1、中国农业科学 2009,42(6): 2126-2132 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.06.032 收稿日期： 2008-09-23； 接受日期： 2009-11-13 基金项目： 国家自然科学基金（ 30460095） 、内蒙古自治区自然科学基金（ 200508010404） 作者简介： 杨金丽（ 1983） ，女，内蒙古包头人，博士研究生，研究方向为瘤胃微生物分子生物学。 Tel： 13847140145； E-mail： 。通信作者侯先志（ 1948） ，男，山西忻州人，教授，研究方向为反刍
2、动物瘤胃微生态。 E-mail： 蒙古绵羊瘤胃固、液相附着微生物的 RT-PCR 检测 杨金丽1，侯先志1，高爱武2 （1内蒙古农业大学动物科学与医学学院，呼和浩特 010018；2内蒙古农业大学食品学院，呼和浩特 010018） 摘要： 【目的】应用 Real-time PCR（RT-PCR）对蒙古绵羊瘤胃内容物固、液相附着微生物的生态分布进行定量研究。 【方法】采集 3 只蒙古绵羊瘤胃内容物，固液分离后对各相中所附着的微生物进行定量检测，包括总细菌、总厌氧真菌和 3 种主要纤维降解菌白色瘤胃球菌 Ruminococcus albus、黄色瘤胃球菌 Ruminococcus flavefa
3、ciens、产琥珀酸拟杆菌 Fibrobacter succinogenes。 【结果】固相中总细菌、总厌氧真菌和 3 种纤维降解菌的 16S 或 18S rRNA 基因考贝数显著高于液相，分别是液相附着微生物的 7.22 倍（ P0.05） 、56.85 倍（ P0.01） 、2.69 倍（ P0.05） 、4.19 倍（ P0.01）和 7.59 倍（ P0.01） 。瘤胃固相中 F.succinogenes 菌的丰度为 0.55%，高于 R.flavefaciens 菌（0.53%）和 R.albus 菌（0.09%） 。瘤胃液相中 R.flavefaciens 菌的丰度最高，为 0.9
4、1%，高于 F.succinogenes 菌（0.52%）和 R.albus 菌（0.24%） 。 【结论】RT-PCR 方法能够准确对瘤胃固、液相附着微生物进行定量分析。 关键词： Real-time PCR；蒙古绵羊；瘤胃；微生物；生态分布 Quantity of Microorganisms Associated with Solid and Liquid Phases of Rumen Contents Using RT- PCR YANG Jin-li1, HOU Xian-zhi1, GAO Ai-wu2 (1College of Animal Science, Inner Mon
5、golia Agricultural University, Huhhot 010018; 2College of Food Science, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018) Abstract: 【 Objective】 Using Real-time PCR (RT-PCR)assays to quantify the microbes associated with particular phases of rumen contents. 【 Method】 Whole rumen contents were s
6、ampled from three Mongolian sheep and partitioned into solid- and liquid-associated microorganisms. 【 Result】 On the basis of 16S or 18S rRNA gene copy number analysis, the number of general bacteria, general anaerobic fungi and three representative ruminal cellulolytic bacteria (Ruminococcus albus,
7、 Ruminococcus flavefaciens, Fibrobacter succinogenes) associated with rumen solid content were 7.22-fold (P 0.05), 56.85-fold (P 0.01), 2.69-fold (P 0.05), 4.19-fold (P 0.01) and 7.59-fold (P 0.01) as those associated with rumen liquid content. The abundance of F. succinogenes in the solid phase was
8、 0.55%, which was higher than that of R. flavefaciens (0.53%) and R. albus (0.09%). However in the liquid phase R. flavefaciens accounted for 0.91% of the bacterial rRNA gene copies, which was more abundant than F. succinogenes (0.52%) and R. albus (0.24%). 【 Conclusion】 RT-PCR method could accurate
9、ly detect the distribution and abundance of microorganisms associated with particular phase of rumen content. Key words: Real-time PCR; Mongolia sheep; rumen; microorganisms; distribution 0 引言 【研究意义】反刍动物瘤胃内包含多个生态区，不同生态区的微生物对纤维降解的贡献不同，监测各生态区微生物数量的变化对研究瘤胃微生态具有重要意义1-2。【前人研究进展】瘤胃内与饲料相互作用的微生物可以分为 3 个亚群，即
10、存在于瘤胃液相内容物中的微生物（ LAB），松散或紧密附着于瘤胃固相内6 期 杨金丽等：蒙古绵羊瘤胃固、液相附着微生物的 RT-PCR 检测 2127 容物中的微生物（ SAB），后两者对粗饲料的降解起主要作用3。研究表明瘤胃固相与液相中微生物在化学组成上存在差异4-5， 固相中多糖降解酶总酶活远远高于液相6，是否由于微生物群落结构不同而导致这些差异，目前还没有定论。测定瘤胃固、液相微生物数量常用的方法为：分离固、液相，然后将固相微生物从所附着的饲料颗粒上分离下来，再对微生物蛋白和菌体 DAPA（二氨基庚二酸， diaminopimelic acid）进行分析。在分离固相附着微生物时存在分离效
11、率的问题，因此测定结果的重复性和准确性受到置疑，不同试验结果很难进行比较7-8。【本研究切入点】近几年， RT-PCR 技术不断发展和完善，具有特异性强、定量准确、重复性好的特点，在各种分子定量研究中应用越来越广泛9,10。本试验利用 RT-PCR 方法定量分析蒙古绵羊瘤胃内容物固、液相附着微生物。【拟解决的关键问题】在试验中不需进行瘤胃固相微生物分离，弥补了传统方法的缺陷，可以更准确的研究瘤胃不同生态区内微生物的变化。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验动物饲养管理 选用 3 只体况相近、 体重约 35 kg 装有永久性瘤胃瘘管的蒙古绵羊，参照中国美利奴羊饲养标准，饲喂水平为 1
12、.4 倍的维持需要，日采食量约为 1 kg，日粮精粗比为 20 80。每天饲喂2 次（ 7： 00 和 19： 00），自由饮水。 1.1.2 瘤胃内容物的采集和固液相的分离 在清晨饲喂前，每只绵羊瘤胃采集内容物 100 ml，分别装到50 ml 灭菌离心管中， 800 r/min 离心 15 min，将上清液转移至新的 50 ml 灭菌离心管，其中的微生物定义为液相附着微生物。剩余沉淀中的微生物定义为固相附着微生物11。全部样品 80保存备用。 1.1.3 主要试剂和仪器 DNA 产物纯化试剂盒、2 Taq platinum PCR Master Mix、 DNA Maker均购自天根公司；
13、蛋白酶 K、 PMD19-T Vector、质粒提取试剂盒、荧光定量 PCR 管、 SYBR Premix Ex Taq试剂盒均购自 TAKARA 公司； PCR 引物由 TAKARA 公司合成；氯化苄（购自北京化学试剂厂）；涡旋混合器（ HQ-60-，北京同正），微量紫外分光光度计（ ND1000， Gene 公司），梯度基因扩增仪（ PTC200，Gene 公司），荧光定量 PCR 仪（ TP800， TAKARA公司），凝胶成像仪（ Pharamacia VDS）， DYY-12电泳仪（北京六一仪器厂）。 1.2 DNA 的提取与纯化 1.2.1 DNA 的提取 瘤胃液相样品混合基因组
14、DNA的提取方法参考文献 12， 13：吸 取 1 000 l 的液相样品， 加入 0.2 g 玻璃珠和 500 l 1 TE（ pH 8.0） ， 12 000 r/min 离心 10 min， 弃上清。 向沉淀中加入 400 l DNA提取缓冲液（ 100 mmolL-1Tris-HCl, pH 9.0， 40 mmolL-1EDTA, pH 8.0）混匀，加入 50 l 10% SDS ，10 l 10 mgl-1蛋白酶 K，玻璃珠振荡 2 次，每次 2 min，中间冰浴 1 min， 55保温 2 h，加入 150 l 氯化苄， 50保温 1 h，每隔 10 min 轻轻混匀一次。取出
15、冷却至室温，加入 50 l 3 molL-1NaAc（ pH 5.0），混匀， 冰浴 15 min， 等体积酚氯仿异戊醇 （ PCI=25 24 1）抽提 1 次，转移上清再用氯仿异戊醇（ CI=24 1）抽提 1 次，吸取 450 l 上清至另一离心管，加入等体积异丙醇， 20放置 30 min， 12 000 r/min 离心 5 min， 弃上清， 沉淀用 70%乙醇清洗 2 次，室温干燥，溶解于 90 l 1 TE 缓冲液。 瘤胃固相样品基因组 DNA 的提取方法与上述基本相同，称取混合均匀的瘤胃固相样品约 0.2 g 加入0.2 g 玻璃珠， 其它步骤同上， 所有试剂用量都增加 1.
16、5倍，氯仿异戊醇（ CI）（ 24 1）抽提后吸取 675 l上清至另一离心管，加入等体积异丙醇， 20放置30 min， 12 000 r/min 离心 5 min， 弃上清， 沉淀用 70%乙醇清洗 2 次，室温干燥，溶解于 135 l 1 TE 缓冲液。 1.2.2 DNA浓度的检测与DNA的纯化 微量紫外分光光度计检测粗制 DNA 溶液的浓度和纯度，并根据试剂盒中 DNA 纯化柱的载样量（ 5 20 g DNA），吸取适量的粗制 DNA 溶液 （总 DNA 含量在 20 g 左右）进行纯化，纯化步骤见说明书，最后用 80 l 的洗脱缓冲液溶解 DNA。 1.3 PCR 扩增 1.3.1
17、 RT-PCR 引物 总细菌、总厌氧真菌、产琥珀酸拟杆菌（ F.succinogenes）的特异性引物见文献 14，白色瘤胃球菌（ R.albus ）、黄色瘤胃球菌（ R.flavefaciens）的特异性引物见文献 15，引物设计见表 1。 1.3.2 普通 PCR 20 l 扩增体系 2 Taq platinum PCR MasterMix 10 l，上、下游引物（ 10 molL-1）各 0.8 l，纯化后 DNA 溶液 0.5 l，灭菌去离子水 7.9 l。反应参数为：预变性 94 4 min； 94 40 s，52 60 40 s， 72 40 s，共 30 个循环； 72延伸 5
18、min。 2128 中 国 农 业 科 学 42卷 表 1 RT-PCR 引物 Table 1 Primers for RT-PCR assay 项目 Items 引物 Primer 退火温度 Annealing Tm ( )大小 Size (bp)总细菌 General bacteria 上游 Uper： CGGCAACGAGCGCAACCC 下游 Down： CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC 60 130 总厌氧真菌 General anaerobic fungi 上游 Uper： GAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTC下游 Down： CAAATTCACAA
19、AGGGTAGGATGATT 60 120 产琥珀酸拟杆菌 F.succinogenes 上游 Uper： GTTCGGAATTACTGGGCGTAAA 下游 Down： CGCCTGCCCCTGAACTATC 60 121 白色瘤胃球菌 R. albus 上游 Uper： CCCTAAAAGCAGTCTTAGTTCG 下游 Down： CCTCCTTGCGGTTAGAACA 56 175 黄色瘤胃球菌 R.flavefaciens 上游 Uper： TCTGGAAACGGATGGTA 下游 Down： CCTTTAAGACAGGAGTTTACAA 52 295 1.3.3 目的片段的克隆和质
20、粒标准品的制备 将 普通 PCR 扩增产物用于目的片段的克隆， 克隆所用载体为 PMD 19-T Vector，感受态细胞为大肠杆菌DH5，具体方法参照文献 16。挑取多个白色菌落分别进行扩培并用质粒提取试剂盒提取质粒，用相应 的引物进行 PCR 扩增和电泳检测， 扩增出目的片段的质粒为阳性质粒，菌株为阳性菌株，送交大连宝生物测序。 将测序结果在 NCBI 上进行比对，用比对结果正确的质粒制作标准品，具体方法参照文献 17，使用微量紫外分光光度计检测质粒 DNA 溶液的浓度，并用公式（ 1）计算所含考贝数： 6.02 1023(copy/mol) DNA amourDNA(copy)= DNA
21、 length (dp) 660(g/mol/dp) （ 1）对此质粒 DNA 溶液从 6 102copies/l 到 6 106copies/l 进行 10 倍系列稀释， 所得到的一系列具有浓度梯度的质粒 DNA 溶液即为质粒标准品， 20 l/管进行分装， 20保存备用。 1.3.4 标准曲线的制作 吸取 5 l 质粒标准品进行RT-PCR 扩增反应，每组标准品 3 个重复，反应结束后系统根据 Ct 值和起始模板考贝数（ 3 103 3 107copies)的对数自动绘制标准曲线，若相关系数（ r2）在 0.98 1 之间，扩增效率（ E）在 80% 120%之间，则标准曲线符合 RT-P
22、CR 定量的要求。 1.3.5 RT-PCR 在荧光定量 PCR 仪 TP800（ TAKARA）上进行，所用试剂为 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒，所使用的引物浓度为 300 nmolL-1，模板DNA 溶液稀释度分别为：测定细菌时固、液相 DNA稀释 1 600 倍，测定真菌和 F.succinogenes 菌时固相DNA 稀释 80 倍、 液相 DNA 稀释 40 倍， 测定 R. albus菌时稀释 40 倍，测定 R.flavefaciens 菌时稀释 20 倍， 每个 DNA 样品 3 个重复。 RT-PCR 扩增反应 20 l 体系： 2 SYBR Premix E
23、x Taq 10 l，上、下游引物（ 10 molL-1）各 0.6 l，已稀释的模板 DNA 溶液 5 l，灭菌去离子水 3.8 l。所确定的总细菌、总厌氧真菌、 F.succinogenes 菌的反应条件为：预变性 95 2 min； 95 15 s， 60 30 s，共 40 个循环，每次延伸结束后仪器自动检测荧光强度。 扩增反应的特异性通过对 PCR 终产物制作融解曲线来确定的，方法为：从 60升温到 90，每隔 10 s升高 1，仪器自动绘制融解曲线。 R. albus 菌的反应条件为：预变性 95 2 min； 95 15 s， 56 20 s，72 20 s 共 40 个循环，融
24、解曲线制作同上。R.flavefaciens 菌的反应条件为：预变性 95 2 min；95 15 s， 52 30 s， 72 35 s 共 40 个循环，融解曲线制作同上。 1.3.6 微生物16S或18S rRNA基因考贝数的计算 每毫升瘤胃液相内容物中微生物基因考贝数的计算方法见公式（ 2）： C D 80 90 5101 ml 液相瘤胃内容物 中微生物的 16S 或 18S=rRNA 基因考贝数 5 P 450 （ 2）其中， C： Real-time PCR 检测到的目的片段拷贝数；D： DNA 模板的稀释倍数； P：用于纯化的 DNA 溶液体积。 每克瘤胃固相内容物中微生物基因考
25、贝数的计算方法见公式（ 3）： C D 80 135 7651 g 固相瘤胃内容物 中微生物的 16S 或 18S=rRNA 基因考贝数 5 P 675 M （ 3）其中， M：瘤胃固相内容物样品用量；其它同公式（ 2） 1.4 数据统计 应用 SAS 8.0 中的 TTEST 方法进行检验。 6 期 杨金丽等：蒙古绵羊瘤胃固、液相附着微生物的 RT-PCR 检测 2129 2 结果与分析 2.1 基因组 DNA 的提取与纯化 DNA 提取结果见表 2。本试验所使用的玻璃珠蛋白酶 K氯化苄的 DNA 提取方法可以从 1 ml 瘤胃液中得到约 30 33 g 粗制 DNA，从 1 g 固相瘤胃内
26、容物（湿重）中得到约 223 336 g 粗制 DNA。 DNA 溶液的 OD260/280在 1.89 2.04 之间。 DNA 产物纯化试剂盒可去除瘤胃内容物粗制DNA 中的多糖、蛋白质等 PCR 抑制因子和提取过程中残留的 RNA 污染。纯化试剂盒中 DNA 纯化柱的载样量为 5 20 g DNA，如果加入的粗制 DNA 量大于这一范围，会使不同样本的 DNA 纯化效率产生很大的差异，影响定量研究的准确性。因此对于不同浓度表 2 瘤胃内容物 DNA 的产量和品质 Table 2 Yields and quality of DNA extracted from rumen content
27、样品 Sample 样品用量 Amount of sample used (l or g) DNA 产量 DNA yield (gml-1or g g-1) OD260/280 DNA 浓度 DNA concentration (ng l-1) 用于纯化的 DNA 体积 Volume of DNA used for purification (l) 1 号羊液相瘤胃内容物 Liquid 1 1000 30.7 2.03 341.1 70 2 号羊液相瘤胃内容物 Liquid 2 1000 33.7 2.02 374.4 45 3 号羊液相瘤胃内容物 Liquid 3 1000 32.6 2.0
28、4 362.2 70 1 号羊固相瘤胃内容物 Solid 1 0.247 253.7 1.93 464.2 50 2 号羊固相瘤胃内容物 Solid 2 0.224 223.4 1.89 370.6 70 3 号羊固相瘤胃内容物 Solid 3 0.220 336.2 1.90 547.9 50 的粗制 DNA 溶液使用不同的纯化体积。 2.2 普通 PCR 扩增 普通 PCR 电泳检测结果见图。 本试验使用的引物可以很好的从已纯化的 DNA 溶液中扩增出目的条 带且每种引物的实际扩增片段长度与文献报道基本一 M： DNA maker； 1 5： R.flavefaciens, F.succi
29、nogenes, R.albus，总细菌，总厌氧真菌的 PCR 产物 M: DNA maker ; Line 1-5: PCR products of R.flavefaciens, F.succinogenes, R.albus, General bacteria and General anaerobic fung 图 瘤胃内容物 DNA 扩增 Fig. Amplification of rumen DNA sample 致。扩增条带清晰无杂带，表明引物具有很高的特异性，得到的 DNA 溶液能够很好的应用于 PCR 扩增。 2.3 目的片段的测序 将阳性质粒测序结果在 GenBank 上进
30、行 Blast 比对分析，其序列与 GenBank 中的标准菌株序列有很高的相似性（ 98% 99%），目的片段含有完整的引物对序列，说明质粒构建成功，可以用于制作质粒标准品。 2.4 RT-PCR 结果 2.4.1 RT-PCR 的特异性 本试验应用上述 5 种引物对已纯化的瘤胃固、液相基因组 DNA 进行 RT-PCR 扩增，对扩增终产物制作融解曲线以确定反应的特异性。 结果显示 3 种纤维降解菌 F.succinogenes、 R.albus、R.flavefaciens 和总厌氧真菌的扩增产物融解曲线只有单一峰， Tm 值分别为 86、 89、 89 和 79。总细菌扩增产物融解曲线不
31、是单一峰， Tm 在 82 89之间。检测结果与 Denman 等14的报道相一致，只是总厌氧真菌扩增产物 Tm 值 （ 79） 比文献中的 Tm 值 （ 76）高，这可能与本试验瘤胃内容物来自蒙古绵羊，而文献中瘤胃内容物来自牛有关。 2.4.2 标准曲线 使用上述 5 种菌的质粒标准品进 行 RT-PCR 反应后，根据 Ct 值和起始模板考贝数（ 3 103 3 107 copies）的对数绘制标准曲线，结果2130 中 国 农 业 科 学 42卷 见表 3。大部分标准曲线相关系数（ r2）都在 0.99 1之间，扩增效率（ E）都在 97% 104%之间，符合RT-PCR 定量的要求。 表
32、 3 RT-PCR 标准曲线的相关系数和扩增效率 Table 3 Standard curve line fit and amplification efficiency calculated using RT-PCR 项目 Items 部位 Position 相关系数 R2 扩增效率 Amplificationefficiency (%)液相 Liquid 0.996 102.2 总细菌 General bacteria 固相 Solid 0.994 101.6 液相 Liquid 0.999 101.7 总厌氧真菌 General anaerobic fungi 固相 Solid 1.00
33、0 104.9 液相 Liquid 0.996 109.0 纤维降解菌 Fibrobacter succinogenes 固相 Solid 0.997 93.3 液相 Liquid 0.988 100.2 纤维降解菌 Ruminococcus albus 固相 Solid 0.993 101.9 液相 Liquid 0.997 97.7 纤维降解菌 Ruminococcus flavefaciens 固相 Solid 0.995 102.3 2.4.3 瘤胃固、液相微生物的检测 结果见表 4。瘤胃固相中总细菌、总厌氧真菌和 3 种纤维降解菌（ R. albus 、 R. flavefacien
34、s、 F.succinogenes）的 16S 或18SrRNA 基因考贝数是液相中的 7.22 倍、 56.85 倍、2.69 倍、 4.19 倍和 7.59 倍。瘤胃液相中 3 种纤维降解菌（ R. albus、 R. flavefaciens、 F.succinogenes）丰度分别为 0.24%、 0.91%和 0.52%，而瘤胃固相中分别为0.09%、 0.53%和 0.55%， 3 种纤维降解菌丰度是用其16S rRNA 基因考贝数占总细菌 16S rRNA 基因考贝数的比例计算的。 3 讨论 3.1 适用于 RT-PCR 的 DNA 提取方法 瘤胃微生物种类繁多，提取混合基因组
35、DNA 时菌体细胞裂解的难易程度存在很大差异，如细菌细胞壁性质不一（革兰氏阳性和阴性）、形态大小各异（球状和杆状）18， 瘤胃真菌细胞壁富含几丁质很难破壁，尤其是瘤胃固相样品提取 DNA 时，玻璃珠细胞破碎法易受到食糜颗粒的影响，因此要使所提取的核酸分表4 瘤胃固、液相中微生物的 RT-PCR 检测 Table 4 Quantification of target species in solid and liquid phases of rumen contents by RT-PCR 每 ml 或每 g 瘤胃内容物微生物 16S 或 18S rDNA 考贝数的对数 Log10 NO. of
36、 16S or 18S rDNA copies/ ml or g rumen contents 项目 Items 瘤胃内容物 Rumen content 1 号羊 Sheep1 2 号羊 Sheep2 3 号 Sheep3 平均值 标准差 xs液相 Liquid 10.48 10.46 10.57 10.519.66 a 总细菌 General bacteria 固相 Solid 11.38 11.2 11.48 11.3610.85 b 液相 Liquid 6.68 6.65 6.77 6.705.87 a 总厌氧真菌 General anaerobic fungi 固相 Solid 8.4
37、2 8.46 8.48 8.457.30 c 液相 Liquid 8.36 8.04 8.21 8.227.77 a纤维降解菌 F.succinogenes 固相 Solid 9.18 9.08 9.04 9.118.34 c 液相 Liquid 7.93 7.87 7.90 7.906.69 a 纤维降解菌 R. albus 固相 Solid 8.40 8.27 8.30 8.337.55 b 液相 Liquid 8.44 8.50 8.46 8.477.37 a 纤维降解菌 R.flavefaciens 固相 Solid 9.12 9.08 9.06 9.097.91 c 同一行中上下两个
38、数值的字母不同表示差异显著（ a-b： P 0.05； a-c： P 0.01） Means in the same row with different letters differ (a-b: P 0.05; a-c: P 0.01) 子具有代表性 , 能够准确反映瘤胃微生物的数量，必须裂解全部种类的瘤胃微生物细胞，裂解方法的选择就显得非常重要。本试验将物理破碎（玻璃珠法）、酶法破碎（蛋白酶 K 法）和化学法破碎（氯化苄法）相结合，可以从 1 g 固相瘤胃内容物（湿重）中得到223 336 g 粗制 DNA，产量远高于 Sharma 等19报导的 50 60 g DNA/2 g 全瘤胃内容
39、物（湿重），表明本方法可以有效的从固相瘤胃内容物中提取混合基因组 DNA。 本试验对常规 DNA 提取步骤进行了定量化修改， 6 期 杨金丽等：蒙古绵羊瘤胃固、液相附着微生物的 RT-PCR 检测 2131 比如在氯仿异戊醇（ 24 1）抽提后吸取固定量的体积进行 DNA 沉淀。在用试剂盒对 DNA 纯化时，所用粗制 DNA 溶液的总 DNA 含量接近纯化柱的载样量，从而减小了不同浓度 DNA 溶液纯化效率的差异。 3.2 RT-PCR 对瘤胃固 、液相附着微生物的定量研究 本试验中，每克瘤胃固相附着总厌氧真菌的 18S rRNA基因考贝数是每毫升液相中总厌氧真菌的 56.85 倍（ P 0.
40、01），反映出瘤胃固相和液相真菌生活周期的不同，即固相中附着的真菌菌体既包括只含有一个细胞核的单中心真菌也包括含有多个细胞核的多中心真菌，而液相中大多是游动孢子1。本试验检测到每克瘤胃固相中总细菌 16S rRNA 基因考贝数是每毫升液相中的 7.22 倍（ P 0.05）。固、液相中总细菌和总厌氧真菌数量的差异可能导致固、液相中有机质（ OM）、粗蛋白（ CP）和 ATP 含量的差异。 ATP 作为检测微生物数量的标志时，有研究报道 76%的 ATP附着在固相上20，固相附着微生物的 OM 和 CP 高于液相附着微生物21-22。微生物对饲料颗粒的附着对于饲料的消化至关重要的，准确定量固相中
41、附着微生物数量，对今后的研究提供了可参考的方法。 本试验应用 RT-PCR 方法检测到瘤胃固相中 3 种纤维降解菌（ R.albus、 R.flavefaciens、 F.succinogenes）的 16S rRNA 基因拷贝数是液相中的 2.69（ P 0.05） 、4.19（ P 0.01）和 7.59 倍（ P 0.01），说明 3 种纤维降解菌在固相中的浓度要高于液相。瘤胃固相中总厌氧真菌和纤维分解菌较高的拷贝数可能是导致固相中纤维降解酶酶活高于液相的原因。 本试验结果表明， F.succinogenes 菌在瘤胃固相中的丰度略高于 R.flavefaciens 菌，与前人的研究报道
42、相一致。 Koike 等23检测到绵羊全瘤胃内容物中F.succinogenes 菌的数量要高于 R.flavefaciens， Shinkai12报道在植物叶片和茎秆上附着的 F.succinogenes 菌的数量要高于 R. flavefaciens 菌和 R.albus 菌。本试验还发现，瘤胃液相中 F.succinogenes 菌的丰度低于 R. flavefaciens 菌，可能是因为液相中微生物的浓度远远小于固相。本试验中 3 种纤维降解菌在瘤胃固、液相中丰度的不同可能暗示了它们在不同生态环境中的生存能力不同，这方面还需要更深入研究。 4 结论 通过对 RT-PCR 方法的改进，可
43、准确、定量的研究瘤胃微生物的生态分布；瘤胃固相中总细菌、总厌氧真菌和 3 种纤维分解菌的数量显著高于液相； 3 种 纤维分解菌在瘤胃固、液相中的丰度不同。 References 1 冯仰廉 . 反刍动物营养学 (第一版 ). 北京 : 科学出版社 , 2004. Feng Y L. Ruminant Animal Nutrition (1st ed). Beijing: The Science Press, 2004. (in Chinese) 2 McAllister T A, Bae H D, Jones G A, Cheng K J. Microbial attachment and f
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