 MS培养基 25种植水稻幼苗, 得到了较好的游离效果。相对于土壤栽培, 培养基种植能提供更丰富均衡的营养, 提供了更高质的游离材料。PEG 与二价阳离子共价结合时能介导 DNA发生有效沉淀达到转化的目的。有研究表明载体分子量越大转化效率越低, BART 等29研究表明 12 kb质粒转化效率为 25%30%;YANG等13研究表明 5.9 kb质粒转化效率达到 70%左右, 3 kb 的 GFP质粒转化效率达到 90%以上;段炼等30用蔗糖密度梯度法纯化水稻原生质体, 质粒转化浓度
43、为 0.7gL 时转化效率达到 60%70%。本研究中, 4.7 kb 的GFP载体转化效率可达 95%以上, 融合 GFP的目的基因载体大小分别为5、7.7、8.2 kb, GFP 空载体与 Avr Pik-H4-GFP的转化效率相对稍高, 但并无太大差别。相对以前的报道, 本研究采用离心的方法对细胞进行收集, 相对蔗糖密度梯度纯化法简便高效, 利用实时荧光定量 PCR法得到最佳转化时间为1416h, 获得了较高的转化效率。Western blot 验证结果显示, Pik 1-H4-GFP与 Avr Pik-H4-GFP的表达量最高, 说明转化效率与质粒分子大小无显著的线性关系, 蛋白的表达
44、量则与蛋白本身的功能性质有关。PEG 介导的原生质体转化对 DNA属于无选择性吸收, 要同时保证质粒的高浓度及高质量才能获得较高的转化效率。Pik-H4位于水稻第 11号染色体, 由两个相邻的 NBS-LRR基因 Pik1、Pik 2组成, NBS-LRR类是水稻抗稻瘟病基因中最常见的编码结构域31。Pik-H4 位点存在7个等位基因 (Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pi1、Pike) , 对稻瘟病菌都具有广谱抗性32-33。利用水稻瞬时表达系统对 Pik-H4及 Avr Pik-H4蛋白的成功表达以及亚细胞定位对蛋白的功能研究有非常重要的意义, 可为揭示靶蛋白介导的抗性通路
45、提供依据。本研究表明在 H4幼苗接种 GD0193稻瘟病菌 24 h游离的原生质体中转入无毒蛋白 Avr Pik-H4后, 在短时间内大部分水稻细胞聚集成团呈现胶稠透明状发生过敏性坏死, 而对照品种中二软占则不会有此现象, 说明 Pik-H4介导的免疫反应是通过迅速而高效地引起宿主过敏性坏死实现的。该现象为目标基因在水稻叶鞘原生质体中的成功表达提供了有力证据。瞬时表达系统常用于靶蛋白的亚细胞定位, 如农杆菌侵染烟草34、洋葱35及拟南芥表皮瞬时表达36。介于异源表达系统蛋白修饰、转运存在差异可能出现的错定位, 同源表达系统的亚细胞定位结果更接近真实情况37。ZHAI 等38利用水稻原生质体表达
46、系统定位 Pikh-1、Pikh-2 及 Avr Pik-h均在细胞质和细胞核。靶基因的亚细胞定位对基因功能的研究有重要意义, 本研究中将目标蛋白分别与 GFP蛋白融合表达, 利用水稻叶鞘原生质体瞬时表达系统进行亚细胞定位, 观察到 Pik1-H4主要定位于内质网, Pik 2-H4主要定位于质体, Avr Pik-H4主要定位于细胞膜。Pikh 是 Pik-H4的等位基因, 二者定位结果出现差异的原因有两个: (1) CDS 碱基序列存在差异。Pikh-1 与 Pik1-H4的 CDS序列存在两个碱基的差异, Pikh-2 与 Pik2-H4的 CDS序列则完全相同, Avr Pikh 与A
47、vr Pik-H4的 CDS序列存在一个碱基的差异, 可能改变其在细胞内的定位; (2) 病原菌入侵时靶蛋白定位发生改变。本研究中的游离材料取自于接种稻瘟病菌24 h后的幼苗, 有研究表明一些抗病相关基因会随着病原菌的入侵而改变细胞中的定位, 由细胞核流向细胞质, 如定位于叶绿体的 NRIP1蛋白识别病原菌效应因子后, 会从叶绿体流向细胞质及细胞核39。有研究表明 Avr-Pikh与Pikh-1的 CC结构域互作产生相应的信号转导后, Pikh-2 使宿主产生相应的抗性38。初步推测 Pik1-H4主要起到一个无毒蛋白与宿主抗病的衔接作用, 识别外源物质入侵及启动防御信号传递给 Pik2-H4, 能够受到病原物的诱导而表达。Pik2-H4接收到信号以后通过调配代谢物的合成以及物质运输方式启动宿主的防
