1、克拉霉素对细菌生物被膜作用的研究进展260ClinicalMedicalJofChim,2003.Vo1.10,N.2 中国临床压亏 2003 年 4 月第【0 卷第 2 期克拉霉素对细菌生物被膜作用的研究进展祝敏芳综述瞿介明何礼贤审校(复旦大学附属中山医院肺科,上海 200032)一综述ProgressinEffectofClarithromycinonBacterialBiofilm:aReviewoftheLit-eratureZhuMinfangQ“JiemingHeLixian(DepartmentofPulmonology,ZhongshanHospital,FudanUni-ve
2、rsity,Shanghai200032)细菌生物被膜,又称菌膜(bacterialbiofilm)是单一或多种细菌在不利于其生长的环境下,产生藻酸盐多糖使细菌相互黏连形成膜状物附于病灶的表面或导管内.这是细菌为适应环境维持自身生命所发生的形态学的变化,从而增强了细菌对外环境的抵抗力.这也成为一些细菌对抗生素产生广泛耐药的重要原因.临床上许多顽固性,难治性感染可能均与形成细菌生物被膜有关.1 细菌生物被膜及其相关疾病1978 年 Costerton1J 首先描述:细菌黏附于组织或其他物体表面时,产生一个含有微菌落的基质层,使细菌得以与组织或物体表面相结合,随着黏着的微菌落的增大和数目增多,这些
3、包着微菌落的基质融合而形成了生物被膜.此后人们对细菌生物被膜引起了重视,发现临床上很多疾病均与之有关.在各种慢性细菌性感染性疾病的组织表面和各种导管及体内的人工置留物,如起搏器,人工股骨头,人工瓣膜等,都可以发现细菌生物被膜.甚至“蛀牙“也是菌膜病之一.由于细菌有了生物被膜的保护,不但躲避了人体内细胞和体液免疫机制的清除,甚至以往对其有效的抗生素也失效,造成临床上很多顽固性,难治性感染性疾病.人们发现在自然界环境中生物被膜普遍存在,只要条件成熟,任何细菌都可以形成细菌生物被膜,而铜绿假单胞菌,大肠杆菌,葡萄球菌更容易形成.研究者在试管中只放入 0.9%氯化钠和细菌的附着物 Teflon 片,加
4、入分纯的铜绿假单胞菌菌落,培养6d 就形成了厚厚的细菌生物被膜.进一步研究 L2J发现细菌生物被膜的主要成分是藻酸盐,己糖,蛋白质,临床生物被膜表面还会有磷酸,钙,血小板,红细胞附着,十分坚硬 l3J.日本的 Kobayashi4J 研究认为羽胶体化学的DLVO 理论可以很好的解释细菌和组织的非特异性黏连.在与宿主细胞微弱的相互作用下,黏连以后细菌产生了多糖蛋白质复合物围绕在它们周围,从而把相似的细菌聚集起来,于是在组织或置人人体内的一些装置表面形成菌膜.Davies 等 l5J 认为细菌形成生物被膜过程中起关键作用的是 LasRLasI 信号系统及其他细胞问信号.细菌生物被膜特性为:(1)
5、细菌 l 向毒力下降,因各种毒素被包裹在细菌生物被膜下面而难于释放,及处于恶劣的环境下细菌的代谢低下;(2)对抗生素的防护能力增强.一般的抗生素都难以穿透藻酸盐膜.(3)生物被膜形成能够避免细菌与巨噬细胞及免疫球蛋白的相互作用,激活补体的能力亦降低.且此细菌并不静止,它仍可在生物被膜下生长,由此而产生的疾病通常称之为菌膜病(biofilmdis.eases).菌膜对人体的致病性主要表现在两个方面:(1)大片的生物被膜形成菌会产:生菌膜碎片,其周围会有大量的游离菌产生.因而会造成慢性感染的急性发作.用敏感的抗生素治疗.可以杀灭游离菌,但却无法清除细菌生物被膜下 J 细菌.由于又有新的游离菌脱落,
6、故症状缓解后疋会再次发作.这也是临床上一些反复感染性疾病难治的原因.(2)细菌生物被膜的主要成分藻酸盐具有抗原性,能刺激机体产生抗体,导致变态免疫性疾病产生,如弥漫性泛细支气管炎(DBP).这种菌膜病的特征为抗ee 国临床僵学 2003 年 4 月第 10 卷第 2 期ClinicalMedicalJournalofChina,2003.Vo1.10,No.2261原一藻酸盐过剩,形成了免疫复合物沉积于肺组织.免疫复合物的 FC 端与中性粒白细胞结合 ,使白细胞溶解,其释放的物质就造成了肺的损伤.2 克拉霉素和细菌生物被膜自从 20 世纪 70 年代末期报道细菌生物被膜导致了许多临床难治性感染
7、性疾病以后,世界各国研究人员就开始寻找解决菌膜病的办法.如采用环丙沙星和鱼精蛋白硫酸盐联合 6,尿激酶或蚓激酶与氟罗沙星联合7治疗铜绿假单胞菌感染的菌膜病.McLeodE8研究用电磁场联合抗生素对清除细菌生物被膜菌有效.2002 年 Singh 等-9J 报道人体内乳铁蛋白能阻止细菌生物被膜的形成.但是研究范围最广,疗效最确切的是大环内酯类中一些药物对细菌生物被膜的作用,如克拉霉素.1994 年 Nishimura 等【10J 设计了一个计算机控制的泌尿道菌膜模型,并模拟尿液中抗生素浓度的反应进程.应用这个模型来测定克拉霉素对泌尿道菌膜的作用,其浓度接近于临床应用时尿液中的水平.结果显示单用环
8、丙沙星可以杀菌但不能除去细菌生物被膜;单用克拉霉素后铜绿假单胞菌在 48h内恢复到最初的数量,但细菌生物被膜消失了.联合应用两种药物则消灭了病原菌,且菌膜也消失了,无病原菌的再生长,细菌不再黏连.而且用克拉霉素后 5d 铜绿假单胞菌生物被膜的主要成分藻酸盐浓度减少,直至消失.这表明可能是克拉霉素破坏了细菌生物被膜,使环丙沙星能渗入而发挥杀菌作用.Kondoh 等【2J 用临床上分离提纯的黏液型铜绿假单胞菌在特氟隆上培养,形成细菌生物被膜.结果发现克拉霉素能使细菌生物被膜的主要成分附着于特氟隆串珠上的己糖,蛋白质和藻酸盐的量减少,且与药物呈计量依赖关系.尤其当药物浓度达到10tg/ml 或更大时
9、菌膜成分显着减少,而 10tg/ml仅相当于 1/20MIC.YasudaE11J 用铜绿假单胞菌在薄膜滤器上孵育 10d,用相对低浓度的克拉霉素治疗 5d,结果彻底去除了细菌生物被膜结构,定量分析也显示克拉霉素减少了藻酸盐和己糖的量.柏宏坚等【12J 用激光共聚焦显微镜(SCLM)观察到克拉霉素处理 2h 后成熟的铜绿假单胞菌生物被膜的典型隧道结构消失,8h 后被膜表面凹凸不平,呈碎片脱落,36h 后生物被膜结构完全消失,仅见被膜碎片.上述实验结果均表明,克拉霉素有抑制细菌生物被膜形成的作用,并呈剂量依赖型,浓度达 10g/m1 或以上即可发挥作用,临床所用的剂量即可在组织中达到这样的浓度.
10、许多临床研究也证实了克拉霉素的抗生物被膜作用.Takeda 等13 对 17 例 DPB 患者长期应用克拉霉素并观察其疗效,结果 9 例痰中发现铜绿假单胞菌的患者中 7 例细菌被清除.持续压 Z 用克拉霉素后细菌生物被膜被破坏,在光滑的表面形成了一个个单一的细菌.由于显着减少了细菌:组织上的黏附,应用克拉霉素后铜绿假单胞菌可能造成的进一步的组织损伤减少.此菌随后主要由机体清除.结果表明,因克拉霉素破坏细菌生物被膜,由铜绿假单胞菌感染的 DPB 预后也大为改善了.联合应用环丙沙星(CPFX)和克拉霉素(CAM)治疗泌尿道感染的临床研究9,14也表 I 归,病原菌清除率和临床有效率比单用 CPFX
11、 要高得多.患者被随机分为两组:分别用 600mg 环丙沙星(CPFX组)和 600mg 环丙沙星加 600mg 克扭霉素(联合组)治疗 14d.有留置导尿管的患者中:联合组的细菌完全清除率 50.O%,临床有效率 83.9%,远高于单用 CPFX 组 (两者分别为 30.0%和 61.5%)【14.因为缺乏合适的动物模型,研究负拉霉素对细菌生物被膜作用的动物体内实验报道较晚.1993年 Yasuda 等【13报道在鼠皮下感染模中 ,用氧氟沙星治疗铜绿假单胞菌形成的细菌生物被膜,同时口服克拉霉素可以提高治愈率.199 年 Yanagi.hara 等 15J 设计了用覆盖有铜绿假单胞菌的塑料导管
12、置人鼠的支气管内制造鼠的慢性呼吸道感染模型.置人 7d 后,扫描电镜观察置人支气管内的导管,发现细菌生物被膜已经形成,包含血细胞,复合纤维结构和细菌.单用克拉霉素和左氟沙星都不能减少肺中细菌存活的数量,联合使用两种药物则可使活菌的数量显着减少.Bui 等【16则采用将 100cfu 的黏液型铜绿假单胞菌经鼻置入免疫抑制鼠的体内制造肺部感染.随后单用头孢他(1500mg/kg)或合用克拉霉素(100mg/kg).结具 5d 后加用克拉霉素组鼠的存活率比单用头孢他啶组高(48%比 32%,P=0.04).有实验验证了克拉霉素对于金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,MRSA 等其他细菌形成的生物被膜也有抑
13、制作用【17J.综上所述,临床研究均证实了低浓度的克拉霉素对细菌生物被膜的形成有抑制作用.与抗菌药物联合使用可有效治疗菌膜病.3 克拉霉素对细菌生物被膜疾病的作 J日机制3.1 抑制藻酸盐的形成262ainica1Med;ca1J 咖 al0fChina,2003.Vd.10,No.2 中国临床廛亏 2003 年 4 月第10 卷第 2 期克拉霉素属大环内酯类药物,而大环内酯类是窄谱抗生素,主要用于革兰阳性球菌,阴性球菌,以及军团菌,支原体,衣原体等.它是一种抑菌剂,故临床上一般不宜作为严重感染的治疗药物.但是,一些临床和动物实验却发现联合应用克拉霉素和其他杀菌剂(如环丙沙星,头孢他啶,美洛培
14、南等)可有效治疗由铜绿假单胞菌生物被膜感染的疾病.而且,所用的剂量远低于 MIC,所以可能是克拉霉素抑制了细菌生物被膜的形成,增加了杀菌剂的渗透,故能有效和彻底的杀灭细菌.一些体外实验证实单用克拉霉素并不能杀灭细菌,而使浮游菌的数量恢复到形成菌膜之前的水平,细菌生物被膜消失了.用定量检测法也可发现,使用克拉霉素后,细菌生物被膜的主要成分均大大减少了.但并不是所有的大环内酯类药物都具有抑制细菌生物被膜的作用.Yokoiyama18J 在 1990 年报道,在老鼠的呼吸道感染模型中应用 14 一元环大环内酯类(如红霉素) 可抑制铜绿假单胞菌生物被膜形成,而 16 一元环大环内酯类(如罗他霉素)则无
15、效.有很多研究显示:14 一元环的红霉素【19J,克拉霉素,罗红霉素,15 一元环的阿齐霉素【20J 均在低于 MIC的浓度下有抑制细菌生物被膜的作用,而 16 一元环大环内酯类如麦迪霉素 2,交沙霉素【21】等无论剂量多大均无此效果.从细菌生物被膜的主要成分藻酸盐的合成来看,它的初始底物是 6 磷酸果糖,经一系列酶催化就形成了藻酸盐.当细菌处于恶劣环境时,该酶系的活性也增强了.其中,GDP 一甘露糖脱氢酶(GMD)是藻酸盐合成最终阶段的酶.Mitsuya 等22J 研究了 14 一元环大环内酯类(如红霉素)和 16 一元环大环内酯类(如麦迪霉素) 对 GMD 的作用.实验用G6PDH(一种细
16、胞膜上的酶)作参照.黏液型铜绿假单胞菌 PT 一 1578 和非黏液型铜绿假单胞菌PAO1 分别在营养充分和营养匮乏的培养基中培养,测定两者 GMD 的酶活性.结果发现黏液型铜绿假单胞菌在营养匮乏的培养基中 GMD 酶的活性增强了.接着实验者测定了红霉素和麦迪霉素对GMD 和 G6PDH 酶活性的作用 .在培养基中无论加多少剂量红霉素或者麦迪霉素,G6PDH 酶活性都不受影响.但是应用红霉素却减少了 GMD 的产生,并呈现浓度依赖效应.表明红霉素对 GMD 的生成过程有抑制作用,从而抑制了细菌生物被膜的形成.而且 GMD 对大环内酯类的种类具有识别功能.比较大环内酯类不同种类的结构,可以发现
17、14一元环与 15 一元环的共同点为 3 位与 5 位连接着糖,而 16 一元环有两糖在 5 位并列连接.为了验证是否是侧链影响使得不同种类大环酒类对细菌生物被膜的作用不同,Nagino 等23 用红霉素,阿齐霉素,麦迪霉素(分别代表 14 一,15 一,16 一元环大环内酯类)及从麦迪霉素结构环上去除了 mycarose(碳霉糖) 的 CP 一 4305 进行了一项体外实验,定量测定生成的藻酸盐和 GDP 一甘露糖脱氢酶的活性来判定对细菌生物被膜的作用,结果显示应用红霉素,阿齐霉素和 CP 一 4305 后,细菌生物被膜的结构物质被破坏,酶的活性被抑制,而应用麦迪霉素后没有发现这些效果.这表
18、明大环内酯类药物的不同作用与连接在大环内酯环上的糖链有.因为藻酸盐不但是细菌生物被膜的主要成分,同时也是一种重要的抗原,它引起抗原一抗体反应过剩是变态免疫性疾病 DPB 的主要发病机制.而 14 一元环和 15 一元环大环内酯类能在 GMD 水平上抑制由藻酸盐引起的免疫反应所以临床上此类药物对 DPB 的疗效也很明显.区 f 肺囊性纤维化有着与之相似的致病过程,因此也可以长期使用 14一或 15 一元环大环内酯类药物来治疗.3.2 抗免疫反应作用研究还发现 14 一,15 一元环的:环内酯类药物除了在 GMD 水平上抑制藻酸盐的合成以外,在对一些疾病的治疗过程中还发挥着抗免疫反应的作用.Ich
19、ikawa24J 在 1992 年用红霉素治疗细支气管炎时发现,经红霉素治疗以后,患者支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞及它的弹性蛋白活性都大大降低了,肺功能也有显着提高.提示红耋素可能对宿主吞噬细胞有着直接的作用,但支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞的趋化性无明显变化.Oda 等25J 于1995 年实验发现 DBP 中白三烯 B4(LTB4)是最重要的炎症细胞趋化介质之一,与 DB发生气道损害的发病机制有关.红霉素可以抑制这种介质的产生从而限制中性粒细胞的聚集,调整气道的过度炎症反应,最终对治疗 DBP 发挥作用.Yanagihara26J 用鼠的慢性呼吸道感染模型作动物实验表明,克拉霉素治疗 D
20、PB 的作用机制为抗免疫反应而不是用作为抗菌剂.他从第 7 天起给实验鼠连续口服克拉霉素(10mg?kg?d)IOd(DPB的组织病理学显示,在第 7 天肺内的淋巴细胞总数开始增加,到第 12 天达到高峰),虽然这剂量并不影响肺内的病原菌,但使淋巴细胞的数量回复到了基中国临床压学 2003 年 4 月第 10 卷第 2 期ClinicalMedicalJournalofChina,2003.Vo1.10,No.2263线水平.且通过减少 CD8+的淋巴细胞数量使CD4+/CD8+的比例上升.此结果类似于在 DPB患者的支气管肺泡灌注液所观察到的变化.总之,克拉霉素对于细菌生物被膜及其相关疾病的
21、作用机制主要是通过在 GMD 水平上抑制细菌生物被膜的主要成分藻酸盐的合成来协助其他抗生素发挥杀菌作用,及降低中性粒细胞的活性,抑制中性粒细胞的聚集,使 CD4+/CD8+的比例上升等的抗免疫作用.由于大环内酯类结构上糖链的位置不同,14 一,15 一元环大环内酯类均与克拉霉素有着相似的作用,它们之间无显着差异,而 16 一元环大环内酯类则完全无效.参考文献1CostertonJW,GeeseyGG,ChengKJ.Howbacteriastick.SciAm,1978,238(1):86-95.2KondohK,HashibaM.Inhibitoryeffectofmacrolideanti
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