1、 技术支持：010-58851919-616 订购：010-58851919-618 Email： 北京康为世纪生物科技有限公司 PurePlasmid Midi Kit 高纯度质粒中提试剂盒 Version 09242009 I 组分说明 Catalog no. CW0502 Number of preps. 50 Buffer P1 30 ml Buffer P2 30 ml Buffer N3 40 ml Buffer PB 30 ml Buffer PW 15 ml Buffer EB 10 ml RNase A 300 l Spin Column CL 50 Collection
2、Tube 50 Protocol 1 II 保存条件 该试剂盒室温干燥条件下（15-25）可保存一年，更长的保存时间可置于 2-8。若溶液产生沉淀，应在使用前置于 37下溶解沉淀。单独包装的 RNaseA 可以稳定保存一年，加入 RNaseA 后的 Buffer P1 置于 2-8保存，可以稳定保存半年。 III 产品简介 本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，通过新型离心吸附柱在高盐浓度下高效、专一结合溶液中的 DNA，提取率达 85%90%。本试剂盒提取的质粒纯度高，质量稳定，最大限度的去除杂质蛋白和细菌中其它有机化合物的污染，一次可处理5-15ml 菌液。所得质粒可用于各种常规操作，包括酶切、P
3、CR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。 IV 注意事项 1. BufferP1 在使用前先加入 RNaseA（将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入） ，混匀，置于 28保存。 2. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer PW 中加入无水乙醇。 3. 使用前请先检查 Buffer P2 和 Buffer N3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。 4. 注意不要直接接触 Buffer P2 和 Buffer N3，使用后应立即盖紧盖子。 5. 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为 12,00
4、0 rpm(13,400g )。 6. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。 技术支持：010-58851919-616 订购：010-58851919-618 Email： 北京康为世纪生物科技有限公司 V 操作步骤 1. 取5-15 ml过夜培养的菌液，加入离心管中， 12,000 rpm(13,400g ) 离心1分钟，尽量吸弃上清。 注意：质粒拷贝数较低时，可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。 2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入500 l Buffer P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。 注意：如果菌块未彻底混匀，
5、将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。 3. 向离心管中加入 500 l BufferP2，温和地上下颠倒混匀68次，使菌体充分裂解。此时菌液应变得清亮粘稠。所用时间不应超过5分钟，以免质粒受损伤。 注意：不要剧烈震荡，以免造成所提质粒中基因组DNA污染。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。 4. 向离心管中加入 700 l Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀68次，此时出现白色絮状沉淀。 注意：Buffer N3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。室温放置时间不宜超过5分钟，以免损伤质粒。 5. 12,000 rpm (13,400g )离心10分钟，吸取
6、上清，加入到已装入Collection Tube的Spin C olumn CL中， 注意不要吸出沉淀。 6. 室温放置1-2分钟，使质粒DNA与吸附柱充分结合。12,000 rpm (13,400g)离心1分钟，倒掉Collecti on Tube中的废液，将Spin Column CL 放回C ollection Tube中。 7. 向Spin Column CL加入500 l Buffer PB，12,000 rpm (13,400g )，离心1分钟 ， 倒掉Collection Tube中的废液，将SpinColumn CL重新放回Collection Tube中。 注意：如果宿主菌是
7、endA-宿主菌（DH5，TOP10 等），此步可省略。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21， HB101，JM101， ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。 8. 向Spin Column CL中加入700 l Buffer PW （请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm ( 13,400g )离心1分钟，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CL重新放回收Collection Tube中。 9. 向Spin Column CL中加入500 l Buffer PW （请先检查是否已加入无水乙醇
8、），12,000 rpm ( 13,400g )离心1分钟，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CL重新放回收Collection Tube中。 10. 12,000 rpm (13,400g) 离心 2分钟，倒掉废液。将Spin Column CL置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的Buffer PW。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的Buffer PW去除，Buffer PW中乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。 11. 将Spin Column CL置于一个新的离心管中， 向吸附膜的中间部位悬空滴加 100-300 l Buffer EB， 室温放置 2-5 分钟，12,000 rpm(13,400g )离心 2 分钟，将质粒溶液收集到离心管中。 -20保存质粒。 注意： 1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到Spin Column CL中，重复步骤 11。 Buffer EB在 65 70水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。 2）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到 此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100 l，体积过小影响回收效率。
