1、模拟移动床色谱分离技术 在生物质有效成分纯化中的应用,物理化学教学团队 高丽娟,辽宁科技大学应用化学专业新技术专题报告,1.基本概念,生物质：是植物通过光合作用生成的有机物，是地球上最广泛存在的物质，它包括所有动物、植物和微生物以及由这些有生命物质派生、排泄和代谢的许多有机质。,生物质有效成分或有效部位,生物质中具有某种特殊功能的一个成分或一组成分。 例如：绿色抗癌药物紫杉醇就是从紫杉树的皮和叶中提取分离出来的有效成分；治疗心血管疾病的银杏黄酮就是从银杏树叶中提取分离出来的有效部位；,2 纯化生物质有效成分或部位的必要性,生物质的有效成分和部位是生物体中含量甚微，但却有特殊功效的组分。当人们利
2、用它们的特殊功效时，不能将生物体中的其它大量无用甚至有害的组分也一同混用，所以必须纯化。,3 研究生物质有效成分或部位纯化技术的必要性,生物质有效成分和有效部位成品或中间体的工程化精细分离的难度比一般化工产品大得多。原因： 第一，因为产品在粗产物中浓度通常很低，需处理的物料往往是成分复杂的粘稠的多相体系，因此，无论在热力学特性，流变学特性以及流动、传热、传质等方面，生物体系与一般化工体系相比都要复杂得多。 第二，对生物制品要求高纯度、无色、结晶以及能长期保存等。 第三，生物制品多为活性组分，耐温性差，在深加工过程中多次分离、浓缩会造成收率低、步骤多、过程复杂等缺点。 综上所述有必要研究生物成品
3、或中间体的规模化精细分离技术。,4 模拟移动床色谱分离技术,在各种新型分离技术中，模拟移动床色谱技术因其既有实现高精度分离又有实现规模化的能力，成为生物成品或中间体的规模化精细分离的关键技术。,4.1色谱概念,色谱法是分离混合物，提纯物质以及结构同一性鉴定的有效方法之一。1903由俄国植物学家Tswett等创立。,Tswett让从绿叶中提取出来的色素石油醚溶液，通过一根填满碳酸钙的细长的玻璃柱，然后用纯净的石油醚加以冲洗，结果在玻璃柱内的植物绿叶色素就被分离成几个具有不同颜色的谱带，然后按谱带颜色对混合物进行鉴定分析。当时Tswett将这种分离方法命名为色谱法，分离出的谱带为色谱。,4.2 色
4、谱分类,色谱自从1903年诞生后逐步发展完善。 1935年，Adams和Holmes合成了离子交换剂并用于色谱分离，从而诞生了离子交换色谱。 1941年Martin和Synge设计了一个萃取容器，将乙酰化氨基酸从水相中萃取到有机相，使其离析出来。不久又用填充颗粒硅胶的色谱柱代替这种萃取器，奠定了溶液分配色谱的基础。 1944年Consden等人将纤维纸做成滤纸形式，利用毛细管作用使溶剂在滤纸上移动。由于混合物中各组分在两相中溶解度的差异使它们以不同速率穿过滤纸，从而得到分离。由此而创立纸色谱法。 1952年，Jomes和Martin在惰性载气表面涂布一层薄而均匀的有机化合物液膜，并以气体作冲洗
5、剂，从而产生了气-液色谱。 1953年，Janak根据某些固体物质能吸附气体而发展了气-固色谱法， 1959年，Porath和Flodin提出了大小排阻色谱法，其原理是基于柱内多孔填料对大小不同的分子具有选择渗透作用。 20世纪60年代早期，Giddings等将气-液色谱重要理论用于液相色谱，同时出现了高效能液相色谱填料，到60年代末，Kirkland等研制了高效液相色谱仪。使液相色谱的分离效率和速度大大提高。,4.3 现在的色谱法（层析法）,现在的色谱法是指这样的一种物理分离方法，它是根据不同物质在由两相构成的体系中具有不同的分配系数而分离。当两相作相对运动时，这些物质也随流动相一起运动，并
6、在两相间进行多次反复的分配，这样就使各组分达到完全分离。如图,4.4 色谱理论,在讨论色谱理论时，一般以柱色谱为例。 在色谱分离过程中，当流动相携带样品通过色谱的固定相时，样品分子与固定相分子之间发生相互作用，使样品分子在流动相和固定相之间进行分配。与固定相分子作用力越大的组分向前移动速度越慢，与固定相分子作用力越小的组分向前移动速度越快，经过一定的距离后，由于反复多次的分配使原本性质（沸点、极性等）差异很小的组分之间得到很好的分离。,4.5 高效液相色谱法,与低压液相色谱相比高效液相色谱的特点： 固定相的颗粒直径小且均匀，满足柱效高的要求； 系统压力大，固定相要有 一定的强度和刚度，防止在高
7、压下变形和压碎； 效率高，柱效高和速率快。,5 生产规模的色谱系统,色谱是一个建立在吸附、分配、离子交换、体积排阻等基础上的分离过程，它利用不同组分在相对运动、相互不溶的两相中的（其中相对静止的相称固定相，而另一个相对运动的相称为流动相）吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力或分子大小等性质的微小差别，经过连续多次在两相间的质量交换，使不同组分得到分离。 色谱分离过程的特点是分离效率高，无需加热和能耗低，对于那些用传统分离方法如蒸馏、萃取及重结晶等难以分离的物系以及热敏性物系，该方法具有明显的优越性。因此，在色谱技术发展过程中，不少化学、化工专家都致力于色谱技术的放大，使之用于制备和规模化生
8、产。尤其随着生物工程以及中医药现代化的迫切要求，在相关的领域都面临着大量的分离纯化任务，制备色谱作为一种快速高效的分离技术，已经引起世界各国的高度重视。在我国该技术已被列入“863”工程生物技术领域的攻关项目中。 为了适应精细化工、生物化工产品分离的需要，人们研制出多种生产规模的色谱系统。它们根据操作过程的特性可分为：批处理色谱(Batch Chromatography Process )和连续色谱（ Continuous Chromatography Process ）。,5.1批处理色谱的规模化（柱式固定床色谱分离）,批处理色谱即间歇制备色谱，是在分析型色谱的基础上，通过放大色谱柱、增大进
9、样量来提高分离能力，进行工业大规模生产而建立起来的一种用大直径柱分离物质以得到大量纯组分的分离技术。图2.2就是这种分离过程的模型。,固定床是床层及进出样口不动,分离设备简单，操作方便， 过程的最优化控制容易 分离效率高， 无需加热和能耗低， 适合热敏性物系。,床层和吸附剂的利用率低， 溶剂消耗大， 产品的浓度低，增加了回收投入； 操作不连续，原料的处理量较小。,固定床制备色谱的优缺点,缺点,优点,5.2连续色谱,批处理色谱的不足引起了人们对连续色谱的开发和研究。 连续制备色谱根据流动相和固定相的相对运动主要可分为连续逆流色谱和连续错流色谱两大类。连续逆流色谱的研究最早是从移动床系统开始的。,
10、5.2.1移动床系统,移动床是因床层在连续移动而得名；逆流是固定相和流动相作逆向运动而得名。 在移动床系统中，流动相在泵的作用下由下往上流动，而填料依靠重力作用向下移动，柱的中部连续进料，分离结果弱吸附组分从塔顶流出，而强吸附组分在固定相作用下从塔底流出。,双组分移动床吸附图解法,移动床的优缺点,优点是连续色谱由于使用了连续进样，使填料得到了充分利用，降低了溶剂消耗量，提高了产量，还可实现自动化操作。 缺点是用填料本身的移动来实现逆流操作，吸附剂的磨损是很严重的，填料的不均匀性以及大的空隙率使传质效率也大大降低，而且由于密封的问题压力不能太高，流速不能高，从而限制了移动床的发展，这种概念仅仅在
11、石油工业中有所应用。,5.2.2移动柱系统,移动柱系统是固定相装在色谱柱中，相对柱管的位置不动，进出口位置也不变，但把整根柱切成很短的小柱，整个小柱在移动。 移动柱系统通过柱的移动来代替填料的直接移动，克服了真正逆流移动床色谱系统的不足，但其本身有不可逾越的缺陷，即在较高的系统操作压力下，在移动的色谱柱与静止的进、出口之间很难实现可靠的机械密封。 正是在这种情况下，模拟移动床应运而生。,5.2.3模拟移动床系统,在模拟移动床系统中，整个吸附床层由若干个互相连接的色谱柱组成。 固定相在小柱中不动，小柱也不动，但进出样口沿流动相的流动方向有次序的移动，从而有效的模拟了固定相与流动相的相对逆流流动。
12、,6 模拟移动床色谱系统,6.1 SMB带结构 6.2 SMB的工作原理,6.1 SMB带结构,SMB是柱的串联系统，其流路特点是流体的注入点和流出点都是多点，即多进，多出，一般来说是两进（样品进入和流动相进入），两出（目标物流出和残余液流出）。 SMB流路这种特点造成SMB的区带结构，因为流路中进口与出口两侧流速不同，在进样口两侧组分浓度也不同。若将流速相同的区域看成一个带，SMB流路系统被进出口结点分成了几个带，因此SMB是一个多带的流路。 通常的SMB为四带结构。按文献习惯，一般地，将进样口后面的出口称为萃取液出口，而将进样口前方的出口称为残余液出口。,四带系统,模拟移动床系统根据其结构
13、主要分为三带、四带和多带系统。 模拟移动床中两个输入口和两个输出口将整个系统分割成几个流速不同的带， 洗脱液D入口与萃取液E出口之间的区域称为洗脱带I； 样品溶液F入口与萃取液E出口之间的区域称为一精带II（第一精馏带）； 样品溶液F入口与残余液R出口之间的区域称为吸附带III； 在残余液R出口与洗脱液D入口之间的区域称为二精带IV（第二精馏带），这样的模拟移动床系统称为四带系统。,三带系统,如果流动相不循环，IV带可以省略，这样的模拟移动床系统称为三带系统。 模拟移动床主要是通过PLC控制各接点阀来实现进样点（F）、进流动相点（D）、出产品点（E）和出杂质点（R）位置的变换，从而模拟固定相的
14、逆流，提高固定相和流动相的利用率，同时实现了色谱分离的连续化。,6.2 模拟移动床的工作原理,三带模拟移动床运行方式,t=t0,t=t0+ts/2,t=t0+3ts/2,t=t0+ts,四带模拟移动床,四带模拟移动床各带的作用,I带是强吸附组分A的解吸带，新鲜的流动相D，从该带底部进入，与固定相逆流接触，将吸附的组分A全部冲洗出来，从而在该带的顶部得到萃取液E（2+D），同时一部分满足分离条件的产品回流进入II带。 II带是组分A的精制带。该带中吸附有弱吸附组分B和强吸附组分A的固定相与I带流上来的仅含有A+D的流动相接触，两组分在流动相和固定相中再次分配。由于固定相对组分A的吸附能力强，固定
15、相中被吸附的组分B逐步被后来的A+D溶液中的组分A所置换，经过多次反复的吸附、置换、解吸，组分B渐渐减少直至全部置换出来。随着两相的逆流流动，向上流动的液体成为含组分B浓度高的溶液，而吸附组分A较多的固定相在下一个切换进入解吸带I。,带是组分A的吸附带，该带中的固定相将从该带低部进入的进样液F和从II带中流上来的溶剂中的组分A吸附， 从该带的顶部流出富含组分B的残余液R。 带是组分B的精制带和流动相的部分解吸回收带。从带进入的仅含有洗脱剂D的固定相进入IV带与III中过来的含B+D的溶液接触，组分B被吸附。吸附组分B的固定相在下一个切换进入III带，干净的洗脱液从带顶部流出，进入带，形成连续逆
16、流循环操作 。,三四带SMBC比较,三带SMBC中由于没有第带，即二精带，取消了溶剂的循环，从而各带的流速相对比较独立，无需循环泵，管路也相对简单。 因此，与四带相比，三带的优点是设备简单，一次投资少，容易操作，主要缺点是溶剂本身没有循环，增加了溶剂消耗，同时产品的浓度也较低。但如果采用适当的措施，仍可以达到降低溶剂消耗的目的。我们设计的模拟移动床系统是三带模拟移动床色谱系统。,7 模拟移动床色谱技术的应用领域,在石油化工领域的应用在食品工业中的应用在制药领域的应用 化工中的其他应用,7.1 使用模拟移动床色谱时应考虑的因素,色谱柱的选择：1. 柱尺寸, 2. 填料类型, 3. 填料尺寸, 4
17、. 色谱柱的装填, 5. 对称性， 流动相的选择：流动相的种类及比例 模拟移动床系统操作参数的确定与调节 1. 操作参数的初步选定, 2. 流速与时间的调节 , 3. 各带柱数的配置,7.2 SMB应用实例,例1 在虎杖白藜芦醇的纯化中的应用1.1柱的制备 1.2样品检测 1.3参数选择 1.4检测结果,1.1 柱的制备,120cm无锈钢空柱，干法填充20-25um的反相ODS填料，共四根。 柱的分离能力测试检测波长 308nm；UV检测器；流动相：V(甲醇):V(水)=1：1；流速1.5mL/min；室温。,柱的对称性测试,4 1 20cm模拟移动床,1.2 HPLC检测条件,检测波长 30
18、8nm； UV检测器； 流动相：V(甲醇):V(水)=1：1； 4.6100mmODS柱； 流速 0.8mL/min；室温。,1.3 SMB参数选择:,1.4 SMB分离结果,例2 紫杉醇纯化中的应用,紫杉醇是一种抗癌新药，可用于治疗子宫癌、卵巢癌、肺癌、肝癌等。据FDA报道，该药物治疗了2000余例晚期卵巢癌的患者，平均有效期为6个月。紫杉醇在植物中的含量很低(0.02% )，而且其水溶性差，分离困难。生产紫杉醇的方法很多，有合成法、半合成法、细胞培养法、树皮提取法、树叶提取法。其中合成与半合成法经济效益不太高，而且全合成法分离较困难；细胞培养技术的成本太高。利用树皮提取方法不能再生，对资源
19、破坏严重，而且国内有些单位采用甲醇、氯仿等有毒溶剂，对环境造成污染。也有少部分单位从树叶中提取，但也都采用氯仿和甲醇作溶剂不利于进行规模化生产。,本中心采用东北红豆杉中可再生部分树叶为原料，利用无毒、无污染的乙醇作为提取溶剂，研究了紫杉醇的提取过程，得到了高纯度的紫杉醇。,例3 银杏黄酮及内酯B的模拟移动床纯化,银杏内酯B(缩写为 GB)是迄今发现的最强的血小板活化因子拮抗剂，可在临床上用于治疗血栓、急性胰腺炎和心血管疾病，还可用于转移性癌症的治疗。药效优于总内酯，价格也远远高于总内酯。据报道，国际市场价格为20万美元/ 公斤。银杏内酯B由于在银杏浸膏粉中只含1%2%，且与银杏内酯A等结构相近
20、，因此分离极为困难。银杏内酯B的分离属于精细分离，市场需求一定的数量。因此，必须有规模化的精细分离技术与之适应。,中心报道了纯化银杏内酯B的一种方法萃取、模拟移动床色谱和重结晶相结合的提纯方法，其核心技术是模拟移动床色谱分离技术。,例4 在替考拉宁分离中的应用,例5 人参皂苷Rb1的模拟移动床分离,例6 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的模拟移动床分离,辽宁科技大学的模拟移动床设备类型,根据构造机理不同分三带、四代 根据运行机理不同分回流和不回流（A型和B型） 根据含有的总柱数分4柱及8柱 根据柱的规格分1 10cm ，1 20cm， 10 10cm， 5 10cm,8 5 10cm模拟移动床,8 10 10cm模拟移动床,4 1 10cm模拟移动床,8 5 10cm模拟移动床(轴向压缩柱),模拟移动床获得的产品,卡波前列腺甲酯 （PG05） 紫杉醇 替考拉宁 银杏黄酮 银杏总内酯 银杏内酯B 茶多酚中EGCG 人参皂甙Re 甘草甙 白藜芦醇 -,参考资料,“卡波前列腺甲酯的模拟移动床色谱分离方法”（专利号 00110348.2） “用模拟移动床色谱分离提纯替考拉宁的方法” （专利号为02132707.6） “模拟移动床色谱分离提纯银杏内酯B的方法”（专利号为200310104958.7),发明专利,
