1、生命科学Chinese Bulletin of Life Sciences第 18 卷 第 2 期2006 年 4 月Vol. 18, No. 2Apr., 2006RNA 干扰分子的制作 荀恒杰， 于源华 * ， 蔡林君( 长春理工大学生物工程系， 长春 130022)摘 要 ： 小干扰 RNA 是一种能够在各种生物体和细胞 ( 包括蠕虫、 果蝇、 植物、 哺乳动物 ) 中减弱基因表达的有效工具。 在哺乳动物中转染的 siRNA 能够抑制特殊基因的表达， 这已经证明是探索基因功能、 基因敲除、 抗病毒研究、 基因治疗的有效方法。 简单、 有效、 特异性地抑制基因的表达具有巨大的科学、 商业和
2、医学治疗价值。 如何设计和制作 siRNA 是影响 RNA 干扰效率的一个很重要的方面。 本文就 siRNA 的设计和制作等方面作扼要的介绍。关键词 ： T7 启动子 ； 小干扰 RNA ； 小发夹 RNA ； 小干扰 RNA 表达框 ； U6 聚合酶 III 启动子中图分类号 ： Q756 文献标识码 ： AProcess of the RNA interfering moleculesXUN Heng-Jie, YU Yuan-Hua*, CAI Lin-Jun(Department of Bioengineering, Changchun University of Science an
3、d Technology,Changchun 130022, China)Abstract: Small interfering RNA (siRNA) is an extremely effective tool for reducing gene expression of targetgenes in a variety of organisms and cell types (e.g., worms, fruit flies, plants, and mammalian cells) . The abilityof transfected siRNAs to suppress the
4、expression of specific transcripts has proved a useful technique toprobe gene function, gene knockout, antiviral research, and gene therapy in mammalian cells. The ability tosimply, effectively and specifically down-regulate the expression of genes in mammalian cells holds enormousscientific, commer
5、cial, and therapeutic potential . How to design and make good siRNAs is an important factorof efficiency of RNA interference. This article introduces some ways to design and make siRNA.Key words: T7 promotor; siRNA; shRNA; siRNA expression cassette; U6 Pol III promotor收稿日期 ： 2005-08-23 ； 修回日期 ： 2005
6、-11-17项目基金 ： 吉林省科技厅项目 (200505-5)作者简介 ： 荀恒杰 (1970 ) ， 男， 硕士研究生 ； 于源华 (1962 ) ， 女， 博士， 副教授 ， 硕士生导师 ， * 通讯作者 ；蔡林君 (1979 ) ， 男， 硕士研究生。文章编号 ： 1004-0374(2006)02-0190-05RNA 干扰， 也称为转录后基因沉默， 是双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 分子阻断或者降低同源基因表达的现象。 1998 年华盛顿卡耐基研究院的 Andrew Fire 和马萨诸塞大学癌症中心的 CraigMello 证实， 1995 年
7、 Su Guo 博士在线虫中发现的正义 RNA 和反义 RNA 都能够特异性地阻断基因的表达， 其实是 dsRNA 阻断整个线虫的同源基因表达，并且把这种现象称为 RNA 干扰 (RNA interference ，RNAi) 。 从此， RNA 干扰成为热门领域， 相关科学论文及报道爆炸性增长。 RNAi 沉默机制主要体现在抗病毒、 基因调控、 染色质浓缩、 转座子沉默、 基因组重组等领域， 它主要用于高通量的基因功能研究、 基因敲除、 基因治疗及药物筛选探索等方面。 而沉默机制和应用方面的研究都离不开如何设计以及制作特异性的高效 RNA 干扰分子。1 小干扰 RNA (small inte
8、rference RNA, siRNA) 的设技术与应用 191第 2 期 荀恒杰， 等： RNA 干扰分子的制作计长 dsRNA 引入果蝇、 线虫等大部分生物中能够诱导 RNAi ， 但在哺乳动物细胞中却不行， 因为长片断的 dsRNA 在哺乳动物细胞中诱发强烈的抗病毒反应， 导致整体基因表达模式的改变和非特异的基因沉默反应。最新实验表明， 哺乳动物细胞中导入小分子 dsRNA 不会引发类似的抗病毒反应， 而且能够有效地切割特异的目标靶 RNA 导致基因沉默。siRNA 设计时应该遵循的原则 ： (1) 靶区应在靶基因cDNA 的启始密码子 (ATG) 下游和终止密码子之间，寻找含有 AA
9、(N19)TT 或者 NA (N21) ，或者 NAR (N17)YNN 的基序 (N 为任意碱基 ， R 为嘌呤， Y 为嘧啶 ) ，而且 N19不应该为重复的或者低复杂度的序列， 也不应该为核苷酸多态性位点。 (2) 序列中 G+C 的含量应不超过 60% ，也不低于 30%1 。 (3) 避免长度超过4 个的连续碱基，例如 AAAA 、 CCCC ， 这样会影响转录的效果， 同时突出端碱基也不应该为 C ，因为相应转录产生的 G 很容易被 RNase 切除。 (4) 避免在 3 UTR 和 5 UTR(untranslation region) 进行 siRNAs的设计， 因为这些地方有
10、丰富的蛋白结合区， 会影响 siRNAP 核酸酶复合物与 mRNA 的结合 ( 图 1) 。 (5)应在 mRNA 靶的 3 和 5 以及中部进行几种设计， 从而选择对 siRNA 介 导的降解更为敏感的 mRNA 序列2。(6) 设计阴性对照，作为阴性对照的 siRNA 应与最适siRNA 上具有相同的碱基组成和长度， 但是与目的序列的 mRNA 和该生物的其他基因 mRNA 没有同源性。 在设计阴性对照的 siRNA 时，最适 siRNA 序列被打乱，并且至少 45 个碱基不配对。 (7) 要检查所选序列是否与其他基因具有同源性， 将所选序列和相应的基因组数据库进行比较， 避免碱基配对的数
11、量在 15 对以上，以排除那些与其他编码序列或者与 EST 同源的序列， 使用 BLAST 或者 FASTA 搜索工具就可以做到。 当然在使用 siRNA 表达载体和siRNA 表达框架时， 还有其他一些因素要考虑。 现在也出现了一些设计软件， 例如 siRNA DNAdesigner 、 rational siRNA design template 、 siRNA tar-get finder 、 siRNA design 、 siRNA construct builder等等3。 设计之后的小分子 RNA ， 应该能够在生物体中被加工成含有 2123 碱基的双链 siRNA 或者4550
12、nt 的小发夹 RNA(short hairpin RNA, shRNA) 。2 制备 siRNA 的方法2.1 化学合成 尽管化学合成是最贵的方法 ( 平均每个碱基 200 元左右 ) ， 但却是最方便的， Ambion 和Qiagen 公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成 siRNA 。 Qiagen 公司利用专利的 TOM-amidited技术， 使得每一步碱基耦联效率高达 99.5% 以上，经过去保护和脱盐， 纯度为 80%85% ， 如果选择阳离子交换 HPLC 纯化， 纯度超过 97% 。 该公司提供的 siRNA 是已经退火的， 在灭菌重悬缓冲液中，即可进行 RNA 转染，
13、非常方便。 Ambion 公司可以帮助合成两条互补的，末端补加 TT 或者 UU ，或者其他需要的 3 突出端的 RNA 单链， 同时还免费提供去保护和反向脱盐纯化、 PAGE 胶纯化等服务。 一对冻干的 RNA 连同退火 Buffer 、无 RNase水一起提供，方便实验的进行。由于化学合成价格比其他方法高， 特别是在哺乳动物中 siRNA 的效率不一， 为一个基因合成 3 4 对 siRNA ， 成本就更高了，所以 不适宜用于筛选 siRNA 。 比较常见的做法： 先用其他方法筛选出最有效的序列， 再进行化学合成。2.2 体外转录 通过体外转录的方法可以合成siRNA ， 是性价比较高、
14、能够较快地得到筛选 siRNA的好方法，目前已有 Ambion 公司的 Silencer 爏 iRNAConstruction 燢 it 和 NEB 的 HiScribe RNAi Transcrip-tion Kit 等。一般过程为：首先合成两段 29-mer 的DNA 作为模板 ( 如 Operon ，一个碱基 78 元 ) ，它包括 8 个与 T7 启动子引物 3 端匹配的碱基 ( 引导序列， leader sequence) 和 21 个设计的 siRNA 序列，将这两个模板和对应的 T7 启动子引物分别混合， 引物末端和 DNA 模板退火结合， 用 DNA 聚合酶Klenow 大片断
15、补平成为双链 DNA 模板，分别用 T7RNA 聚合酶进行体外转录， 将产物混合形成dsRNA ，新的 dsRNA 包含 5 端单链的引导序列和中间互补的 19 个碱基序列以及 3 端两个重复的 U(UU) ，通过 DNA 酶降解模板， 同时用单链专一的核酸酶消化 5 的引导序列，由于 RNase 不能切开 U碱基也不能切 dsRNA ， 所以得到的产物就是我们需要的 21-mer 的双链 siRNA ， 通过柱纯化， 去除引物、碱基、 盐和蛋白质等杂质， 得到的就是可以立即转化用的 siRNA 。 整个过程不超过 2 天，却可以得到 15 种产量很高的 siRNA ，足够做上百次转染图 1
16、siRNA 分子的设计192 生命科学 第 18 卷实验 ( 图 2) 。体外转录的 siRNA 的转染效率要比化学法合成的同序列的 siRNA 至少高 20 倍，估计原因是由于化学合成每一步的合成和纯化效率都不能达到100% ， 20 步反应后经过 HPLC 纯化后纯度才 97% 。MEGAscriptTMRNAi Kit 试剂盒可合成长 dsRNA ，主要适用于果蝇、 线虫等非哺乳动物。 它是用两端带有 T7 启动子序列的目的基因质粒载体或带有 T7 序列的引物扩增的 PCR 产物作为模板 ( 如果 200 nt 以上，也可以选用一个叫 Lign Scribe Kit ，可以将 T7Pro
17、moter 序列直接连接到 DNA 片断的两端 ) ，将模板和试剂盒提供的 dNTP 、 酶等混合，根据模板的长短进行体外转录反应，每次反应可以合成 50100?g ，甚至更多的 dsRNA(800 nt 以上的需要先加热变性并退火形成双链 ) ，产量是常规的 1050 倍，整个试剂盒总产量可达 2 mg(20 次反应， 每次 100?g) 。合成的产物经过 DNase I 消化去除 DNA 模板，特殊的单链 RNase 除去单链的 RNA ， 柱纯化就得到纯的 dsRNA ， 即可用于 RNAi 实验。 体外转录法适用于筛选和制备多种 siRNAs 。2.3 长片断 dsRNA 经 RNas
18、e III 类降解 这种方法不需要设计多个 siRNA 序列， 以便找到一个最适的siRNA ， 而是制备一份混合有各种 siRNAs 的“混合鸡尾酒” ( 即 siRNAs 混合库 ) 。 RNase III 可以参与各种来源的 dsRNA 的降解，一个酶单位在 37 1h 的条件下可将 1mg dsRNA 降解到 30 bp 以下，主要为 1215 bp siRNA 混合物 ，突出端带有 23 个碱基，主链的 5 为磷酸， 3 为羟基， 产物突出端相似于体内 Dicer 降解产物， 通过改变酶切条件可以提高降解产物长度达 21 bp ， 不过有实验结果显示 1215 bp 的 siRNAs
19、 具有同样的抑制效果。 它的过程是 ： 选择通常是 2001 000 碱基的 DNA 为模板， 用体外转录的方法制备长片断 dsRNA ，然后用 RNase III 在体外消化，得到众多的、针对同一靶基因多位点的 siRNA 混合库4。在除掉没有被消化的 dsRNA 后，这个 siRNA 混合物就可以直接转染细胞， 方法和单一的 siRNA 转染一样。由于 siRNA混合物中有多种不同的 siRNA ， 能够保证目的基因被有效地抑制， 但是需要的浓度较高。 dsRNA 消化法的主要优点在于省略检测和筛选有效 siRNA 序列的步骤，为研究人员节省时间和费用 ( 因为 RNaseIII 比 Di
20、cer 要便宜 ) ，它简单粗放、快速、性价比高5; 缺点就是有可能引发细胞毒素的增加和同源或者密切相关的基因的非特异基因沉默， 但现在多数研究显示这种情况通常不会造成影响。 Ambion 公司曾用 Silencer siRNA Cocktail Kit(RNase III) 试剂盒成功关闭 c-fos 、 GAPDH 、 La 等几个基因。这种方法不适用于长时间的或者对一个特定的 siRNA 的研究，例如基因治疗6。2.4 siRNA 表达载体 有多个报道说，通过载体表达的 siRNA 同样可以抑制特定基因的表达， 载体大都是用 RNA 聚合酶 III(Pol III) 启动子启动编码shR
21、NA 的序列。 它需要将编码一小段对应目的基因特异序列的、 RNA 能形成发夹结构的 DNA 序列插入载体中启动子的下游， 转入哺乳动物细胞， 载体就能表达出发夹结构的 RNA ，这种 RNA 很快在细胞中被加工成为 siRNA 。以 pSilencer siRNA 表达载体系列为例，它是由一种 Pol III 启动子、氨苄抗性基因和大肠杆菌复制子组成。 载体 pSilenceT 1.0-U6 是采用小鼠 U6 Pol III 启动子，经过了 Apa I 和Eco R I 酶切线性化和纯化，只需要合成一对带有 4个碱基的突出端 ( 为对应 Apa I 和 Eco R I 酶切位点 )和位于中部
22、由 8 个碱基组成的茎环区的 55-mer 的寡核苷酸， 一起退火、快速连接就 可以转化了7( 图3) 。 pSilencer2.0-U6 、 2.1-U6 、 3.1 -H1 或者 3.0-H1则是用 H1 RNA 启动子 (RNase P 的一个组成部分 ) ，用 Bam H I 和 Hin d III 线性化和纯化的， 方便定向克隆。 而 pSilencer adeno 1.0-CMV 和 pSilencer 4.1-CMV( 巨细胞病毒启动子 ) 载体是以 SV40 polyA ter-minator 为终止信号，分别具有 Xho I 、 Spe I 和Bam H I 、 Hin d
23、III 限制位点8( 图 4) 。另外还有图 2 用 Silencer siRNA Construction K it 进行体外转录图 3 pSilencer 1.0-U6 载体的插入部分设计注： 为定向克隆入载体，含有合适的几个 3 突出端，环状部分的序列和长度可以按照需要有所变化193第 2 期 荀恒杰， 等： RNA 干扰分子的制作Stratagene 的长效抑制基因表达新产品 Gene-Eraser shRNA 表达载体可用，两个互补的寡核苷酸需带有 5 Bam H I 和 3 Xba I 接头，互补的寡核苷酸长度为 29 个碱基，在 Bam H I 位点下游紧连一个 C使插入片段和启
24、动子有一定空间间隔以确保转录的发生 ( 图 5) 。shRNA 目的序列的第一个碱基必须是 G 以确保RNA 聚合酶转录，如果选择的目的序列不以 G 开头， 必须在紧连正义链的上游加一个 G 。 shRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。 不同大小核苷酸序列的茎环都被成功的运用过， 其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有shRNA 插入片段的克隆， 如图 5 所示的茎环序列就包含一个 Hin d III 酶切位点。 5TTCG3 通常作为茎环序列。 而在比较了众多不同长度和序列的茎环，5TCAAGAG3 序列最为有效。 之所以采用 RNA PolIII 启动子是由于它可以
25、在哺乳动物细胞中表达更多的小分子 RNA ， 并且总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成 RNA 而且通过添加一串 (36个 )U 来终止转录的。当这种带有 Pol III 启动子和shRNA 编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时， 这种能表达 siRNA 的质粒确实能够抑制包括相关的外源基因和内源基因在内的表达9。 siRNA 表达载体的优点在于： 带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久， 而且可以复制扩增，与化学合成相比，这就能够显著降低制备 siRNA 的成本。腺病毒、 逆转录病毒及慢病毒等病毒载体也可用于 siRNA 表达，其优势在于可以直接高效率感
26、染细胞进行基因沉默的研究， 避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便， 而且转染效果更加稳定。 它适用于已知一个有效的 siRNA序列， 需要维持较长时间的基因沉默， 不适用于筛选 siRNA 序列10。2.5 siRNA 表达框架 siRNA 表达框架 (siRNA ex-pression cassette, SEC) 是一种由 PCR 得到的产物，包括一个 RNA Pol III 启动子，一段发夹结构 ( 以 5-UUUGUGUAG-3 为环部 ) 的 shRNA 模板， 一个 RNAPol III 终止序列，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 Silencer express
27、 kits 能够以含有 Eco R I 和 Hin d III 限制性酶切位点的引物， 通过重叠延伸的 PCR 方法， 非常简单方便地制得带有人源 H1 或者 U6( 人源或鼠源 ) 启动子的 SEC( 图 6) 。与 siRNA 表达载体不同的是， SEC 不需要载体克隆、测序、 抗生素筛选等颇为费时的步骤， 而且转染效率高， 可以直接由 PCR 在一天中得到。 因此 SEC 成为筛选 siRNA 的最有效工具， 甚至可以用来筛选特定的细胞株中启动子和 siRNA 的最适搭配，例如 Silencer express kit 对于不同的 siRNA 模板， 采用三种不同的启动子与之搭配11。
28、如果在PCR 两端添加酶切位点， 那么通过 SEC 筛选出的最有效的 siRNA 可以直接克隆到载体中构建 siRNA 表达载体，这样构建好的载体可以用于稳定表达siRNA 和长效抑制的研究。由于没有进行序列测定， PCR 和 DNA 合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想，所以必须用高保真的 Taq 酶，另外 siRNA 中也不应该连续出现三个以上的 T 或者A ，否则容易被 Pol III 当作终止信号，提前停止转录。 siRNA 表达框架可以用于筛选 siRNA 序列以及筛选在不同细胞株中最佳启动子， 但不能够直接用于长期抑制研究， 如果用于长期研究， 必须克隆到载体中， 以保存和
29、扩增 siRNA12。尽管真正在临床上运用 RNA 干扰机制对疾病进行治疗还有诸如靶向性、 用药量等需要解决的问题， 但是随着研究的深入，相信相关问题将逐步得到克服。 我们可以根据实验条件、 对象、 目的等，选择合适的 RNA 干扰分子制作方法， 通过特异性地高效表达 RNA 干扰分子， 为我们的实验和应用打下良好的基础。参 考 文 献1 Semizarov D, Frost L, Sarthy A, et al . Specificity of shortinterfering RNA determined through gene expressionsignatures. Proc Na
30、tl Acad Sci USA , 2003, 100 (11): 63476352图 4 pSilencerTMadeno 1.0-CMV 载体的插入部分设计注： 为定向克隆入载体， 含有合适的几个突出端， 环状部分的序列和长度可以按照需要有所变化图 5 GeneEraser shRNA 表达载体插入部分设计194 生命科学 第 18 卷2 Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al . Rational siRNA designfor RNA interference. Nat B iotechnol , 2004, 22 (3):3263303 Wang L,
31、 Mu F Y. A web-based design center for vector-based siRNA and siRNA cassette. Bioinformatics , 2004, 20 :181818204 Yang D, Buchholz F, Huang Z D, et al . Short RNA duplexesproduced by hydrolysis with Escherichia coli RNase IIImediate effective RNA interference in mammalian cells. ProcNatl Acad Sci U
32、SA , 2002, 99 (15): 994299475 Calegari F, Haubensak W, Yang D, et al . Tissue-specificRNA interference in postimplantation mouse embryos withendoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc NatlAcad Sci USA , 2002, 99 (22): 142361424406 Yang D, Goga A, Bishop J M. RNA interference (RNAi)with RN
33、ase III-prepared siRNAs. Methods Mol Biol , 2004,252 : 4714827 Li C W, Bowles D E, van Dyke T, et al . Adeno-associatedvirus vectors: potential applications for cancer gene therapy.Cancer Gene Ther , 2005, 12 (12): 9139258 Miyagishi M, Taira K. U6 promoter-driven siRNAs withfour uridine 3 overhangs
34、effectively suppress targeted geneexpression in mammalian cells. Nat Biotechnol , 2002, 20 (5):4975009 Harborth J, Elbashir S M, Vandenburgh K, et al . Sequence,chemical ， and structural variation of small interfering RNAsand short hairpin RNAs and the effect on mammalian genesilencing. Antisense Nu
35、cleic Acid Drug Dev , 2003, 13 (2):8310510 Barquinero J, Eixarch H, Perez-Melgosa M. Retroviralvectors: new applications for an old tool. Gene Ther , 2004 , 11(Suppl1): S3S911 Ill C R, Chiou H C. Gene therapy progress and prospects:recent progress in transgene and RNAi expression cassettes.Gene Ther , 2005, 12 (10): 79580212 Castanotto D, Li H, Rossi J J. Functional siRNA expressionfrom transfected PCR products. RNA , 2002, 8 (11):14541460图 6 Silencer express kits 制备 SECs 的过程
