1、302 分子诊断与治疗杂志2015年9月 第7卷第5期J Mol Diagn Ther，September 2015，Vo17 No5 硫酸脱氢表雄酮化学发光微粒子免疫法定量测定试 剂的研制 黄明聪- 张晓硎 林光华z翁祖星 孙旭东 葛胜祥。张军。 摘要 目的研制硫酸脱氢表雄酮化学发光免疫定量检测试剂。 方法利用硫酸脱氢表雄酮 人工完全抗原免疫小鼠，通过杂交瘤技术制备特异性抗硫酸脱氢表雄酮单克隆抗体，采用竞争抑制法建 立硫酸脱氢表雄酮化学发光免疫定量检测试剂。 结果筛选获得了27株稳定分泌抗硫酸脱氢表雄酮 的单克隆抗体细胞株，建立了化学发光微粒子免疫法定量测定硫酸脱氢表雄酮的试剂盒雏形，与雅培
2、公 司的硫酸脱氢表雄酮定量检测试剂在检测临床标本上的相关系数r达O99以上。 结论本研究为国 产化硫酸脱氢表雄酮化学发光微粒子免疫法定量测定试剂盒的研发奠定了基础。 【关键词】 硫酸脱氢表雄酮；化学发光微粒子免疫法；定量试剂盒 Development of chemiluminescent microparticle immunoassay for quantitative determination of dehy droepiandrosterone sulfate HUANG Mingcong ，ZHANG Xiaoli ，LIN Ouanghua。，WENG Zuxing ，SUN X
3、udong ，GE Shengxiang ， ZHANG Jun0 (1Xiamen Innodx Biotech Co，Ltd，Xiamen，Fujian，China，361022；2Clinical Laboratory Department， Fujian Medical University Union Hospital，Fuzhou，Fujian，China，350001；3National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Disease，Xiamen University，Xiamen，F
4、ujian，China，361 102) 【ABSTRACT】 Objective To develop chemiluminescent microparticle immunoassay for quantitative determination of dehydroepiandrosterone sulfateMethods Mice were immunized by dehydroepiandrosterone sulfate artificial complete antigenMonoclonal antibodies against dehydroepiandrosteron
5、e sulfate were prepared by hybfidoma techniqueChemiluminescent microparticle immunoassay for quantitative demrmination of dehy droepiandrosterone sulfate was developed based on competitive binding method Results 27 monoclonal antibodies were obtainedChemiluminescent microparticle immunoassay for qua
6、ntitative determination of dehy droepiandrosterone sulfate prototype kit was establishedThe coefficient r of testing specimens with reagent from Abbott company was over O99Conclusion Development of domestic chemiluminescent microparticle immunoassay for quantitative determination of dehydroepiandros
7、terone sulfate reagent was laid foundation by this stuay KEY WORDS】Dehydroepiandrosterone sulfate； Chemiluminescent microparticle immunoassay； Quantitative determination kit 基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)(2011AA02A101) 作者单位：1厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，福建，厦门361022 2福建医科大学附属协和医院检验科，福建，福州350001 3厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，
8、福建，厦门361102 通讯作者：张军Emall：zhangjxmueducn 注：黄明聪和张晓硎为并列第一作者 论著 分子诊断与治疗杂志2015年9月 第7卷第5期J Mol Diagn Ther，September 2015，Vo17 No5 303 硫酸脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone su1 fate，DHEAs)是脱氢表雄酮(dehydroepiandros terone，DHEA)的硫酸酯形式，是一种主要由肾上 腺皮质分泌的甾醇类激素 。作为雄性激素和雌 性激素的前体，DHEAs是人体中含量最丰富的甾 醇类物质，在人血清中的含量比DHEA高250 500倍，
9、比睾酮高100 500倍，比雌二醇高1 000 10 000倍。 。循环血液中的DHEAs并不具备雄 性和雌性激素的生物学活性。运送到靶组织后经 脱硫酸化生成DHEA，进而转变为不同的雄性和 雌性激素化合物，发挥生物学功能。在临床上， DHEAs的定量检测常用于多毛症、女性男性化及 多囊性卵巢综合症的辅助诊断。当发生肾上腺肿 瘤时DHEAs的水平也会异常升高 DHEAs的定量检测方法主要有液相色谱质 谱联用法和免疫检测法7-8。液相色谱一质谱法由于 其样品前处理复杂，仪器昂贵，耗时长，其应用受 到限制。免疫学检测方法包括放射免疫法、酶联免 疫法和化学发光微粒子免疫法(chemiluminesc
10、ent microparticle immunoassay，CLIA)。其中CLIA灵 敏度高、线性范围宽、再现性好、易于实现自动化 和高通量检测，已逐渐成为临床检测中的主流方 法。目前，国内只有罗氏、雅培、西门子和贝克曼等 国外大公司的DHEAs CLIA定量检测试剂上市， 价格昂贵，研制国产化的DHEAs化学发光免疫定 量检测试剂十分必要。 1材料与方法 11 材料 111试剂 人工完全抗原DHEAsBSA、DHEAsOVA由 本实验室自行合成，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐 剂购自Sigma公司，吖啶酯来自于厦门大学。 112临床血清标本 临床血清标本来源于厦门大学。 113仪器 Berth
11、old Sirius单管式化学发光检测仪为德国 Berthold Technologies公司产品：PHOMO全自动 酶标仪为安图生物公司产品。 114实验细胞、动物 骨髓瘤细胞Sp20一Agl4由本实验室保存； Balbc小鼠和F1小鼠均购自上海斯莱克实验动 物有限责任公司。 115耗材 细胞培养板购自美国Thermo Nunc公司：96 孔酶标板购自厦门怡佳美实验器材有限公司：细胞 冻存管为德国Greiner公司产品：磁微粒Dynabeads M一270购自美国Lifetechnologies公司。 12方法 121小鼠免疫 取68周龄的Balbc小鼠。人工完全抗原 DHEAsBSA和佐剂
12、乳化后皮下注射小鼠，初次免 疫注射100 Ixg抗原，加强免疫注射50 g抗原，免 疫间隔周期为3w，加强免疫3针后，眼眶后静脉 丛采血46滴，分离血清后检测血清效价，取效价 高的小鼠进行脾脏免疫。 122单克隆抗体的筛选 小鼠脾脏免疫72 h后取脾脏细胞与骨髓瘤细 胞融合。融合5 d7 d后换液，间接酶联免疫吸附 试验和间接竞争酶联免疫吸附试验筛选阳性克 隆，采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化。 123单克隆抗体的制备 取F1小鼠，向腹腔中注射05 mL的液体石 蜡油；3 d后，向腹腔中注射对数生长期的杂交瘤 细胞约lxl0 个；7 d一14 d后，抽取腹水，离心取上 清。上清经饱和硫酸铵
13、沉淀后用Protein A亲和层 析柱纯化单克隆抗体。 124磁珠包被 磁微粒用MEST(10 mmolL MES，pH 60， 005Tween 20)洗涤2次后加人新配制的EDC 活化30 min，用MEST洗涤2次；加入抗体或抗 原，37反应3 h；用MEST洗涤5次，用含2酪 蛋白的磷酸盐缓冲液重悬后于4c保存。 125吖啶酯标记 取50 g抗原或抗体加入到600 IxL01 molL 的PBS(pH 80)中，加入5 L l mmolL吖啶酯， 混匀。室温避光反应1 h：加赖氨酸溶液反应15 min然后4透析至20 mmolL pH 65的PBS中 12 h。 126间接竞争酶联免疫
14、吸附试验 包被：包被抗原用20 mmolL的CBS(pH 96)稀释至2 lxgmL，每孔加100 IxL，37恒温 箱中放置2 h。封闭：取出酶标板，用PBST(20 mmolL PBS，pH 60，01Triton-xloo)洗l遍。 304 分子诊断与治疗杂志2015年9月 第7卷第5期J Mol Diagn Ther，September 2015，Vo17 No5 每孑L加入180 L封闭液，37恒温箱中放置2 h。弃 去封闭液，将板拍干。加样：加人梯度稀释的血清或 细胞上清和梯度稀释的DHEAs各50 L，混匀后于 37恒温箱中孵育30 min，PBST清洗5遍。加酶标 二抗：每孔加
15、入酶标二抗100 IxL，于37恒温箱中 孵育30 min，PBST清洗5遍。显色：将混合后加 100 于孔中，37恒温箱中孵育15 min。终止并 读值：2 molL硫酸终止反应，用酶标仪读值。 127管式化学发光免疫分析实验 1271 竞争模式一 向微孔板中依次加入包被 DHEAsBSA的磁微粒50 L、梯度稀释的DHEAs 20 L和按l：500稀释的吖啶酯标记DHEAs单克 隆抗体50 L，水浴37反应25 min；用PBST(20 mmolL PBS。pH 60，01TritonX100)洗4遍； 将反应孔中的磁微粒转移至反应杯中，用单管式 化学发光检测仪检测发光值。 12_72竞争
16、模式二 向微孔板中依次加入50 L包被DHEAs单克隆抗体的磁微粒，20 L梯度 稀释的DHEAs，50 L按1：500稀释的吖啶酯标记 DHEAsBSA水浴37反应25 min：用PBST(20 mmolL PBS，pH 60，01TritonX100)洗4遍； 将反应孔中的磁微粒转移至反应杯中，用单管式 化学发光检测仪检测发光值。 1273 DHEA对DHEAs定量检测的干扰向微 孔板中依次加入50 L包被DHEAs单克隆抗体的 磁微粒，分别加入2O L同等浓度的DHEAs、 DFIEA及DHEAs和DEHA的混合物，5O L按 1：500稀释的吖啶酯标记DHEAsBSA，水浴37反 应2
17、5 rain；用PBST(20 mmolL PBS，pH 60，01 TritonXl00)洗4遍；将反应孔中的磁微粒转移至 反应杯中，用单管式化学发光检测仪检测发光值。 2结果 21 DHEAs单克隆抗体的制备 211小鼠免疫和单克隆抗体筛选小鼠加强免 疫3针后，血清效价达l：210s以上，间接竞争 ELISA的结果显示免疫血清中存在DHEAs和 DHEA特异性抗体(图1)。选择效价高的小鼠取脾 脏与骨髓瘤细胞融合并进行单克隆抗体的筛选。 结合间接ELISA和间接竞争ELISA筛选 DHEAs特异性抗体，获得了27株稳定分泌抗 DHEAs抗体的杂交瘤细胞。 ，-、 替 、 jL 赶 埒 蛏
18、图1 DHEAsBSA免疫小鼠血清的竞争抑制性 Figure 1 Competitive inhibition ability of DHEAsBSA immune serum 212单抗性质鉴定 27株DHEAs单克隆抗体的效价均在l：lxl0 以上均特异性识别DHEAs，不与氢化可的松、甲 羟孕酮、B一雌二醇发生交叉反应，但能结合DHEA (图2)。其中2D1、3C4两株单抗对DHEAs的亲和 力明显高于对DHEA的亲和力选择这2株单抗 作为试剂建立的原料。 l5。 100 曩 。 羹 O 2ONBS DHEAs DHEA 氢化可的松 甲羟孕酮 D一雌二醇 8 l6 32 64 128 2
19、56 512 抑制物浓度fngmL) 图2 DHEAs单克隆抗体的竞争抑制性 Figure 2 Competitive inhibition ability of DHEAs Mabs 22 DHEAs化学发光免疫定量测定法的建立 221竞争模式的选择 分别用DHEAsBSA抗原和DHEAs单克隆抗 体包被磁微粒，并用吖啶酯标记DHEAsBSA抗原 和DHEAs单克隆抗体，以竞争抑制法建立DHEAs 的化学发光免疫测定方法检测系列稀释的 DHEAs。用双对数法拟合剂量反应曲线，结果显示 2种竞争模式的定量检测结果与样品稀释倍数均 有较好的线性相关，但标记抗体的斜率更优(表1)。 分子诊断与治疗
20、杂志2015年9月 第7卷第5期J Mol Diagn Ther，September 2015Vo17 No5 305 DHEASBSA DHEASBSA DHEAs 2D1 DHEAs 3C4 DHEAS 2D1 DHEAs 3C4 DHEAsBSA DHEASBSA Y=-04511x+65609 Y=-05225x+59748 Y=-10564x-4-75028 Y：一10120x+66467 09619 09903 09772 O9935 222 DHEA对DHEAs定量检测的干扰 在同等浓度下，抗体对DHEAs显示出更高的 亲和力(图3)，当DHEAs和DHEA以同等浓度存 在时，D
21、HEA并不影响抗体与DHEAs的结合，加 上生理条件下DHEAs的浓度是DHEA的250 500倍。 ，因此检测临床标本时DHEA对DHEAs 定量检测影响很小。 65 60 盈55 ：50 迎坚45 嚣 40 35 10 15 20 25 30 35 分析物浓度(1StgaL) DHEA DHEAs DHEA+DHEAs 图3 DHEA对检测的干扰 Figure 3 Interference ofDHEA on demction 2。23与国际主流同类产品的初步比较 选取35份不同背景值的临床血清标本，分别 用Abbott DHEAs定量测定试剂盒和本研究建立 的DHEAs CLIA法定量测
22、定试剂检测DHEAs的 含量，结果显示本研究建立的试剂盒与Abbott的 试剂盒在检测临床血清标本上相关性良好相关 系数r在099以上(图4)。 3讨论 决定化学发光免疫定量测定试剂性能的参数 主要有检测灵敏度、线性范围、特异性等。对于小 分子半抗原的免疫定量检测试剂，特异性是影响 其检测准确性的一个重要因素。DHEAs是小分子 半抗原物质，外周血中存在着许多结构类似的甾 毫 詈 蚕 县 襟 万泰凯瑞DHEAs( g，dL】 图4临床血清标本检测相关性评价 Figure 4 Correlation of measuring specimens 醇类激素化合物。此外还有DHEA在化学结构上 与其
23、只相差一个磺酸基，因此。难以获得DHEAs 高特异性抗体。本研究中筛选获得的单克隆抗体 均能特异性地识别DHEAs，与B一雌二醇、甲羟孕 酮、氢化可的松这三种甾醇类激素均无交叉反应， 且部分抗体对DHEAs的亲和力明显高于DHEA。 选用此类抗体使得DHEA对DHEAs的定量检测影 响很小。并且在人血清中DHEAs的含量比DHEA 高250500倍3_ 。因此本研究中建立的DHEAs CLIA定量检测试剂虽然对DHEA有一定的交叉 反应但其对临床标本的检测影响很小。 本研究筛选获得了DHEAs特异性的单克隆 抗体。建立了DHEAs化学发光微粒子免疫检测法 定量检测雏形试剂盒。初步评价特异性和定
24、量准 确性良好。 参考文献 1】 Van Voorhees EE，Dennis MF，Calhoun PS，et a1 Association of DHEA，DHEAS， and cortisol with childhood trauma exposure and postffaumafic stress disorderJInternational Clinical Psychopharmacology， 2014，29(1)：56 (下转第322页) 322 分子诊断与治疗杂志2015年9月第7卷第5期J Mol Diagn Ther，September 2015，Vo17 No5 血
25、浆 图3血浆与对应血清测值相关性分析散点图 Figure 3 The scatterplot of correlation analysis ofthe serum and plasma (电化学发光法)为对照试剂，对自制的癌胚抗原定 量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)进行临床检 测性能评价。同对照试剂比较，自制试剂盒的正常 符合率为978，异常符合率为961，总符合率为 973；Kappa值为0931(P001)；两者测值相近， 相关系数达0987(P001)，线性回归方程为Y= 0091+1009X相关性良好。采用BlandAirman统 计学方法对两组测定结果进行分析有972的点 在一致
26、性界限内，两者的测定结果具有较高的一致 性。且通过对同一病例的血清与血浆的测值比较， 两者测值一致，相关系数，值达0991(P0O1)，说 明本试剂盒适用于人血清或血浆中CEA含量的检 测。同时，不受甲胎蛋白、类风湿因子、抗核抗体、溶 血、脂血、黄疸的干扰。说明自制的试剂盒与目前临 床广为应用的进口试剂在指标检测性能上具有良 好的等效性，可替代国外昂贵试剂应用于临床检测 和基础医学的研究。 参考文献 【l】 Gold P，Freedman SODemonstration of tumor-specific antigens in human colonic carcinomata by imm
27、unologi caltolerance and absorption techniquesJJ Exp Med， 1965，121：439462 2】 尚高峰，张翠歌癌胚抗原检测的临床意义J】内蒙古 中医药，2014，33(33)：5758 【3】 潘丽兰血清CEA、CA199、CA125、CA153、AFP联合 检测对胃癌的诊断价值J中国实验诊断学，2013，17 (12)：2192-2195 【4】 张海英癌胚抗原和糖类抗原125联合检测在肺癌诊 断中的应用【J】检验医学与临床，2013，(24)：3335 3336 【5】 卢灿荣，张士武，张勇，等联合检测癌胚抗原、糖链抗 原199和C
28、反应蛋白对结肠癌的诊断价值【J】_标记 免疫分析与临床，2012，19(1)：36 【6】 农天雷常用化学发光免疫分析技术及其特点fJ1现 代医药卫生，2011，27(14)：21562158 (上接第305页) 2】 Van Voorhees EE，Dennis MF，McClemon FJ，et a1 The association of dehydroepiandrosterone(DHEA)and DHEA sulfate(DHEAS)with anxiety sensitivity and electronic diary negative affect among smokers
29、with and without posttraumatic stress disorderJJournal of Clinical Psychopharmacology，2013，33(4)：556 【3】 Sceborg T，Frederiksen H，Fruekilde P，et a1Serum concentrations of DHEA，DHEAS，17ahydroxyproges terone，A4一androstenedione and testosterone in children determined by TurboFlow-LC-MSMSJClinica Chim ic
30、a Acta，2013，419：95-101 4】 Urbanski HF，Mattison JA，Roth GS，et a1Dehy droepiandrosterone sulfate(DHEAS)as an endocnne marker of aging in calorie mslfiction studiesJExper imental Gerontology，2013，48(10)：11361139 【5】 Goodai MO，Carmina E，Azziz RDHEA，DHEAS 【6】 【7】 【8】 and PCOSJThe Journal of Steroid Bioch
31、emistry and Molecular Biology，2015，145：213225 Jim6nez MC，Sun Q，Schfirks M，et a1Low dehy droepiandrosterone sulfate is associated with increased risk of ischemic stroke among womenJStroke，2013， 44(7)：l784一l789 Azziz R，Chang WY，Stanczyk FZ，et a1Effect of bi lateral oophorectomy on adrenocorticat function in women with polycystic ovary syndromeJFertility and Sterility，2013，99(2)：599604 Hildreth KL，Gozansky WS，Jankowski CM，et a1As sociation of serum dehydroepiandrosterone sulfate and cognition in older adults：Sex steroid，inflammatory， and metabolic mechanisms【J】Neuropsychology，2013， 27(3)：356
