1、环球中医药2015年9月第8卷第9期Global Traditional Chinese Medicine，September 2015Vo18N09 宽筋藤药材UPLC特征图谱研究 迟森森韩丹刘斌 【摘要】 目的建立宽筋藤药材的超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatographv UPLC)特征图谱，为宽筋藤药材的整体质量分析和评价提供参考依据。方法 采用Waters Acqnitv C， 色谱柱(21 mmx50 mm，17 Ixm)，流动相01甲酸乙腈溶液(A)一01甲酸水溶液(B)，梯度 洗脱，流速为05 mLmin，柱温为3O，检测波长为32
2、0 nm。采用聚类分析和特征图谱相似度分 析对16批不同地区的宽筋藤商品药材UPLC特征图谱进行评价。结果 建立了宽筋藤药材的 UPLC特征指纹图谱共有模式，共标定了35个共有峰。聚类分析将16批宽筋藤商品药材分为4类 特征罔谱经同家药典规定的相似度计算软件计算，整体相似度良好。结论本研究建立的宽筋藤 药材特征罔谱的特征性和专属性强，方法准确、可靠、重复性好，可用于宽筋藤药材的整体质量控制 和评价。 【关键词】 宽筋藤； 特征图谱； 超高效液相色谱； 聚类分析； 质量控制 【中图分类号】 R2841 【文献标识码】 A doi：103969jissn1674 1749201509o13 Stu
3、dy on UPLC specific chromatogram of caulis tinosporae sinenisis C-SensenHAN DanUU Bin School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China Corresponding author：L1U Bin，Email：liubinyn67163COrn 【Abstract】Objective To establish the ultra performance liquid chroma
4、tography(UPLC)specific chromatogram of caulis tinosporae sinenisis，in order to provide reference basis for overall quality analysis and evaluation of caulis tinosporae sinenisisMethods Analysis was performed on the Waters Acquity C J8 column(21 minx50 mm，17 m)，the acetonitrile with01formic acid(A)一0
5、1formic acid(B) was adopted as mobile phase in gradient elution mode，and monitored tinder 320 rim wavelengthThe flow rate was set at 05 mLmin and the column temperature was set at 30 oCSixteen batches of caulis tinosporae sinenisis medicinal material samples collected from different areas were analy
6、zed by hierarchical clustering analysis(HCA)and similarity analysis(SA)to evaluate the UPLC specific chromatogram Results Thirtyfive common peaks were selected to establish the UPLC specific chromatogram of caulis tinosporae sineuisisSixteen batches of medicina1 matedaI samples were classified as fo
7、Hr clusters by HCA and a good overall similarity was calculated by the overall similarity software specified in the national phar macopeiaConclusions The established method for specific chrornatogram by UPLC with better characteristic and specificity was accurate，reliable and repeatable，which could
8、be applied to the overall quality control and evaluation of caulis tinosporae sinenisis 【Key words】Caulis tinosporae sinenisis；Specific chromatogram；UPLC：Hierarchical cluster analysis； Quality control 基金项目：北京中医药大学自主选题(2013一JYBZZXS116) 作者单位：100102北京中医药大学中药学院迟森森(硕士研 究生)、韩丹、刘斌1 作者简介：迟森森(1990一)，女，2014级在
9、读硕士研究生。研究 方向：中药(复方)有效成分(组分)发现与新药创制 Email： ml7801085298163toni 通讯作者：刘斌(1967一)，博士，教授。研究方向：中药(复方)有 效成分(组分)发现与新药创制。Email：liubi“yn67163c。m 1085 论著 宽筋藤Tinosporae sinenisis(Lour)Merr来源于 防己科植物中华青牛胆的干燥藤茎，具有祛风止 痛，舒筋活络的功效，中医用其治疗风湿痹痛，腰肌 劳损，跌打损伤 。宽筋藤在藏医药中又名“勒 哲”，甘露之池中记载“勒哲味甘、苦、涩、辛，化味 甘、酸，性润、凉、温，治龙、赤巴合并症、培根病、风 湿病
10、、风热病” 。药理研究表明宽筋藤药材提取 1086 环球中医药2015年9月第8卷第9期Global Traditional Chinese Medicine，September 2015，Vo18，No9 物具有抗氧化、抗炎、保肝和免疫调节等方面药理 活性l4 ，这是其所含的生物碱类、甾体类、萜类、香 豆素类和氨基酸等成分协同作用的结果 。但目 前国内有关宽筋藤药材活性成分的研究报道比较 少，缺乏整体性的化学表征。且其在广东、海南、广 西和云南等地多有分布各地区宽筋藤商品药材品质 差异未能有效区分，其质量控制标准几乎处于空白阶 段。由于中药化学成分的复杂多样性，因此任何单一 成分含量高低均不
11、能准确完整的评价一味中药的质 量 ，基于此，本文采用超高效液相色谱法，建立多元 梯度洗脱模式测定了16批宽筋藤商品药材饮片的 UPLC特征指纹图谱，可从整体上表征宽筋藤药材的 成分信息，为其整体质量控制提供科学依据。 1仪器与试药 11仪器 Waters Acquity超高效液相系统，包括二元高压 梯度泵、25 L可调进样器、柱温箱、PDA全波长检 i贝0器和Waters Enprower 3色谱数据处理工作站(美 国Waters公司)：Saofious BT 25S型十万分之一电 子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)； KQ一500DE超声波清洗器(昆山超声仪器有限公 司)。 12试药 宽
12、筋藤药材购自全国14个不同地区，分别为安 国、成都、广州、桂林、毫州、昆明、南京、梧州、武汉、 新疆、玉林、湛江、青海和北京，共16批样品，标号为 S1S16。乙腈(Sigmaaldrich公司，色谱纯)，试验 用水均为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯；所 有试剂用前均经022 m微孔滤膜滤过。 2方法 21色谱条件 色谱柱为Waters Acquity Cl8柱(21 171150 ITlm，17 m)，PDA检测器，流动相为01甲酸乙 腈溶液(A)一01甲酸水溶液(B)，采用梯度洗脱 (0030分钟，5A；3060分钟，579 A；60 75分钟，7983A；7590分钟， 83 92A：
13、90105分钟，92一96 A：1O5145分钟，96144A；145170 分钟，144162A；170190分钟， 162188A：190240分钟，188250 A：240250分钟，25O255A)，柱温 30流速05 mLmin，检测波长320 HITI，进样量 2 L。 22样品溶液的制备 取宽筋藤药材粉末(60目)约1 g，精密称定，置 100 mL具塞锥形瓶中，精密加人甲醇80 mL称定重 量，超声(功率250 W，频率20 KHz)提取3O分钟， 摇匀，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，过滤。 滤液减压回收溶剂至干，残留物用甲醇溶解并定容 至2 mL，经022 Ixm微孑L滤
14、膜滤过，取续滤液作为 供试品溶液。 23方法学考察 231 精密度试验精密吸取同一供试品溶液，连 续进样6次，按“21”项下色谱条件进行检测，记录 各共有峰保留时间和峰面积，以峰19(t =17532 分钟)为参照物，计算结果显示35个共有峰相对保 留时间RSD在002084之间相对峰面积 RSD在051282之间，表明仪器精密度良 好，符合指纹图谱检测要求。 232稳定性试验精密吸取同一批供试品溶液， 按“21”项下色谱条件分别于制备后0，3，6，9，12， 24小时进行检测，记录各共有峰保留时间和峰面 积，以峰19(t =17532分钟)为参照物，计算结果 显示35个共有峰相对保留时间RS
15、D在004 095之间，相对峰面积RSD在048293之 间，表明样品在24小时内稳定性良好。 233 重复性试验取同一批次宽筋藤药材粉末 (60目)6份，每份约1 g，精密称定，按“22样品溶 液的制备”项下方法制备供试品液按“21”项下色 谱条件进行检测。记录各共有峰保留时间和峰面 积，以峰19(t =17532分钟)为参照物，计算结果 显示35个共有峰相对保留时间RSD在001 034之间，相对峰面积RSD在0，70299之 间，表明该方法重复性良好。 24宽筋藤特征图谱的构建和解析 241 宽筋藤共有峰的确定 取14个不同地区 16批宽筋藤商品药材样品，按“22样品溶液的制 备”项下方
16、法制备供试品溶液，按“21”项下色谱条 件对各批宽筋藤药材进行分析检测，记录各色谱峰 保留时间和峰面积。确定在16批宽筋藤特征图谱 中出峰时间基本一致、峰面积较大的35个峰为共有 特征色谱峰，其共有峰面积之和均占原有色谱图所 有峰面积的90以上，结果见图1、2。其中19号峰 (t =17532分钟)分离度较好，且保留时间和峰面 环球中医药2015年9月第8卷第9期Global Traditional Chinese Medicine，September 2015，Vo18，No9 积适中，因此选择19号峰作为内参比峰，计算其他 各色谱峰对内参比峰的相对保留时间和相对峰面 积。结果显示各共有峰相
17、对保留时问的RSD值在 001106之间说明16批样品之间的共有模 式稳定，而相对峰面积的RSD值则比较大，说明不 12190 9135 60l8O 3024 一O31 1087 同批次宽筋藤商品药材之间的质量存在一定差异。 242 聚类分析将16批宽筋藤商品药材的UPLC 图谱中共有峰的峰面积值标准化处理，运用SPSS 160软件对其进行系统聚类分析，采用组间连接 法，利用欧式距离作为样品的测度，可将样品分为4 O00 362 725 1087 1449 1812 2174 2537(分钟) 91I35 608O 3O24 O31 图1 16批宽筋藤商品药材UPLC色谱图(320 nm) 0
18、O0 362 725 l087 1449 1812 2174 2537(分钟) 0 桂林s5 北京S16 毫州s6 南京s8 安国S1 广 12 s4 湛江SI3 玉林S12 青海S15 新疆S11 成都s2 昆明S7 福卅I S9 武汉l SIO 武沈S14 广州】s3 图2宽筋藤商品药材UPLC特征图谱(320 llm) 5 1O 1 5 2O 25 图3 16批宽筋藤商品药材聚类分析 一 一 0一 0 0_一 “一0一llI _。_0 一0： =。 一 ： 0 一一 q 0 ： #I 誊 ! m l|一 = 一 一 。 一 一 一 一 吩 ：0 一 一 。 一_l。0 一_l ， ” |
19、： 一。 一一 1088 环球中医药2015年9月第8卷第9期Global Traditional Chinese Medicine，September 2015，Vo18，No9 类，结果见图3。聚类分析结果表明宽筋藤商品药 材质量差异在全国分布无明显地域特征，但在一些 相邻的省份药材质量较为相似。S9和S7，S13和S4 分别在同一类中，可能是宽筋藤作为民族药，主产 于广州、广西、云南 省南部。S1、S16、S6、S8均在 同一类中，则可能是由于安国和亳州为中药材市场 的聚集地，而北京和南京分别紧邻这两个城市购 买地相似所致。S15、S2、S11均在同一类中，可能是 这3批药材的购买地都地
20、处中国的西部，货源相似。 243 特征图谱相似度计算 采用国家药典委员 会中药色谱特征图谱相似度评价系统(2004A) 对l6批宽筋藤商品药材的UPLC图谱进行相似度 分析以所建立的宽筋藤特征图谱共有峰作为参 照，分别进行时间窗的设定、谱峰匹配，进行相似度 计算，结果见表1。由表1可知，16批宽筋藤商品药 材相似度在07790969之间。其中1 1批商品药 材相似度在0900以上，药材质量较好。而购自安 围、桂林、新疆、北京和湛江的宽筋藤商品药材相似 度在07790879之间，药材质量一般。 表1 16批宽筋藤商品药材相似度分析结果 No 相似度 No 相似度 S1 0879 s9 0969
21、S2 O901 Sl0 0963 S3 0941 S11 O813 s4 0951 S12 091O S5 0854 Sl3 0779 s6 0938 Sl4 0963 S7 0936 S15 09l0 S8 0928 S16 0854 3讨论 通过对提取方式(超声、加热回流)，药材粉碎 度(40、60、80目)，提取溶剂(甲醇、70甲醇、50 甲醇)，溶剂倍量(10、20、40、80、160倍量)，提取时 间(15、3O、45、60分钟)进行考察，最终确定宽筋藤药 材提取方法为：药材粉碎至60目，加入80倍量甲醇 溶液，超声提取30分钟(功率250 W，频率20 KHz)。 分别考察了乙腈一
22、水、01甲酸乙腈溶液、 01甲酸乙腈溶液一01甲酸水溶液3个流动相 系统结果表明采用01甲酸乙腈溶液01甲 酸水溶液流动相系统，各峰分离度较好，且基线平 稳最有利于特征图谱的分析。同时采用Waters二 级管阵列检测器对检测波长进行了选择，通过比较 254 Ylm、320lm和340IITI检测波长下的色谱网，以 图谱提供的色谱峰的信息量和峰面积为考察指标， 发现在320 nm波长下，色谱峰信息量最大，因此选 择320 nm为检测波长。 在中药色谱特征图谱相似度评价系统(2004A 版)的辅助下，得出了宽筋藤药材的UPLC对照特征 图谱。比较16批宽筋藤商品药材特征图谱后发现， 不同地区宽筋藤
23、药材特征图谱中主要峰群的整体 图貌基本一致，相似度在07790969之问，说明 不同地区药材中各成分含量的相对比值有所差别。 这种在共性特征基础上存在的个体差异是常见的 现象，因为药材生产过程中受到土壤、气候、环境因 素及采收加工过程中很多因素的影响，通过量化比 较可以为选购原料药材及指导GAP提供质量信息。 特征图谱是目前控制中药材质量最有效、最直 观的手段之一。有关宽筋藤药材的质量控制在中 国药典和各地方药材质量标准中没有详细的规定。 本文采用UPLC方法，建立了宽筋藤药材的特征图 谱。结果表明该方法稳定、可靠、重现性好，可为宽 筋藤药材质量分析、评价与控制提供依据。 参考文献 湖南植物志
24、编辑委员会湖南植物志f M1长沙：湖南科学技 术出版社，2000768-769 吴凤荣，曾聪彦戴卫波宽筋藤的药理作用和临床应用研究 进展J中国执业药师，2014，11(12)：3740 汀苏新医学院编辑委员会中药大辞典(上册)M上海：人 民出版社，1977：219，11391393 Bhagyashri N，Rohan K，Prashant B，et a1 Ctreparative hepatoprotective potential of Tinospora eordifolia，Tinospora sinensis and NeemguduehiJ British Journal ol P
25、harmaceutical Research，2013，3(4)：906-916 Manjrekar PNJolly CI，Narayanan SComparative studies of the imnmnomodulatory activity of Tinospora eordifolia and Tinospora sinensisJFitoterapia，2000，71(3)：254 薛强，罗莹，许小林宽筋藤提取物对小鼠抗炎作Hj的实验研 究J右江医学，2014，42(3)：285-287 彭川丛，梁英娇中药指纹图谱研究进展J实川t中医药杂 志，20lO，26(11)：810812 (收稿日期：2015_0202) (本文编辑：董历华)
