1、 7O6 国际检验医学杂志2O09年7月第30卷第7期1ntj LabMed，July 2009，Vo130，No7 壳聚糖、甲壳素对大肠埃希菌生物被膜清除的作用 胡金树 王彦荣 张丽娟 孙艳 赵建宏 【关键词】壳聚糖； 埃希氏菌属； 生物膜 中图分类号：R3782；R9694 文献标识码：B 文章编号：16734130(2009)o7 70602 生物被膜是病原菌黏附于生物材料和病变组织表面后，通 过分泌藻酸盐多糖蛋白复合物将自身克隆积聚包裹于其中而 形成的一层膜样物，是由藻酸盐多糖基质、嵌在基质中的多个 菌落及水通道组成的立体结构 。在自然界中，99 的细菌以 生物被膜形式存在 I。生物被
2、膜在医学材料相关感染 。 和慢 性感染疾病中起着重要作用 ，使临床治疗非常棘手。本文拟 研究天然高分子物质对生物被膜的清除作用，以期拓展对其相 关疾病治疗的视野。 材料与方法 1材料 1)实验菌株：大肠埃希菌ATCC25922，购自 卫生部临床检验中心。2)主要试剂、材料：相对分子质量5 000、30万、100万的壳聚糖，脱乙酰度大于85 (美国B10s ZUNE LIFE SCIENCES公司)。相对分子质量9O万的甲壳素 (浙江金壳生物化学公司)。气管导管：产品规格为80 ram(广 州市韦士泰医疗器械有限公司)。 2方法 1)生物被膜模型的建立：取隔夜培养的大肠 埃希菌肉汤，用分光光度计
3、在600 nm处调至吸光度为0145， 作为菌悬液。吸01 mI 菌悬液滴入含有49 mL生理盐水及 l cm导管的无菌杯中(导管水平放置)，36培养，隔日更换生 理盐水|_5。7天后，将导管的外壁用75 酒精擦拭，并用生理 盐水冲洗其内壁、外壁和套囊孑L。2)生物被膜的温育和清 除6 ：用3 乙酸配制10 的甲壳素和不同相对分子质量壳 聚糖溶液。将已处理的生物被膜模型，分别放入3 乙酸溶 液、10 的甲壳素和不同相对分子质量壳聚糖的酸性溶液5 mL中，在36 C孵育，分别在模型放入前(O h)和模型放入后第 48 h、第96 h时细菌计数。设3 乙酸溶液组为第1组、相对 分子质量5 000壳
4、聚糖酸溶液为第2组、相对分子质量3O万 壳聚糖的酸溶液为第3组、相对分子质量100万的壳聚糖酸溶 液为第4组、甲壳素酸溶液为第5组。每组l2例，取平均值。 3)细菌计数：将孵育一定时间的模型切成大致相等的数块，放 入有1 mI 胰酶的无菌试管中，36温箱孵育2 h。用漩涡振 荡器振荡10 rain，此为原液，系列稀释5份，取原液和每份稀释 液l f|分别接种于血培养板，36。C培养48 h时细菌计数。每 组l2例，取平均值。 3统计学方法 采用SPSSI10统计软件进行数据处 理，设P005时有统计学意义。 D0I：103760cmajissn16734130200907038 基金项目：国家
5、科技基础条件平台工作重点项目(2005DKA21 202-6) 作者单位：061001河北沧州市中心医院检验科 通讯作者：赵建宏，Email：zhah一2002yahooeom 结 果 经验交流 由于生物被膜培养时的条件和作为载体的导管规格、长度 相同，所以未放入酸溶液前的细菌计数值均为：22910 cfu mL。放入酸溶液后第48 h时实验1、2、3、4、5组细菌计数值 依次是(10 cfumL)：395、l。52、3。33、37O和38O；第2、 3、4和5组分别与第1组(对照组)比较，第2和第3组有统计 学意义(PO05)，说明相对分子质量5 000、30万壳聚糖溶液 在作用48 h时能
6、清除形成7 d大肠埃希菌生物被膜；第2和第 3组比较差异有统计学意义(PO05)，说明相对分子质量5 000壳聚糖比3o万壳聚糖清除作用更明显(PO05)。96 h 时实验1、2、3、4和5组的细菌计数值依次是(10 cfumL)： 217、129、170、18O和184；第2、3、4和5组分别与第1组 (对照组)比较，差异只有第2组有统计学意义(P005)，说 明相对分子质量5 000的壳聚糖在作用96 h时仍具有清除大 肠埃希菌生物被膜作用。 讨 论 甲壳素的化学名称是(1，4)一2一乙酰氨基一2一脱氧一 I)_葡萄 糖。甲壳素脱乙酰基后的产物是壳聚糖，化学名称为(1，4)一2一 氨基一2
7、一脱氧一t3一D-葡聚糖。壳聚糖是天然聚阳离子多糖衍生 物，有抑制肿瘤l_7、免疫调节 、促进止血l9、降血脂8等医用 价值。 马瑞等研究2 的不同相对分子质量壳聚糖溶液对形成4 h血链球菌生物被膜的作用时发现：小相对分子质量壳聚糖对 生物被膜的脱落效果最好 。本实验得出：5 000相对分子质 量壳聚糖对形成7天的大肠埃希菌生物被膜的清除作用显著 而持久，与马瑞等研究结果基本一致。国外研究 表明12 1O。相对分子质量的壳聚糖在温育10 min时就有杀灭浮游大 肠埃希菌的作用。本实验中相对分子质量3O万的壳聚糖在 48 h时具有清除作用，而在96 h已不能清除细菌，说明壳聚糖 清除大肠埃希菌生
8、物被膜是有时间限制的。壳聚糖使生物被 膜细菌减少的机制，可能有多种原因：其一是壳聚糖作为多聚 阳离子两性电解质，可附着于生物被膜黏附的底物及细菌表 面，改变了两者的电荷性质，减少了两者的相互作用和改变了 细菌表面的疏水性，从而导致生物被膜的脱落；其二是由于壳 聚糖灭活细菌后的自然减少。 既然小相对分子质量壳聚糖对生物被膜具有清除作用，可 尝试将小相对分子质量壳聚糖作为治疗生物被膜相关感染的 新药或器具来研发，如何能够安全有效地用于临床，有待于进 一步研究。 参 考 文 献 1Wilson MBacterial biofilms and human disease(下转第708页) 7O8 国际
9、检验医学杂志2009年7月第30卷第7期Int j Lab Med，July 2009，Vo130，No7 细胞的显色反应，引起白细胞结果偏高；5)尿糖达到+， 或尿比密度大于1030，或尿液中含大量的头孢菌素或庆大霉 素时，可引起白细胞结果偏低，而出现与镜检结果不符的现象； 6)大量服用维他命c、肝泰乐、阿托品后会造成尿液自细胞呈 假阴性结果。 尿液pH的影响 一般情况下，随机尿液的pH为468，尿液中的许多化 学检查项目都受pH变化影响_2。 1尿液pH增高 1)测定时尿标本必须新鲜，放置过 久，细菌分解尿液成分可导致尿液pH改变；2)当肾脏分泌的 尿液含有过多检碳酸氢盐和碳酸缓冲对时，放
10、置时间过长，使 尿液中的二氧化碳自然扩散到空气中，使尿液pH增高；3)尿 液受到脓、血、细菌的污染后检测；4)常以植物性食物为主者。 2尿液pH降低 1)在测定过程中，试剂带浸泡时间过 长，尿pH呈减低趋势；2)常以动物性食物为主；3)尿糖阳性标 本放置时问过长；4)剧烈运动后、大汗、应激状态下以及饥饿时 检测；5)应用氯化钙、氯化氨、氯化钾等药物治疗时检测。 尿胆红素、尿胆原 尿胆红素、尿胆原为黄疸的辅助检查，用于鉴别溶血性、肝 细胞性和阻塞性黄疸。在实际工作中会经常收集到不同程度 的肉眼血尿，但所测得的尿胆红素和尿胆原的结果阳性是假阳 性。 影响因素：1)标本必须新鲜以免胆红素被氧化成胆绿
11、素， 强烈的阳光会加速此反应，放置时间长可使尿胆原氧化成尿胆 素；2)尿液中含有高浓度的维他命C或亚硝酸盐时，会抑制重 氮耦合反应，可能出现假阴性结果；3)由于分析试纸无尿胆原 阴性的梯度，因此，分析试纸不能用来检测尿胆原的减少或消 失；4)尿液中的一些内源性物质如胆色素原、吲哚、胆红素等， 可使测试结果出现假阳性。另外，尿液中含有大量维他命C 或亚硝酸盐时，可抑制重氮耦合反应，使测试结果偏低甚至出 现假阴性。 尿酮体 尿酮体用来发现糖尿病酮症酸中毒和饥饿状态。 影响因素：1)由于尿酮体中的丙酮和乙酰乙酸都是挥发性 物质；乙酰乙酸受热易分解成丙酮；尿液被细菌污染后，酮体消 失，因此，尿样必须新
12、鲜，检测应该及时，以免测试结果偏低或 出现假阴性；2)干化学法测定酮体时对乙酰乙酸的敏感度约是 丙酮的7io倍，因此，与其他的检测方法存在一定的差别；3) 服用双胍类降糖药如降糖灵后，由于药物抑制细胞呼吸，也可 能出现酮尿。尿液放置时间过长，酮体由于易挥发而使结果偏 低或呈假阴性。 结 语 因此，作者认为临床实际工作中，对尿液隐血(BLD)和沉 渣显微镜RBC及轻度蛋白尿阳性结果要综合分析，在考虑到 常见生理因素影响的同时，不要忽略了工作性质，避免误诊、误 治，造成不必要的纠纷。 参考 文 献 13丛玉隆尿液常规自动化检验控制Jl临床检验杂志，1995，13 (6)：318-319 2潘静，魏
13、明竟对尿液检验中几个问题的新认识J国外医学临 床生物化学与检验分册，2004，25(1)：92-95 3黄忠清肉眼血尿标本用尿分析仪测尿胆红素尿胆原会产生假阳 性IJ临床检验杂志，1995，13(2)：109 (收稿日期：20080814) (上接第706页) JSci Prog，2001，84(Pt 3)：235254 2Fergie N，Bayson R，Pearson JPIs otitis media with effusion a biofilm infectionJ?Clin Otolaryngol Allied Sci，2004，29(1)： 3846 3Darouiche RO
14、Treatment of infections associated with surgical implantsJN Engl J Med，2004，35O(14)：14221429 4Palmer JNBacterial biofilms：do they play a role in chronic si nusitisJ?Otolaryngol Clin North Am，2005，38(6)：1193一 l2O1 5Ishida H，Ishia Y，Urosaka Y，et a1In vitro and in vivo activi ties df levofloxacin again
15、st biofilm producing pseudomonas aerugi nosa刀Antimicrob Agents Chemother，1998，42(7)：1641 1645 6Xie Y，Zhou NJ，Gong YF，et a1Th immune respouse induced by H pylori vaccine with chitosan as adjuvant and its relation to immune protectionJWorld J Castroenterol，2007，13(10)： 15471553 7Rao SB，Shama CPUse of
16、chitosan as a biomaterial studies on its safety and hemostatic potentialJJ Biomed Mater Res， l997，34(1)：21-28 8Ausar SF，Morcillo M，Leon AE，et a1Improvement of HDL- and LDL cholesterol levels in diabetic subjects by feeding bread containing chitosanJJ Med Food，2003，6(4)：397399 r 9Gerasimenko DV，Avdienko ID，Bannikova GE，et a1Antibacte rial effects of watersoluble lowmolecular-weight chitosans on different microorganismsJPrikl Biokhim Microbiol，2004，40 (3)：301306 1o马瑞，朱敏，刘正不同分子量的壳聚糖对血链菌生物膜的脱落 作用J上海口腔医学，2006，15(4)：407410 (收稿日期：20081121)
