1、大鼠 Scratch2 蛋白锌指结构域的表达与纯化 李岳亭 杨予涛 徐志卿 首都医科大学基础医学院 摘 要： 目的原核表达大鼠 Scratch2 基因的 C2H2型锌指结构域, 纯化获得 GST-C2H2融合蛋白。方法以新鲜大鼠前额叶脑组织 cDNA 为模板, 利用 PCR 扩增带有EcoR和 Xho酶切位点的 Scratch2 基因的锌指结构域后, 构建原核表达载体pGEX-4T-1-C2H2, 并将其转化至大肠杆菌 BL21 (DE3) , 经 IPTG 诱导融合蛋白表达, 再利用 MagneGST particles 亲和纯化 GST-C2H2融合蛋白, 最后通过Western Blot
2、 鉴定此融合蛋白。结果成功构建了 pGEX-4T-1-C2H2原核表达载体;在 20、0.2 mmol/L 的 IPTG 诱导下, GST-C 2H2融合蛋白即可有效地表达;经 MagneGST particle 纯化的 GST-C2H2蛋白可被识别 Scratch2 锌指结构域的抗体所识别。结论纯化的 GST-C2H2蛋白可用于后续研究。关键词： Scratch2; 锌指结构域; 原核表达; 蛋白纯化; 作者简介：李岳亭 (1992-) , 女, 北京人, 硕士生, 研究方向:神经生物学。作者简介：杨予涛 (1972-) , 男, 博士, 副教授, 研究方向:神经生物学, 在Nucleic
3、Acids Res、Oncogene 等期刊发表 SCI 论文 32 篇, 获专利授权 1 项。作者简介：徐志卿 (1963-) , 男, 博士, 教授, 研究方向:神经生物学, 在PNAS 等期刊发表 SCI 论文 90 篇。收稿日期：2017-03-10基金：国家自然科学基金项目 (“调节 GALR2 基因关键转录因子的鉴定及其在抑郁中的作用”, No.31271154;“甘丙肽及其受体在深部脑磁刺激抗抑郁过程中的作用机制研究”, No.81671345) Prokaryotic expression and purification of zinc finger domain of ra
4、t Scratch2 proteinYueting Li Yutao Yang Zhiqing Xu School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University; Abstract： Objective To express rat zinc finger domain of Scratch2 gene in prokaryotic cells and purify the GST-C2H2 fusion protein. Methods The zinc finger domain of Scratch2 gene was amp
5、lified by PCR and inserted into prokaryotic expression vector pGEX-4 T-1. The recombinant pGEX-4 T-1-C2H2 plasmid was transformed into E. coli BL21 ( DE3) and exogenous protein was induced by IPTG. After purification using MagneGST particles, the GST-C2H2 fusion protein was further identified by Wes
6、tern Blot analysis. Results The recombinant plasmid pGEX-4 T-1-C2H2 was constructed successfully.When BL21 ( DE3) cells transformed with pGEX-4 T-1-C2H2 were cultured at 20 and induced with 0. 2 mmol/L IPTG, GST-C2H2 fusion protein was expressed efficiently. In addition, the purified GST-C2H2 was fu
7、rther identified specifically by Scratch2 antibody. Conclusion The GST-C2H2 fusion protein was successfully expressed and purified, and it could be used to further study the function of Scratch2.Keyword： Scratch2; zinc finger; prokaryotic expression; protein purification; Received： 2017-03-10Snail 超
8、家族为一类具有锌指结构的转录因子, 主要作为转录抑制因子, 调控靶基因的表达。Snail 超家族又分为两个相关但又独立存在的种类:Snail 家族和 Scratch 家族。Scratch 家族非常保守, 在脊椎动物及非脊椎动物的发育过程中发挥着重要功能1-5。在哺乳动物中, Scratch 家族可分为 Scratch1 及 Scratch2 两大类。Scratch2, 也被称为 SCRT2, 大鼠的 Scratch2 基因编码区全长 918 bp, 定位于染色体20p13, 编码 306 个氨基酸, 分子量约为 40 k Da。Scratch2 与 Snail 超家族其它成员蛋白组成结构相似,
9、 即包括含有一个锌指结构域的 C-末端, 及一个含有SNAG 结构域 (由 MPRSFLVK 8 个氨基酸组成的高度保守序列) 的 N-末端, 且Scratch2 蛋白还包含一个在其它 Snail 超家族成员中未发现的 Scratch 结构域。Scratch 结构域高度保守, 其功能目前仍不清楚。Scratch2 蛋白 C-末端的锌指结构属于 C2H2型锌指结构, 该结构域由 2 个 -螺旋连接 1 个 -螺旋组成, 通过其 DNA 结合区与 DNA 大沟相结合, 可以识别靶基因的 E-box 顺式作用元件 (含有以 5-CAGGTG-3为核心序列的结合位点) , 再通过氨基末端的 SNAG
10、结构域而发挥转录的抑制作用6。研究表明 Snail 锌指转录因子家族蛋白通过调节细胞迁移, 抑制 E-cadherin 的表达, 引发上皮细胞间充质细胞转化 (EMT) , 进而在肿瘤转移、中胚层和神经嵴形成中起到关键的调节作用7-8。Scratch 作为一类新的 Snail 超家族成员, 其表达具有神经系统特异性1-5。但截至目前, 针对 Scratch 家族成员及其所调控的靶基因的研究还很少9, 其在中枢神经系统中的具体作用也不完全清楚。考虑到 Scratch 家族蛋白的锌指结构可以结合 E-box 顺式作用元件, 我们拟表达并纯化 Scratch2 蛋白的锌指结构域, 相关研究不仅有助于
11、探讨Scratch2 与相关靶基因 E-box 元件的结合情况, 也有助于筛选与其相互作用的蛋白, 为进一步揭示 Scratch2 的作用机理奠定基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 质粒及菌株原核表达载体 p GEX-4T-1、大肠杆菌 E.coli DH5 及 E.coli BL21 (DE3) 菌株均由笔者实验室保存。1.1.2 试剂Q5 高保真 DNA 聚合酶、限制性内切酶 Xho、EcoR、T4 DNA 连接酶、DNA marker 均购于 NEB 公司;DNA 凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购于 MN 公司;Trizol 购自 Invitrogen 公司;第一链 c DNA
12、合成试剂盒购于 Roche 公司;Magne GST particles 试剂盒购自 Promega 公司;PageRuler 预染蛋白 Ladder marker购自 Thermo 公司;兔源多克隆 Scratch2 抗体购自 Santa Cruz 公司;IRDye 680RD Goat anti-Rabbit Ig G (H+L) Secondary Antibody 购于 LI-COR 公司;异丙基-D-硫代半乳糖 (IPTG) 购自北京全式金生物技术有限公司;考马斯亮蓝 R-250 购于北京普利莱公司;所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成;测序由北京奥科鼎盛科技有限公司完成。1.2
13、 方法1.2.1 引物设计图 1 Scratch2 蛋白结构示意图 Fig.1 Structure and signature domains for Scratch2 protein 下载原图1.2.2 大鼠 Scratch2 基因锌指区域的 PCR 扩增提取新鲜 SD 大鼠前额叶脑组织, 根据 Invitrogen 公司 Trizol 试剂说明书提取组织总 RNA, 使用 Roche 公司反转录试剂盒, 按照说明书反转录合成 c DNA。以所得大鼠前额叶的 c DNA 作为模板, 按照 NEB 公司 Q5 超保真热启动 DNA 聚合酶说明书, 利用上述合成引物, 进行 PCR 扩增, 反应
14、程序为:94预变性 2 min;9430 s, 6030 s, 7215 s, 32 个循环;72终延伸 3 min。使用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物大小, 并按照凝胶回收纯化试剂盒说明书回收纯化。1.2.3 原核表达载体 p GEX-4T-1-C2H2的构建及鉴定使用 EcoR和 Xho对 PCR 回收产物及 p GEX-4T-1 空载体在 37条件下进行双酶切, 使用 T4 连接酶室温连接过夜, 并转化入大肠杆菌 DH5, 取含 50 mg/L 氨苄霉素的 LB 固体培养基平板, 吸取转化菌液接种其上, 倒置于 37温箱中培养过夜, 经菌落 PCR 筛选出阳性克隆并双酶切
15、鉴定, 后送至北京奥科鼎盛科技有限公司测序。1.2.4 融合蛋白 GST-C2H2的诱导表达条件优化及可溶性分析将重组质粒 p GEX-4T-1-C2H2转化入感受肽 E.coli BL21 (DE3) , 取含 50 mg/L氨苄霉素的 LB 固体培养基平板进行筛选, 将转化后菌液接种于平板, 倒置于37温箱过夜培养。隔日取 5 m L 同样含有 50 mg/L 氨苄霉素的 LB 液体培养基于无菌摇菌管, 并挑取单克隆菌落接种其中, 37恒温、200r/min 培养过夜。次日按 1100 的比例, 将培养物加入到 25 m L 新鲜的 LB 培养基中, 200 r/min、37摇床中震荡培养
16、至其对数生长中期, OD 值为 0.60.8 时, 取 1 m L 菌液作为未诱导阴性对照, 剩余菌液分别每组取 2 m L 进行不同诱导温度及不同诱导剂浓度的诱导表达。设置不同诱导温度为 16、20、25及 30组, 不同诱导剂终浓度分别为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 组, 均以 200 r/min 恒温震荡诱导 4 h。每个诱导条件分两组各取 1 m L 菌液于无菌 EP 管, 离心收集菌体。一组直接加入 40L 的 1SDS 上样缓冲液, 吹打混匀后 100煮 10 min 使蛋白变性获得全菌蛋白;同时 PBS 重悬另外一组离心后菌体, 冰上超声破碎后离心,
17、 分别收集上清和沉淀组蛋白。将以上所获得蛋白及未诱导对照组共同经 10%SDS-PAGE 电泳及考马斯亮蓝染色检测各组目的蛋白的表达形式及表达量。1.2.5 GST-C2H2融合蛋白的纯化取 1 m L 按照最优表达条件诱导所得菌液, 离心弃上清收集菌体, 加入 200L裂解液, 4混合震荡 30 min 后, 利用 Promega 公司的 Magne GST particles试剂盒及配套磁力架, 按照说明书通过 GST-C2H2蛋白与磁粉的结合从而对其进行纯化。结合在磁粉上的融合蛋白用 40L 的谷胱甘肽洗脱, 加入 5SDS 上样缓冲液, 100煮 10 min 使蛋白变性后, 经 10
18、%SDS-PAGE 电泳, 考马斯亮蓝染色, 脱色液脱色, 检测目的蛋白纯化效果。1.2.6 Western Blot 鉴定 GST-C2H2融合蛋白将纯化后的 GST-C2H2融合蛋白及由新鲜 SD 大鼠脑组织提取的腹侧海马总蛋白和前额叶总蛋白经 SDS-PAGE 电泳后电转移至 PVDF 膜上, 用 10%的脱脂奶粉室温封闭 3 h, 加入 11 000 稀释的兔抗 Scratch2 多克隆抗体, 4孵育过夜, TBST 洗膜 3 次, 每次 10 min, 加入 110 000 稀释的羊抗兔荧光标记二抗, 室温于摇床上孵育 1 h, 使用 ODYSSEY 双色红外激光成像系统进行扫膜并保
19、存图像。2 结果与分析2.1 Scratch2 基因锌指结构域区段的 PCR 扩增提取 SD 大鼠前额叶脑组织总 RNA, 并进一步反转录作为 c DNA 模板, 以 Scrt2-F 及 Scrt2-R 为引物, 利用 NEB 公司的高保真、热启动的 Q5 DNA 聚合酶, 扩增大鼠 Scratch2 基因下游 C2H2型锌指结构域, 然后使用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物。如图 2 所示, 我们观察到 500bp 左右的扩增产物, 与预期片段大小相符。图 2 Scratch2 基因 C2H2 型锌指结构域区段的 PCR 扩增结果 Fig.2 PCR products of t
20、he C2H2-type zinc finger domain of Scratch2 gene 下载原图注解:M:DNA marker;1:Scratch2 基因锌指结构域区段的 PCR 扩增结果。Note:M:DNA marker;1:PCR products of the zinc finger domain of Scratch2 gene.2.2 原核表达载体 p GEX-4T-1-C2H2的构建及鉴定使用 EcoR和 Xho限制性内切酶对以上 PCR 回收产物及 p GEX-4T-1 空载体进行双酶切, 酶切产物经纯化回收后, 经过 T4 DNA 连接酶连接, 转化大肠杆菌DH5,
21、 选取菌落 PCR 阳性重组子, 经 EcoR和 Xho双酶切鉴定, 图 3 为 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果, 两条目的片段大小分别约为 501bp、4 900 bp, 与预期相符, 初步判断目的基因已经成功插入载体。测序结果与 Gen Bank 上公布的大鼠 Scratch2 基因 3-端锌指结构域的序列对比结果进一步证实, 重组质粒 p GEX-4T-1-C2H2构建成功。图 3 重组质粒 p GEX-4T-1-C2H2 的酶切鉴定 Fig.3 Identification of p GEX-4T-1-C2H2by restriction enzyme digestion 下载原图注解
22、:M:DNA marker;1:阳性克隆 1 的酶切结果;2:阳性克隆 2 的酶切结果。Note:M:DNA marker;Lane 1, 2:Identification of two recombinant p GEX-4T-1-C2H2digested by EcoRand Xho.2.3 GST-C2H2融合蛋白的诱导条件优化及可溶性分析2.3.1 GST-C2H2融合蛋白诱导温度的确定挑取转化后的重组 p GEX-4T-1-C2H2-BL21 单克隆菌落, 以 37、200 r/min 震荡培养至其对数生长中期, 取 1 ml 未加诱导剂菌液作为对照, 剩余菌液加入IPTG 使终浓度
23、为 0.2 mmol/L, 分别于 16、20、25及 30摇床中诱导 4 h。分别离心收集菌体, 通过 SDS-PAGE 凝胶电泳及考马斯亮蓝染色, 检测不同诱导温度下的 GST-C2H2融合蛋白的表达量。结果 (图 4) 所示, 可见诱导组均在 38 k Da 处出现明显条带, 与预期蛋白的大小一致, 且在 20下诱导, 目的蛋白表达量最高。同时超声破碎不同温度组诱导后菌体, 离心后分别收集上清和沉淀, 经 SDS-PAGE 电泳检测其可溶性。结果 (图 5) 所示, GST-C 2H2融合蛋白在不同温度诱导下在沉淀和上清中均有表达。综合考虑, 选用 20为最佳诱导温度。2.3.2 GST
24、-C2H2融合蛋白 IPTG 诱导浓度的确定将 p GEX-4T-1-C2H2重组质粒转化大肠杆菌 BL21, 挑取单克隆菌落以 37、200 r/min 震荡培养至其对数生长中期, OD 值为 0.60.8 时, 先取 1 ml 菌液留作未诱导对照, 剩余菌液在 20条件下, 分别以用终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的 IPTG 诱导 4h。离心收集菌体, 通过 SDS-PAGE 凝胶电泳及考马斯亮蓝染色, 检测不同 IPTG 诱导浓度诱导下 GST-C2H2融合蛋白的表达量。结果 (图 6) 所示, 0.2 mmol/L IPTG 即可诱导目的蛋白在大肠杆菌中
25、的有效表达, 且重组蛋白表达量随着 IPTG 浓度提高并无明显变化。对上述不同浓度 IPTG 诱导组菌体超声后上清和沉淀的可溶性分析结果 (图 7) 所示, GST-C 2H2融合蛋白在不同 IPTG 诱导浓度下在沉淀中的表达很高, 而在上清中表达较少。考虑到高浓度 IPTG 对细胞有毒性, 故确定 p GEX-4T-1-C2H2质粒的最佳诱导条件为 20下、以 IPTG 浓度为 0.2 mmol/L 诱导 4 h。图 4 GST-C2H2 融合蛋白在不同温度诱导下的 SDS-PAGE 分析 Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expr
26、ession under different induction temperature 下载原图注解:M:SM0671 蛋白分子量 marker;1:未诱导对照;25:分别为 16、20、25和 30条件下, 经终浓度 0.2 mmol/LIPTG 诱导菌体总蛋白。Note:M:Protein weight marker SM0671;Lane 1:uninduced control;Lane 2-5:Total protein induced with 0.2 mmol/L IPTG at different induction temperature.图 5 不同温度诱导 GST-C2H
27、2 融合蛋白在上清和沉淀中的对比 Fig.5 Comparison of GST-C2H2fusion protein in the supernatant and precipitation induced under different induction temperature 下载原图注解:M:SM0671 蛋白分子量 marker;14:分别为 16、20、25和 30条件下, 经终浓度 0.2 mmol/L IPTG 诱导产物;S:上清;P:沉淀。Note:M:Protein weight marker SM0671;Lane 1-4:induced with 0.2 mmol/L
28、 IPTG at different induction temperature;S:supernatant;P:precipitation.图 6 GST-C2H2 融合蛋白在不同浓度 IPTG 诱导下的 SDS-PAGE 分析 Fig.6 Expression analysis of GST-C2H2fusion protein induced by different concentration of IPTG 下载原图注解:M:SM0671 蛋白分子量 marker;1:未诱导对照;26:分别为 20条件下, 经终浓度 0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol/L IPTG
29、 诱导全菌蛋白。Note:M:Protein weight marker SM0671;Lane 1:uninduced control;Lane 2-6:Total protein induced at 20with different concentration of IPTG.2.4 GST-C2H2融合蛋白的纯化在 20、0.2 mmol/L IPTG 的条件下, 诱导 GST-C2H2重组蛋白, 收集菌体, 然后加入 200L 裂解液, 4混合震荡 30 min。后利用 Promega 公司的 Magne GST particles 试剂盒中谷胱甘肽偶联的磁粉结合纯化 GST-C2H
30、2融合蛋白。SDS-PAGE 结果如图 8, 可见 GST-C2H2已得到较好纯化。2.5 Western Blot 鉴定 GST-C2H2融合蛋白Scratch2 蛋白分子量大小约为 40 k Da, 而其 C2H2型锌指结构蛋白约为 18 k Da, GST-C2H2融合蛋白由于多了一个 GST 标签 (约 20 k Da) 故蛋白分子量预计大小约为 38 k Da。SDS-PAGE 电泳后, 使用 Scratch2 特异性抗体进行 Western Blot 检测结果如图 9 所示, 大鼠前额叶脑组织总蛋白及腹侧海马总蛋白样品在40 k Da 处可见清晰条带, GST-C 2H2融合蛋白纯
31、化样品在 38 k Da 处有单一清晰的显色条带, 证实了 GST-C2H2融合蛋白成功有效表达。图 7 不同浓度 IPTG 诱导下 GST-C2H2 融合蛋白在上清和沉淀中的对比 Fig.7 Comparison of GST-C2H2fusion protein in the supernatant and precipitation induced by different concentration of IPTG 下载原图注解:M:SM0671 蛋白分子量 marker;15:分别为 20条件下, 经终浓度0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol/L IPTG 诱导产物;
32、S:上清;P:沉淀。Note:M:Protein weight marker SM0671;Lane 1-5:GST-C2H2induced at 20with different concentration of IPTG;S:supernatant;P:precipitation.图 8 GST-C2H2 融合蛋白纯化的 SDS-PAGE 分析 Fig.8 Analysis of GST-C2H2fusion protein purification 下载原图注解:M:SM0671 蛋白分子量 marker;1:纯化后 GST-C2H2 蛋白。Note:M:Protein weight m
33、arker SM0671;Lane 1:Purified GST-C2H2protein.图 9 纯化后 GST-C2H2 融合蛋白的 Western Blot 检测 Fig.9 Western Blot analysis of GST-C2H2protein 下载原图注解:1:大鼠前额叶总蛋白;2:大鼠腹侧海马总蛋白;3:纯化后 GST-C2H2 蛋白。Note:Lane 1:The total protein of rat prefrontal;Lane 2:The total protein of rat ventral hippocampus;Lane 3:Purified GST-C
34、2H2fusion protein.3 讨论诸多的研究表明 Scratch 家族在神经系统中均有表达1-5,10, 但关于其在中枢神经系统中的作用及机制的研究却很少。果蝇 Scratch1 基因作为 Scratch 家族中第一个被发现的成员, 表达于所有的神经前体细胞中1。前期研究表明, Scratch 蛋白在神经干细胞中表达, 并具有保守的促神经元分化作用1-5,11。Nakakura 等人发现 Scratch 可能通过与 b HLH 转录因子竞争结合 E-box 序列, 从而发挥调节神经元分化的作用10。在神经系统形成过程中, Notch 信号网络在神经干细胞的分化与再生过程中发挥着重要作
35、用, 最新研究发现 Scratch也可通过直接调节 Notch 靶基因的转录而阻断神经元 Notch 通路12。Scratch2 作为 Scratch 家族的重要成员, 在发育中的神经系统表达丰富13, 其可以通过抑制有丝分裂后期的原代神经元中 miR-25 的表达而维持细胞周期稳定, 防止神经元的退化和死亡14。最新研究表明 Scratch2 还同时可通过抑制P53 正向细胞凋亡调控因子 puma 的表达而促进神经元存活5。但是, 关于Scratch2 在神经发生及细胞迁移中涉及的机制尚不清楚, 研究者推测中间可能涉及与 b HLH 转录因子的竞争拮抗作用及 EMT 类似机制15。蛋白的原核
36、表达可大量、快捷、经济的获得目的蛋白, 为顺利研究各种蛋白的功能提供了基础及可能。影响原核蛋白表达量的因素很多, 为了得到较多的GST-C2H2融合蛋白, 本研究分别从温度及 IPTG 诱导浓度两方面对诱导条件进行了优化。实验发现虽然温度变化对蛋白的可溶性影响不大, 但 20诱导条件下, 目的蛋白的表达量最高, 因此我们选择 20为最佳诱导温度。在实验的 5 个IPTG 诱导浓度下, 目的蛋白表达量及可溶性差异并不明显, 但考虑到 IPTG 对菌体代谢的毒性作用, 我们选用能有效诱导目的蛋白的最低 IPTG 浓度为最适诱导浓度。由于偶联谷胱甘肽的磁粉可以和 GST-C2H2融合蛋白特异的结合,
37、 我们通过亲和层析的方法对 GST-C2H2融合蛋白进行纯化, 得到了纯度较高的重组融合蛋白, 同时 Western Blot 实验也进一步证实重组融合蛋白的正确性。4 结论成功构建了 p GEX-4T-1-C2H2原核表达载体, 有效表达并纯化获得了具有Scratch2 免疫活性的 GST-C2H2融合蛋白, 并探讨了其最佳诱导条件为 20、0.2 mmol/L 的 IPTG 浓度。为后续深入研究 Scratch2 转录因子的作用机制及与其神经疾病发生的相关性奠定了基础。参考文献 2Emery JF, Bier E.Specificity of CNS and PNS regulatory
38、subelements comprising pan-neural enhancers of the deadpan and scratch genes is achieved by repressionJ.Development, 1995, 121 (11) :3549-3560. 3Dam TM, Kim HT, Moon HY, et al.Neuron-specific expression of scratch genes during early zebrafish developmentJ.Molecules and Cells, 2011, 31 (5) :471-475.
39、4Marn F, Nieto MA.The expression of Scratch genes in the developing and adult brainJ.Developmental Dynamics, 2006, 235 (9) :2586-2591. 5Rodrguez-Aznar E, Nieto MA.Repression of puma by scratch2 is required for neuronal survival during embryonic developmentJ.Cell Death and Differentiation, 2011, 18 (
40、7) :1196-1207. 6Barrallo-Gimeno A, Nieto MA.Evolutionary history of the Snail/Scratch superfamilyJ.Trends in Genetics, 2009, 25 (6) :248 7Nieto MA, Huang RY, Jackson RA, et al.EMT:2016J.Cell, 2016, 166 (1) :21-45. 8Puisieux A, Brabletz T, Caramel J.Oncogenic roles of EMT-inducing transcription facto
41、rsJ.Nature Cell Biology, 2014, 16 (6) :488-494. 10Paul V, Tonchev AB, Henningfeld KA, et al.Scratch2 modulates neurogenesis and cell migration through antagonism of b HLH proteins in the developing neocortexJ.Cerebral Cortex, 2014, 24 (3) :754-772. 11Yan B, Memar N, Gallinger J, et al.Coordination o
42、f cell proliferation and cell fate determination by CES-1 snailJ.PLOS Genetics, 2013, 9 (10) :e1003884. 12Ramat A, Audibert A, Louvet-Valle S, et al.Escargot and Scratch regulate neural commitment by antagonizing Notch activity in Drosophila sensory organsJ.Development, 2016, 143 (16) :3024-3034. 13Vieceli FM, Sim9es-Costa M, Turri JA, et al.The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitorsJ.Gene Expression Patterns, 2013, 13 (5-6) :189-196.
