1、细菌基因组 DNA 提取试剂盒（离心柱法） PBZ02071 20 次 180.00 (Bacteria Genomic DNA Mini Preparation Kit） PBZ02072 50 次 420.00 简介 本试剂盒用于极大部分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌细胞基因组 DNA的提取。 该试剂盒提供的方法简单易行，通过去垢剂处理和特殊的液体系统将裂解细胞后产生的 DNA结合在柱材上，避免酚仿抽提。所获的基因组 DNA具有完整性好、产量大、纯度高和稳定性好等特点。可以满足 PCR、酶切、分子杂交和文库构建等各种分子生物学实验需要 。 试剂盒组成 离心柱及收集管 各 20 个 溶菌酶缓冲液
2、 ELB 6 ml 裂解液 GDL 6 ml 缓冲液 GDB 6ml 蛋白洗涤液 PWB 12ml 洗涤液 WB 20ml 蛋白酶 K 340l 洗脱液 EB 15ml 需自备的试剂 无水乙醇，溶菌酶 (用于革兰氏阳性菌破壁处理 )， RNase A(25mg/ml)。 保存条件及有效期 试剂盒保存在室温（ 1530）。试剂如出现混浊或结晶，可以将试剂瓶置于 55水浴加热，溶液变清亮后再使用。本试剂盒有效期为 12 个月。蛋白酶 K 含 50的甘油及稳定剂，请置于 20可保存更长时间。 操作步骤 所有离心步骤皆使用台式离心机，为室温下操作。 第一次使用前请先参考试剂瓶上的标签，在洗涤液 WB中
3、加入无水乙醇。 1. 取适量的细菌培养液（最多提取的细菌数量为 2 109个）， 10,000rpm离心 1分钟，弃上清，留细菌沉淀备用。 2. 提取的细菌为革兰氏阴性菌，可以在菌体沉淀中加入 200l裂解液 GDL。用吸头吹打几下，充 分混匀。然后进入步骤 4。 3. 提取的细菌为革兰氏阳性菌，必须要进行溶菌酶破壁处理（如不确定为何种菌属，请按处理革兰氏阳性菌的方法进行）。 具体操作如下：称取 20mg溶菌酶，置于 1.5ml离心管中，取 1ml溶菌酶缓冲液 ELB，反复吹打几次将溶菌酶完全溶解，配制成溶菌酶裂解液。向细菌沉淀中加入 200l溶菌酶裂解液（未用完的溶菌酶裂解液可保存于 20，
4、以备下次使用），吹打重悬细菌沉淀。 37破壁处理 30分钟以上，一些较难处理的细菌可以延长处理时间。破壁处理完成后便可以将水浴温度调至 70备用。 4. RNA清除处理，补加 5lRNase A溶液，充分混匀。 5. 加入 15l蛋白酶 K，充分混匀。 6. 加入 220l缓冲液 GDB充分混匀。加入缓冲液 GDB可能会出现白色沉淀，放置于 70水浴时便会消失。 7. 对于革兰氏阴性菌 70保温 15分钟（革兰氏阳性菌需 70保温 30分钟）。等溶液变成清亮后，离心数秒去除管壁上的水珠。如果溶液未变清凉，说明细菌裂解不充分，起始菌量太大，需要适当调整。 8. 加入 220l的无水乙醇， 剧烈
5、振荡，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。 9. 将离心柱装在收集管上，然后将所得的溶液及沉淀都转移入离心柱中 。 12,000rpm离心 1分钟，倒掉收集管中的滤液。 10. 加入 500l蛋白清洗液 PWB， 12,000rpm离心 1分钟。倒掉收集管中的 滤液。并将离心柱放回收集管中。 11. 加入 500l洗涤液 WB， 12,000rpm离心 30秒。（使用前请检查是否已经加入无水乙醇） 12. 重复步骤 11的操作一次。 13. 12,000离心 1分钟， 去掉离心柱中的所有液体。 将离心柱放在一个干净的新的 1.5ml离心管中， 置于 37烘箱放置 510分钟，待管中的乙醇全部挥发
6、为止。 14. 往离心柱中央悬空滴加经 70水浴预热的100- 200l洗脱液 EB。室温放置 2分钟后， 12,000rpm离心 30秒，洗脱 DNA到离心管中。为了得到更多的 DNA，可以再加 100200l洗脱液 EB，室温放置 2分钟后，再次洗脱 DNA。 15. 取 10lDNA进行 0.8琼脂糖电泳检测提取 DNA的完整性和质量。 注意事项 1. 起始菌量对 DNA提取的产量和质量有很大影响。起始菌量过多会引起细菌裂解不充分，导致堵塞离心柱。一般情况下， LB液体培养基培养的大肠杆菌细菌在对数生长期中后期时的细菌浓度约为 107108个 /ml 之间。 OD600在 1.0时，大肠
7、杆菌浓度大致为 109个 /ml。过夜（ 1216小时）培养细菌 OD600值大约为 2.0。不同细菌因菌株特性和培养条件差异会有很大差异，为了获得准确的计数，可以通过测定 OD600值和稀释法测定克隆形成单位 (CFU)相结合的方法来确定。 2. 确定所提细菌的归属关系也是一个重要的影响因素。革兰氏染色（ Gram stain）是细菌分类和鉴定的重要性状。它不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用 G+表示；染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用 G表示。细胞壁成分和结构的差异造成两类细菌对革兰氏染色的不同反应。 G+菌的细胞壁主要是由
8、肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫 碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，故呈蓝紫色； G细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫 碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，故呈红色。 3. 革兰氏阳性细菌主要包含细菌中的厚壁菌门 (Firmicutes)（低 G+C革兰氏阳性细菌）和放线菌门(Actinobacteria)（高 G+C革兰氏阳性细菌）。厚壁菌门包括的常见菌属：归类于芽孢杆菌纲 (Bacilli)的芽孢杆菌 (Baci
9、llus)、李斯特氏菌 (Listeria)、葡萄球菌 (Staphylococcus)、链球菌 (Streptococcus)和肠球菌(Enterococcus)； 归类于梭菌纲 (Clostridia)的常见属梭菌 (Clostridium)和归类于柔膜菌纲 (Mollicutes) 的支原体 (Mycoplasma)。放线菌门常见菌属如放线菌 (Actinobacteria)和双歧杆菌 (Bifidobacterium)。 4. RNase A配制：将称好的RNase A完全溶于10mmol/L TrisHCl（pH7.5），0.15 mmol/L Na Cl的溶液中，500l每管分装到 1.5ml离心管中。100煮10分钟。然后冷却至室温，-20保存备用。
